Modifica di vettori di espressione di Baculovirus per produrre secreti proteine vegetali nelle cellule di insetto
Summary
Qui, presentiamo i protocolli per l’utilizzazione del insetto cella e baculovirus proteina espressione sistema per produrre grandi quantità di proteine vegetali secernuta per cristallizzazione della proteina. Un vettore di espressione di baculovirus è stato modificato con GP67 o insetto hemolin peptide di segnale per espressione di secrezione della proteina vegetale in cellule di insetto.
Abstract
È stata una sfida per gli scienziati di esprimere proteine eucariotiche secretive ricombinanti per studi strutturali e biochimiche. Il sistema di espressione di baculovirus-mediata delle cellule di insetto è uno dei sistemi utilizzati per esprimere proteine secretorie eucariotiche ricombinante con alcune modificazioni post-traduzionali. Le proteine secretorie devono essere instradati attraverso le vie secretive per glicosilazione della proteina, la formazione di legami disolfuro e altre modificazioni post-traduzionali. Per migliorare l’espressione delle cellule dell’insetto esistente di proteine secretorie vegetali, un vettore di espressione di baculovirus viene modificato con l’aggiunta di sia un GP67 o una sequenza del peptide segnale hemolin tra il promotore e il multiplo-clonazione siti. Questo sistema di nuova concezione modificate vettoriale prodotto con successo una resa elevata di proteine recettori solubili ricombinante pianta secreta di Arabidopsis thaliana. Due delle proteine espresse pianta, domini extracellulari dei recettori di membrana plasmatica di Arabidopsis TDR e PRK3, sono state cristallizzate per studi cristallografici dei raggi x. Il sistema vector modificate è un strumento migliorato che potenzialmente può essere utilizzato per l’espressione di proteine ricombinanti secretive nel Regno animale pure.
Introduction
È indispensabile per un laboratorio di ricerca essere in grado di produrre grandi quantità di proteine ricombinanti omogenei per le caratterizzazioni biochimiche e biofisiche, soprattutto per studi cristallografici dei raggi x. Ci sono molti sistemi di espressione eterologa affermati quali Escherichia coli, lieviti, cellule di insetto, cellule di mammifero, cellule vegetali, ecc tra loro, il sistema di espressione di baculovirus-mediata delle cellule di insetto è uno dei più comunemente utilizzato tecniche per produrre grandi quantità di proteine eucariotiche ricombinanti grandi strutturalmente piegate per proteina cristallizzazione1.
I vettori di espressione del sistema di espressione di baculovirus sono progettati per contenere una forte polyhedrin o promotore di P10 per produrre un rendimento elevato di proteine intracellulari ricombinanti2,3. Per rendere un baculovirus ricombinanti, il gene di interesse è clonato in un insetto vettore contenente il locus polyhedrin (polh) del genoma di multi-nucleopolyhedroviral Autographa californica . Il costrutto risultante è quindi sequenziato e verificato il suo telaio di lettura aperto corretta (ORF). Il costrutto corretto è quindi introdotto nella cellula ospite dell’insetto attraverso il processo di trasfezione. Il gene di interesse viene inserito nel genoma virale di ricombinazione omologa. Questo evento provoca la produzione del genoma virale ricombinante, che poi replicati per produrre ricombinante germogliato virus particelle1.
Le cellule di insetto che sono più comunemente utilizzate nel sistema di espressione sono Sf9 e alta cinque celle (Hi5). SF9 cellule sono un isolato clonale di Sf21, derivati dalle cellule ovariche pupale di Spodoptera frugiperda, e Hi5 cellule sono un isolato clonale derivato da parentale Trichoplusia ni ovarico delle cellule linea TN-3684,5. Co-transfezioni, amplificazione di virus e le analisi di placca sono condotto su cellule Sf9, mentre le cellule Hi5 in genere sono selezionate per produrre maggiori quantità di proteine ricombinanti6. Vale la pena notare che le cellule di Hi5 non sono adatte per la generazione e l’amplificazione della progenie di virus a causa della loro tendenza a produrre virus mutante. Tradizionalmente, una gamma di temperatura di 25-30 ° C è considerata di essere buono per la coltivazione di cellule di insetto. Tuttavia, è stato segnalato che il 27-28 ° C è la temperatura ottimale per l’insetto cella crescita e infezione7,8.
L’introduzione di una sequenza di segnale forte precede il gene è necessario per l’alta espressione di proteine secrete. La sequenza del segnale in modo efficiente guiderebbe la proteina ricombinante tradotta in reticolo endoplasmico per la secrezione della proteina e modificazioni post-traduzionali necessarie per il corretto ripiegamento e stabilizzazione3. Sequenze di peptide segnale, come il baculovirus avvolgono proteina GP64/67, honeybee melittin e altri, sono stati scelti per facilitare l’espressione di proteine ricombinanti secretive in baculovirus-mediata espressione sistemi3. L’introduzione del peptide segnale di GP67 ha dimostrato di migliorare la resa di espressione di una proteina ricombinante secreta, in confronto con il peptide di segnale intrinseco del gene bersaglio9. Hemolin è una proteina di emolinfa della falena gigante seta Hyalophora cecropia, indotta a seguito di infezione di batteri10. A causa del relativamente alto livello di espressione indotta, la sequenza del peptide di segnale del gene utilizzabile per mediare l’espressione di secrezione delle proteine ricombinanti nel sistema di cellule di insetto baculovirus.
Il a. thaliana Tracheary elemento di differenziazione inibitorio fattore recettore (TDR) e polline del ricevitore della chinasi 3 (PRK3) entrambi appartengono alla famiglia pianta Leucine-rich Repeat Kinase Receptor-like (LRR-RLK) di proteine11,12 . Al fine di studiare la struttura e la funzione di questa famiglia di recettori proteine vegetali, nonché per facilitare la caratterizzazione biochimica e strutturale di altre proteine vegetali secernuta, il sistema di espressione di baculovirus-insetto cella è stato modificato per migliorare la resa di qualità e produzione di proteina. I domini extracellulari di TDR e di PRK3 sono state espresse con successo utilizzando due vettori di espressione modificata nel sistema di espressione di baculovirus-insetto cellule. Entrambi i domini extracellulari delle proteine TDR e PRK3 sono stati cristallizzati. Questo articolo segnala l’espressione e purificazione di grandi quantità di proteine ricombinanti vegetali secrete con vettori di espressione di baculovirus modificate due incorporando un GP67 o una sequenza di segnale hemolin tra il promotore e clonazione più siti.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’eterogeneità nella dimensione e nella stabilità delle migliaia di proteine presenti nei sistemi biologici, è spesso empirico per una ricerca di laboratorio per decidere quale sistema di espressione eterologa deve essere scelto per l’espressione di una proteina specifica. Il sistema di espressione di e. coli è spesso la prima scelta per l’espressione della proteina a causa del breve ciclo di vita dei batteri, basso costi dei terreni di coltura e relativa facilità di scalare fino19. …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dai nuovi fondi avvio facoltà da North Carolina State University per Guozhou Xu.
Materials
| Incubator shaker | VWR | Model Excella E25 | 27 oC |
| Incubator | VWR | Model 2005 | 27 oC |
| Centrifuge | BECKMAN | Model J-6 | with a swing bucket rotor |
| Herculase II Fusion DNA Polymerase | Agilent | 600677-51 | For PCR amplification of DNA |
| Thermal Cycler | BIO-RAD | Model C1000 Touch | For PCR amplification of DNA |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | Model I 24 | For growing baceria culture |
| Customer DNA synthesis | GENSCRIPT | ||
| BamHI (HF) | New England Biolabs | R3136S | Restriction Endonuclease |
| BglII | New England Biolabs | R0144S | Restriction Endonuclease |
| NotI (HF) | New England Biolabs | R3189S | Restriction Endonuclease |
| XhoI | New England Biolabs | R0146S | Restriction Endonuclease |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202T | DNA ligation |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | DNA purification from Agorase gel |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Plasmid DNA purification from bacteria culture |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | 15510-019 | For DNA gel electropherosis |
| MAX Efficiency DH5α competen cell | Invitrogen | 18-258-012 | For transformation of DNA ligation mixture |
| Lennox L LB Broth | Research Product International Corp. | L24066-5000.0 | For making bacteria culture |
| Ampicillin sodium salt | Thermo Fisher Scientific | 11593-019 | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Thermo Fisher Scientific | 15160-054 | Antibiotics |
| Tetracycline | Thermo Fisher Scientific | 64-75-5 | Antibiotics |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710-064 | Antibiotics |
| MAX Efficiency DH10Bac competent cells | Thermo Fisher Scientific | 10361-012 | For making bacmid DNA |
| S.O.C. Medium | Thermo Fisher Scientific | 15544-034 | For DNA transformation |
| CellFECTIN II Reagent | Thermo Fisher Scientific | 10362-101 | Insect cell transfection reagent |
| Bac-to-Bac Expression System | Thermo Fisher Scientific | 10359-016 | Baculovirus-insect cells expression kit |
| Bluo-gal | Thermo Fisher Scientific | 15519-028 | For isolation of recominant Bacmid DNA |
| IPTG | Thermo Fisher Scientific | 15529-019 | For isolation of recominant Bacmid DNA |
| pFastBac1 | Thermo Fisher Scientific | 10360014 | Baculorirus expression vector |
| Sf9 cells | Thermo Fisher Scientific | 11496015 | Sf9 monolayer cells |
| Hi5 cells | Thermo Fisher Scientific | B85502 | High Five insect cells |
| Grace’s insect medium, unsupplemented | Thermo Fisher Scientific | 11595030 | Sf9 cell transfection minimum medium |
| Grace’s insect medium, supplemented | Thermo Fisher Scientific | 11605102 | Sf9 monolayer cell culture complete medium |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher Scientific | 10902104 | Sf9 suspension cell culture medium without FBS |
| Express Five SFM | Thermo Fisher Scientific | 10486025 | Hi5 cell culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 ml (10,000 I.U./ml) |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | 100 ml |
| FBS Certified | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | 500 ml |
| 6-well plates | Thermo Fisher Scientific | 08-772-1B | Flat-bottom |
| 150 mm plates | Thermo Fisher Scientific | 353025 | 100/case |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 500 tubes/bag |
| 15 ml conical screw cap centrifuge tubes | USA Scientific | 1475-0511 | 25 tubes/bag |
| 50 ml conical screw cap centrifuge tubes | USA Scientific | 1500-1211 | 25 tubes/bag |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | NiNTA resin |
| pH-indicator strips | EMD Millipore Corporation | 1.09535.0001 | pH 0 – 14 |
References
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