JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie du développement

Immunohistochemische detectie van 5-Methylcytosine en 5-Hydroxymethylcytosine bij de ontwikkeling en Postmitotic muis Retina

Published: August 29, 2018
doi:
10.3791/58274
, , ,
1BioTime, Inc

Summary

Het doel van dit verslag is om te beschrijven van het protocol voor robuuste immunohistochemische detectie van epigenetische markers, 5-methylcytosine (5mC) en 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) bij de ontwikkeling en postmitotic muis netvlies.

Abstract

De epigenetica van retinale ontwikkeling is een goed bestudeerde onderzoeksterrein, die belooft te brengen van een nieuw niveau van inzicht in de mechanismen van een scala van menselijke netvlies degeneratieve ziekten en lokaliseren van nieuwe benaderingen van de behandeling. De nucleaire architectuur van muis netvlies is georganiseerd in twee verschillende patronen: conventionele en omgekeerd. Conventionele patroon is universeel, waar heterochromatin is gelokaliseerd aan de rand van de kern, terwijl actieve euchromatine in de nucleaire interieur woont. In tegenstelling, is omgekeerde nucleaire patroon uniek voor de volwassen staaf fotoreceptor celkernen waar heterochromatin lokaliseert aan de nucleaire centrum en euchromatine bevindt zich in de nucleaire perifirie. Methylation van DNA wordt voornamelijk waargenomen in chromocenters. Methylation van DNA is een dynamische covalente modificatie op de cytosine residuen (5-methylcytosine, 5mC) van apr-dinucleotides die zijn verrijkt in de gebieden van de promotor van vele genen. Methylation van DNA tijdens ontwikkeling deelnemen aan drie DNA-methyltransferases (DNMT1, DNMT3A en DNMT3B). Detecting 5mC met immunohistochemische technieken is zeer uitdagend, bij te dragen tot variabiliteit in resultaten, alle DNA-basen, met inbegrip van 5mC bewerkt basissen zijn verborgen in de double-stranded DNA-helix. Gedetailleerde afbakening van 5mC distributie tijdens de ontwikkeling is echter zeer informatief. Hier beschrijven we een reproduceerbare techniek voor robuuste immunohistochemische detectie van 5mC en een andere epigenetische DNA marker 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), die colocalizes met de “open”, transcriptionally actieve chromatine in het ontwikkelen en postmitotic muis netvlies.

Introduction

Epigenetische regulatie van de ontwikkeling en postmitotic homeostase van muis netvlies is een spannende gebied van onderzoek, waarin beloftes om een nieuwe inzicht in biologische mechanismen beheersen van retinogenesis en cel lot bepaling, cell type-specifieke metabole functie, alsmede cel pathologieën, celdood en regeneratie1,2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. chromatine ondergaat dynamische veranderingen in de ontwikkeling, evenals in reactie op variabele externe signalen of het benadrukken, metabole of cel dood stimuli6,14,15, 16 , 17 , 18. in muis kernen, chromatine is onderverdeeld in actieve euchromatine en inactieve heterochromatin6,19,20. In interfase kern, euchromatine bevindt zich in de binnenste regio van de kern overwegende dat heterochromatin de nucleaire perifirie en nucleolus lijnen. Dit patroon heet conventionele en is zeer geconserveerd in eukaryoten. In tegenstelling, hebben rod kernen in nachtdieren zoals muis en rat omgekeerde patroon waar de kern wordt ingenomen door de heterochromatin in het centrum omringd door euchromatine vormen de ultraperifere shell6,18, 20. Bij de geboorte hebben rod kernen conventionele nucleaire architectuur. Inversie van rod kernen optreedt tijdens de ontwikkeling door de verbouwing van het conventionele nucleaire platform. Tijdens dit proces, perifere heterochromatin scheidt van de nucleaire perifirie en chromocenters smelten samen tot vorm een enkele chromocenter in het centrum van de kern6,18.

Genomic DNA methylering neemt deel aan de beheersing van lokale chromatine conformatie21. Methylation van DNA optreedt bij de positie 5′ van cytosine residuen van apr-dinucleotides die zijn verrijkt in de regio van de promotor van veel genen in muis genoom22,23,24,25,26 evenals in intergenic en intron regio’s, waaraan de regelgevende elementen27. Methylation van CpG eilanden in proximale initiatiefnemers21,24 en CpG-sequenties in gen versterkers27,28 is belangrijk bij het reguleren van de dynamische toestand van bivalente chromatine, met veel Developmental genen/transcriptie factoren spelen belangrijke rol in de ontwikkeling, kanker en veroudering29,30,31,32,33,34 . Methylation van DNA tijdens muis ontwikkeling35deelnemen aan drie DNA methyltransferases (DNMTs). Alle drie DNMTs worden uitgedrukt tijdens muis retinale ontwikkeling36 en netvlies-specifieke veranderingen in Dnmt genen effect retinale ontwikkeling2,7. Hydroxymethylcytosine (5hmC) is de oxidatieve product van 5-methylcytosine (5mC) demethylatie. De drie tien-elf translocatie (TET) enzymen deelnemen aan 5mC demethylatie37,38,39. Hydroxymethyl-C wijziging is verrijkt met initiatiefnemers, gene organen en intergenic genomic opeenvolgingen binnen gene rijk en actief getranscribeerde regio’s27,40.

Er is een verscheidenheid van beschreven methoden voor het bepalen van de veranderende patronen van de methylation van DNA in cellen41,42,43,44,45,46, sommige van hen schakelen kwantificeren van mondiale veranderingen van methylation van DNA terwijl anderen zich te concentreren op de precieze veranderingen in CpG-rijke regio’s binnen de initiatiefnemers en versterkers. Methoden voor de opsporing en kwantificering van 5hmC werden ook gemeld47, met inbegrip van immunohistochemistry13. Immunohistochemische technieken, waarmee sprake is van een robuuste monitoring van 5mC en 5hmC veranderingen in de kernen van de ontwikkeling en postmitotic cellen, zijn zeer informatief voor uitgezet chromatine dynamiek in situ in reactie op externe of interne veranderingen invloed op de cellen4,13,48,49. Deze aanpak is echter gevoelig voor onderschatting van methylation van DNA en hydroxymethylation veranderingen als gevolg van technische problemen, opsporen van cytosine wijzigingen in histologische preparaten is gekoppeld. Dit is omdat de apolaire DNA bases, waaronder 5mC en 5hmC gemodificeerde cytosine, zijn verborgen in het midden van de double-stranded DNA helix50, en vereisen ontmaskering. Dit is vooral een uitdaging in bevroren histologische preparaten die snel informatieve organisatie van het oorspronkelijke weefsel verliezen kunnen wanneer harde behandeling wordt toegepast.

Het netvlies muis is een uitstekend model te ontleden de bijdrage van methylation van DNA tot neurale ontwikkeling en postmitotic homeostase. Er zijn slechts 6 soorten neuronen (rod en kegel researchdieren, amacrine, bipolaire, horizontale en ganglion cellen), één gliale celtype (Muller glia) en één neuroepithelial cell type (retinale pigment epitheel)51. Netvlies celtypes werden gemeld te hebben verschillende patronen van DNA methylering18,19, die onlangs is onderzocht op single-base resolutie1,5,9,12. Onlangs meldden we immunohistochemistry toepassing uitgezet 5mC patroon van spreiding in de kernen van netvlies cellen en veranderingen in de kernen van volwassen muis netvlies, waar alle drie DNA methyltransferases zijn verwijderd door het voorwaardelijke targeting 7. ten opzichte van een aantal verslagen, waar de aanwezigheid van methylation van DNA in netvlies cellen kan worden gezien alleen als een positief of negatief signaal in de hypermethylated cellen ondergaan apoptosis, onze aanpak ingeschakeld detecting specifieke chromatine regeling binnen de retinale celkernen, die we verscheidene groepen gerapporteerd en besproken eerder5,6,7,18,19,36 , 52. hier, beschrijven we de immunohistochemische (IHC) techniek voor het opsporen van 5mC en 5hmC in bevroren paraformaldehyde-vaste histologische secties in details evenals tonen de gegevens, die we konden reproduceren van onze oorspronkelijke verslag7 .

Protocol

Alle procedures met muizen werden uitgevoerd volgens protocollen door de Children’s Hospital Oakland Research Institute dierlijke zorg en gebruik Comité goedgekeurde en vastgehouden aan de Association for Research in visie en oogheelkunde (ARVO) instructie voor het gebruik van dieren in Oogheelkunde en vision onderzoek. 1. de weefsels immunokleuring voorbereiding Euthanaseren C57 BL/6J muizen op embryonale dag (E) 16, postnatale (P) 0, P15 en P90 door kooldioxide (CO2) gevolgd door onthoofding (E16 en P0 muizen). Onmiddellijk enucleate muis ogen doorboord met 29G 1/2 naald aan de dorsale zijde van het oog. Incubeer gedurende 5 minuten (min) in 1 mL 4% paraformaldehyde (PFA) in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (1 x PBS) pH 8,0 bij kamertemperatuur. Om oog cups van P0, P15 en P90, ontleden uit hoornvlies en lens met fijne ophthalmic schaar terwijl ogen in de 4% PFA.Opmerking: Sla deze stap voor E16 ogen als de ogen zijn te klein. De eye cups (P0, P15 en P90) en de hele ogen (E16) vast te stellen in 4% PFA gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Daarna wassen de eye cups en de hele ogen tweemaal in 1 mL 1 x PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Cryoprotect het oog kopjes en hele ogen in 1xPBS, pH 8,0 met 10 gewichtspercenten sacharose gedurende 1 uur. Houd 20 gewichtspercenten sacharose in 1 x PBS voor 1 uur en dan verzadigd in 30% sacharose in 1 x PBS’s nachts bij 4 ° C. De volgende dag, de oog-bekers en de hele ogen insluiten in optimale scherpe temperatuur compound (OCT), (500 µL) in cryomolds, module-freeze in een bad van droogijs/ethanol en opslaan bij-80 ° C. De mallen met ingesloten eye cups en hele ogen verwijderen-80 ° C en laat equilibreer tot-20 ° C gedurende 1 uur voor cryosectioning. Gesneden retinale kruissecties (12 µm dik) parallel aan de as van de temporonasal door het hoofd van de oogzenuw met behulp van een cryostaat bij-20 ° C. Monteren van retinale secties op Microscoop dia’s53 en winkel bij-80 ° C. 2. immunokleuring met 5-mC en 5-hmC antilichamen Omcirkelen het netvlies secties gemonteerd op dia’s met een hydrofobe barrière-pen. De hydrofobe barrière pen verlaagt het volume van antilichaam nodig om vlek van het weefsel. Wassen van de retinale secties eenmaal met 200 µL van 1 x PBS gedurende 10 minuten. Het netvlies secties met 200 µL van 0,1% permeabilize Triton X-100 in 1 x PBS (PBS-T) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Denatureren retinale secties voor 30 min met 200 µL van vers gemaakte 2 door N zoutzuur (HCl) in 1 x PBS in een 37 ° C incubator.Opmerking: Voorzichtig wordt getitreerd HCl behandeling is nodig om het optimaliseren van het signaal van de 5mC. Omvat altijd biologische replicatieonderzoeken (3-4) terwijl het optimaliseren van 5mC signaal54.Opmerking: We deden antigeen ophalen op 4 tijd punten (15 min, 30 min, 1 h en 2 h) en gevonden 30 min incubatie is optimaal voor 5mC signaal. Langere incubatie met HCl degradeert de structuur van de kernen leidt tot onvermogen om te lokaliseren 5mC signaal naar de celkern. Na denaturatie, retinale secties te neutraliseren door toevoeging van 100 µL van 0,1 M Tris-HCl (pH 8.3) op het netvlies secties gedurende 10 minuten. Incubeer de secties in 500 µL van het blokkeren van de oplossing (5% preimmune normale geit serum in 0,1% Triton X-100 in 1 x PBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een kamer vochtigheid. Na het blokkeren, het toevoegen van anti-5mC; anti-5hmC antilichamen verdund 1:500 oplossing voor de retinale secties te blokkeren. Incubeer retinal secties bij 4 ° C in de kamer vochtigheid overnacht. De volgende dag wassen, retinale secties 3 keer (10-15 min telkens) met 0,1% PBS-T en vervolgens uit te broeden in het blokkeren van de oplossing met de bijbehorende secundaire antilichamen (geit anti-konijn en geit-antimuis IgG, verdund; 1:1000), met DAPI (4′, 6 – diamidino-2-phenylindole) oplossing (1 µg/mL) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur in het blokkeren van de oplossing.Opmerking: Vermijd drogen van secties tijdens alle stadia van de immunodetection. Wassen van de dia’s drie keer met 1 mL 0,1% PBS-T. Na de laatste wash, mount de secties met waterige montage medium onder een dekglaasje aan en verzegel met kleurloze nagellak. 3. confocal Immunohistochemistry Oriënteren in de secties om de retinale pigment epitheel kant van de cup van de optiek altijd geconfronteerd met een manier (bijvoorbeeld omhoog) voor consistentie. Uitvoeren van Fotolader van immunostained retinale secties op 63 X (vergroting × van een objectief) met 2 X of 3 X zoom. Meerdere optische secties van elke geselecteerde afbeelding genereren (z-stapels) in alle 3 kanalen (rood, groen en blauw, RGB) met behulp van 0,35 µm stap.Opmerking: De laatste vergroting van een specimen gevisualiseerd bij 10-20 X (vergroting × van een objectief) zullen 63 X, respectievelijk, in combinatie met een (meestal tweedehands) 10 X oogbeschadigingen en/of lens.Visualiseren van gecomprimeerde optische stapel om te zoeken van het 5mC en 5hmC signaal

Representative Results

Om te bepalen van de verdeling van de 5-methylcytosine (5mC) en 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) tijdens de ontwikkeling van de retina en in postmitotic netvlies, wij immunostained C57BL/6J muis retinale sectie van E16, P0, P15 en P90 met antilichamen specifiek om te 5mC en 5hmC. Bij E16 was de kleuring van de 5mC sterk in chromocenters van de celkernen terwijl zwakke kleuring werd waargenomen in de hele celkernen (Figuur 1a). De kleuring van de 5hmC werd beperkt tot de celkernen en afwezig was van de chromocenters (Figuur 1b). In P0 netvlies, was het 5mC signaal gelokaliseerd op de chromocenters van de celkernen en nucleaire perifirie (Figuur 2a, pijl en pijlpunt). Wij merkte tevens zwakke kleuring van 5mC tussen de chromocenters van de celkernen. Het signaal van de 5hmC was sterk aanwezig in de celkernen met uitzondering van de chromocenters (Figuur 2b). We vonden dat meer kernen zijn gekleurd met 5mC en 5hmC in innerlijke neuroblast laag (INBL) (Figuur 2 c, stippellijn) In P15 netvlies vonden we sterke verkleuring van de 5mC en 5hmC in nucleaire buitenlaag (ONL), nucleaire binnenlaag (l) en ganglion cellaag (GCL) (Figuur 3). In ONL (rod researchdieren) was het 5mC signaal aanwezig in de chromocenters van de celkernen en nucleaire perifirie (cijfers 3a-3 c, 3 g). Het 5hmC signaal werd gevonden in de hele celkernen met uitzondering van de chromocenters (cijfers 3d-3f). De transmissie-elektronenmicroscopie gedaan op P15 netvlies toont de verdeling van hétérochromatique domeinen in staaf celkernen vergelijkbaar met die gevonden met 5mC antilichaam signaal (figuren 3 h en 3i). De kleuring van de 5mC in l en GCL was sterk in de chromocenters van de celkernen en zwakke kleuring werd ook waargenomen in hele celkernen (cijfers 3j-3 l en 3r-3t). In tegenstelling tot 5mC, was het 5hmC signaal gelokaliseerd op de hele celkernen met uitzondering van de chromocenters in l en GCL (cijfers 3 m-3o en 3u-3w). We waargenomen sterke 5hmC signaal aan de periferie van GCL celkernen. In volwassen rod researchdieren was het 5mC signaal beperkt tot de chromocenter en de nucleaire perifirie van de celkernen (cijfers 4a-4 c) terwijl 5hmc signaal was beperkt tot de nucleaire perifirie (figuren 4 d-4f). Figuur 1. Lokalisatie van 5-methylcytosine en 5-hydroxymethylcytosine in het netvlies van de muis ten embryonale dage 16.Immunokleuring van C57BL/6J netvlies met antilichamen tegen 5mC (rood, a) en 5hmC (groen, b). E16 is 5mC signaal zeer sterk in de chromocenters van de celkernen en ook aanwezig in de hele celkernen op veel lager niveau. 5hmC kleuring was uitsluitend beperkt tot de celkernen. Deelvenster c vertegenwoordigt samengevoegde 5mC en 5hmC afbeelding. Kernen zijn counterstained met de DAPI (blauw, c). Inzetstukken vertegenwoordigen vergroting van de ruimte die zijn genoemd met sterretje in de beelden. Schaal bar: 5 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2. Immunohistochemische kleuring van 5-methylcytosine en 5-hydroxymethylcytosine in muis netvlies op postnatale dag 0.Immunolabeling van C57BL/6J netvlies met antilichamen tegen 5mC (rood, a) en 5hmC (groen, b). In P0 netvlies zijn 5mC en 5hmC aanwezig in zowel de buitenste neuroblast laag (ONBL) en de innerlijke neuroblast laag (INBL). a) 5mC signaal is sterk aanwezig in de chromocenters (pijl) en de nucleaire perifirie van de celkernen (pijlpunt). Zwakke kleuring van 5mC is ook waargenomen tussen de chromocenters van celkernen. b) 5hmC kleuring is beperkt tot de celkern en sterk signaal wordt waargenomen in INBL (stippellijn in deelvenster c). Deelvenster c vertegenwoordigt samengevoegde 5mC en 5hmC afbeelding. Kernen zijn counterstained met de DAPI (blauw, c). Inzetstukken vertegenwoordigen vergroting van de ruimte die zijn genoemd met sterretje in de beelden. Schaal bar: 5 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3. 5-methylcytosine en 5-hydroxymethylcytosine distributie in muis netvlies op postnatale dag 15.Immunokleuring van C57BL/6J netvlies met anti-5mC en 5hmC antilichamen (a-g, j-y). In nucleaire buitenlaag (ONL) (rod researchdieren), 5mC signaal (rood, a) meestal samenvalt met de chromocenters van de celkernen (pijlpunt, b) en ook lokaliseert aan de nucleaire perifirie (pijl, b). Deelvenster b (rood) en c (grijs) vertegenwoordigen vergroting van de ruimte die zijn genoemd met sterretje in de afbeelding een. Het 5hmC signaal (groen, d) is beperkt tot de hele celkernen met uitzondering van de chromocenters. Paneel e (groen) en f (grijs) vertegenwoordigen vergroting van de ruimte die zijn genoemd met sterretje in de afbeelding d. Panel g samengevoegde 5mC en 5hmC afbeelding vertegenwoordigt. Kernen zijn counterstained met DAPI. Deelvenster h en ik zijn transmissie elektronenmicroscoop beeld van fotoreceptor kernen op postnatale dag 15 weergegeven: verdeling van de hétérochromatique domeinen. Zwarte pijlpunt in deelvenster h verwijst naar één staaf fotoreceptor nucleus in deelvenster i. uitgebreid met rode pijlpunten in deelvenster die ik wijs hétérochromatique domeinen binnen staaf fotoreceptor nucleus terwijl rode pijlen naar heterochromatin in de nucleaire perifirie wijzen. In l (j-q) en GCL celkernen (r-y), het 5mC signaal (rood) is gelokaliseerd op de chromocenters aanwezig in de periferie en ook in de rest van de celkernen zwakke kleuring wordt ontdekt. Deelvenster k (rood) en ik (grijs) vertegenwoordigen vergroting van de ruimte die zijn genoemd met sterretje in de afbeelding j. De 5hmC kleuring (groen) in l en GCL celkernen is beperkt tot de hele celkern. Opmerking sterke 5hmC vlekken in de nucleaire perifirie van GCL cellen. Deelvenster p en x vertegenwoordigen samengevoegde 5mC en 5hmC beeld terwijl deelvenster q en y vergroting van de ruimte die zijn genoemd met sterretje in de afbeelding p en x respectievelijk vertegenwoordigen. Kernen zijn counterstained met DAPI. Schaal bar: 5 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 4. 5-methylcytosine en 5-hydroxymethylcytosine distributie in staaf fotoreceptor kernen van C57BL/6J muis netvlies op postnatale dag 90.De kleuring van de 5mC (rood, een) is sterk aanwezig in de chromocenter van de celkernen en ook zwak heden in de nucleaire perifirie. Deelvenster b (rood) en c (grijs) vertegenwoordigen vergroting van de ruimte die zijn genoemd met sterretje in de afbeelding een. De 5hmC kleuring (groen, d) is uitsluitend beperkt tot de nucleaire perifirie paneel e (groen) en f (grijs) vertegenwoordigen vergroting van de ruimte die zijn genoemd met sterretje in de afbeelding d. Panel g samengevoegde 5mC en 5hmC beeld terwijl deelvenster h vertegenwoordigt is vergroting van de ruimte die zijn genoemd met sterretje in de afbeelding die g. kernen zijn counterstained met de DAPI (blauw). Schaal bar: 5 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Methylation van DNA en hydroxymethylation zijn dynamische en omkeerbare DNA wijzigingen, welke modulatethe breed scala aan biologische mechanismen in een ontwikkelingsland zo goed zoals in de postmitotic cellen. Hier beschrijven we een reproduceerbare techniek voor het opsporen van 5mC en 5hmC DNA wijzigingen in situ door immunohistochemische techniek (met behulp van anti-5mC en anti-5hmC antilichamen) in bevroren secties paraformaldehyde-vaste muis de vlek, en bieden richtsnoeren voor de verbetering en standaardisatie van de resultaten, met name bij het vergelijken van verschillende verschillende exemplaren. Wij eerder gebruikte deze methode om af te bakenen 5mC veranderingen in muis retina met retina-specifieke doelgerichtheid van Dnmt1, Dnmt3a en Dnmt3b DNA methyltransferase genen, en gemeld de (verwachte) uitputting van 5mC merken in hun netvlies7 .

De kritische stap in 5mC immunohistochemische detectie is optimalisatie van behandeling van histologische secties met HCl: minder dan 15 min voorbehandeling niet naar verwachting reproduceerbare resultaten opleveren, overwegende dat buitensporige behandeling met HCl vernietigt de nucleaire het platform. We vonden de beste resultaat na een incubatieperiode van 30 min met HCl. Het is raadzaam om altijd gebruik maken van vers verdunde HCl en versgemaakte 4% PFA oplossing voor DNA denaturatie- en retinale weefsel fixatie.

Voor het oplossen van de resultaten, is het raadzaam om op te nemen van drie tot vier biologische wordt gerepliceerd terwijl het optimaliseren van 5mC signaal. Terwijl elk individu van set immunohistochemische kleuring kan enigszins verschillende resultaten genereren (meer of minder helder hétérochromatique regio’s), die naar verwachting in immunohistochemische methode, de 5mC en de 5hmC nucleaire distributie binnen de individuele set van secties zal naar verwachting worden zeer reproduceerbaar is, voor zo lang als het protocol wordt gevolgd.

Deze techniek heeft ook beperking zoals we consequent variabiliteit in 5mC distributie in de celkernen fotoreceptor binnen dezelfde sectie gezien. We vonden enkele kernen toonde sterke 5mC signaal terwijl aangrenzende celkernen geen 5mC-signaal toonde. Dit is te wijten aan de beperking in ontmaskeren 5mC antigeen door HCl behandeling in bevroren secties.

De betekenis van deze techniek kan 5mC lokalisatie zonder DNase en proteïnase K behandeling leidt tot beter behoud van chromocenters. Deze techniek wordt geacht te werken krachtig op geen secties uit alle gewervelde dierlijke weefsels, dragende 5mC 5hmC merken, en verwerkt met een soortgelijke aanpak, niet alleen muis netvlies, voor zolang het protocol wordt gevolgd.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door een subsidie van SBIR (1R44EY027654-01A1).

Materials

Supplies
29G1/2 ULTRA-FINE BD Biosciences 329461
Ophthalmic scissor Fine Science tools, Inc.  15000-03
PAP pen RPICORP.com 195505
Microslide Superfrost plus VWR 48311-703
Reagent
Paraformaldehyde Electron Microscope Science 15710
1x PBS Corning 21-031-CV
Sucrose Sigma S9378
Tissue-Tek Optical cutting compound (OCT) VWR 4583
Triton X 100 Sigma T9284
6 N HCl VWR analytical  BDH7204-1
Tris-HCl pH 8.3 Teknova T1083
Goat serum Jackson Immunoresearch 005-000-121
5mC Genway Biotech  GWB-BD5190
5hmC Active Motif 39791
LaminB1 Abcam Ab16048
Cy2 AffiniPure Goat Ant-Rabbit IgG Jackson Immunoresearch 111-225-1444
Cy3 AffiniPure Goat Ant-Mouse IgG Jackson Immunoresearch 115-585-166
DAPI Thermo Fisher Scientific D1306
Prolong Gold Antifade medium Thermo Fisher Scientific P36930
Equipment
MICRM HM 550 Thermo Fisher Scientific 388114
Confocal microscope Zeiss
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Merbs, S. L., et al. Cell-specific DNA methylation patterns of retina-specific genes. PLoS One. 7 (3), e32602 (2012).
  2. Nasonkin, I. O., et al. Conditional knockdown of DNA methyltransferase 1 reveals a key role of retinal pigment epithelium integrity in photoreceptor outer segment morphogenesis. Development. 140 (6), 1330-1341 (2013).
  3. Rhee, K. D., Yu, J., Zhao, C. Y., Fan, G., Yang, X. J. Dnmt1-dependent DNA methylation is essential for photoreceptor terminal differentiation and retinal neuron survival. Cell Death & Disease. 3, e427 (2012).
  4. Wahlin, K. J., et al. Epigenetics and cell death: DNA hypermethylation in programmed retinal cell death. PLoS One. 8 (11), e79140 (2013).
  5. Aldiri, I., et al. The Dynamic Epigenetic Landscape of the Retina During Development, Reprogramming, and Tumorigenesis. Neuron. 94 (3), 550-568 (2017).
  6. Eberhart, A., et al. Epigenetics of eu- and heterochromatin in inverted and conventional nuclei from mouse retina. Chromosome Research. 21 (5), 535-554 (2013).
  7. Singh, R. K., et al. Dnmt3a and Dnmt3b cooperate in photoreceptor and outer plexiform layer development in the mammalian retina. Experimental Eye Research. 159, 132-146 (2017).
  8. Farinelli, P., et al. DNA methylation and differential gene regulation in photoreceptor cell death. Cell Death & Disease. 5, e1558 (2014).
  9. Mo, A., et al. Epigenomic landscapes of retinal rods and cones. Elife. 5, e11613 (2016).
  10. Popova, E. Y., Barnstable, C. J., Zhang, S. S. Cell type-specific epigenetic signatures accompany late stages of mouse retina development. Advances in Experimental Medicine and Biology. 801, 3-8 (2014).
  11. Kim, J. W., et al. NRL-Regulated Transcriptome Dynamics of Developing Rod Photoreceptors. Cell Reports. 17 (9), 2460-2473 (2016).
  12. Wang, L., et al. Retinal Cell Type DNA Methylation and Histone Modifications Predict Reprogramming Efficiency and Retinogenesis in 3D Organoid Cultures. Cell Reports. 22 (10), 2601-2614 (2018).
  13. Perera, A., et al. TET3 is recruited by REST for context-specific hydroxymethylation and induction of gene expression. Cell Reports. 11 (2), 283-294 (2015).
  14. Mimura, I., et al. Dynamic change of chromatin conformation in response to hypoxia enhances the expression of GLUT3 (SLC2A3) by cooperative interaction of hypoxia-inducible factor 1 and KDM3A. Molecular and Cellular Biology. 32 (15), 3018-3032 (2012).
  15. Nair, N., Shoaib, M., Sorensen, C. S. Chromatin Dynamics in Genome Stability: Roles in Suppressing Endogenous DNA Damage and Facilitating DNA Repair. Int J Mol Sci. 18 (7), (2017).
  16. Mekhail, K., Moazed, D. The nuclear envelope in genome organization, expression and stability. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (5), 317-328 (2010).
  17. Misteli, T., Soutoglou, E. The emerging role of nuclear architecture in DNA repair and genome maintenance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (4), 243-254 (2009).
  18. Solovei, I., et al. Nuclear architecture of rod photoreceptor cells adapts to vision in mammalian evolution. Cell. 137 (2), 356-368 (2009).
  19. Solovei, I., et al. LBR and lamin A/C sequentially tether peripheral heterochromatin and inversely regulate differentiation. Cell. 152 (3), 584-598 (2013).
  20. Solovei, I., Thanisch, K., Feodorova, Y. How to rule the nucleus: divide et impera. Current Opinion in Cell Biology. 40, 47-59 (2016).
  21. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).
  22. Cross, S. H., Charlton, J. A., Nan, X., Bird, A. P. Purification of CpG islands using a methylated DNA binding column. Nature Genetics. 6 (3), 236-244 (1994).
  23. Antequera, F., Bird, A. Number of CpG islands and genes in human and mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (24), 11995-11999 (1993).
  24. Antequera, F., Boyes, J., Bird, A. High levels of de novo methylation and altered chromatin structure at CpG islands in cell lines. Cell. 62 (3), 503-514 (1990).
  25. Fouse, S. D., et al. Promoter CpG methylation contributes to ES cell gene regulation in parallel with. Oct4/Nanog, PcG complex, and histone H3 K4/K27 trimethylation. Cell Stem Cell. 2 (2), 160-169 (2008).
  26. Elango, N., Yi, S. V. DNA methylation and structural and functional bimodality of vertebrate promoters. Molecular Biology and Evolution. 25 (8), 1602-1608 (2008).
  27. Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341 (6146), 1237905 (2013).
  28. Colwell, M., et al. Evolutionary conservation of DNA methylation in CpG sites within ultraconserved noncoding elements. Epigenetics. 13 (1), 49-60 (2018).
  29. Lee, S. M., et al. Intragenic CpG islands play important roles in bivalent chromatin assembly of developmental genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), E1885-E1894 (2017).
  30. Charlet, J., et al. Bivalent Regions of Cytosine Methylation and H3K27 Acetylation Suggest an Active Role for DNA Methylation at Enhancers. Molecular Cell. 62 (3), 422-431 (2016).
  31. Bernhart, S. H., et al. Changes of bivalent chromatin coincide with increased expression of developmental genes in cancer. Scientific Reports. 6, 37393 (2016).
  32. Curry, E., et al. Genes Predisposed to DNA Hypermethylation during Acquired Resistance to Chemotherapy Are Identified in Ovarian Tumors by Bivalent Chromatin Domains at Initial Diagnosis. Recherche en cancérologie. 78 (6), 1383-1391 (2018).
  33. Rakyan, V. K., et al. Human aging-associated DNA hypermethylation occurs preferentially at bivalent chromatin domains. Genome Research. 20 (4), 434-439 (2010).
  34. Smith, Z. D., Meissner, A. DNA methylation: roles in mammalian development. Nature Reviews Genetics. 14 (3), 204-220 (2013).
  35. Chen, T., Li, E. Structure and function of eukaryotic DNA methyltransferases. Current Topics in Developmental Biology. 60, 55-89 (2004).
  36. Nasonkin, I. O., et al. Distinct nuclear localization patterns of DNA methyltransferases in developing and mature mammalian retina. The Journal of Comparative Neurology. 519 (10), 1914-1930 (2011).
  37. Scourzic, L., Mouly, E., Bernard, O. A. TET proteins and the control of cytosine demethylation in cancer. Genome Medicine. 7 (1), 9 (2015).
  38. Gong, Z., Zhu, J. K. Active DNA demethylation by oxidation and repair. Cell Research. 21 (12), 1649-1651 (2011).
  39. Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).
  40. Pastor, W. A., et al. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).
  41. Suzuki, M. M., Bird, A. DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics. Nature Reviews Genetics. 9 (6), 465-476 (2008).
  42. Kurdyukov, S., Bullock, M. DNA Methylation Analysis: Choosing the Right Method. Biology (Basel). 5 (1), (2016).
  43. Lisanti, S., et al. Comparison of methods for quantification of global DNA methylation in human cells and tissues). PLoS One. 8 (11), e79044 (2013).
  44. Armstrong, K. M., et al. Global DNA methylation measurement by HPLC using low amounts of DNA. Biotechnology Journal. 6 (1), 113-117 (2011).
  45. consortium, B. Quantitative comparison of DNA methylation assays for biomarker development and clinical applications. Nature Biotechnology. 34 (7), 726-737 (2016).
  46. Bock, C., et al. Quantitative comparison of genome-wide DNA methylation mapping technologies. Nature Biotechnology. 28 (10), 1106-1114 (2010).
  47. Song, C. X., He, C. The hunt for 5-hydroxymethylcytosine: the sixth base. Epigenomics. 3 (5), 521-523 (2011).
  48. Abakir, A., Wheldon, L., Johnson, A. D., Laurent, P., Ruzov, A. Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).
  49. Santos, F., Dean, W. Using immunofluorescence to observe methylation changes in mammalian preimplantation embryos. Methods in Molecular Biology. 325, 129-137 (2006).
  50. Watson, J. D., Crick, F. H. The structure of DNA. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 123-131 (1953).
  51. Swaroop, A., Kim, D., Forrest, D. Transcriptional regulation of photoreceptor development and homeostasis in the mammalian retina. Nature Reviews Neuroscience. 11 (8), 563-576 (2010).
  52. Kizilyaprak, C., Spehner, D., Devys, D., Schultz, P. In vivo chromatin organization of mouse rod photoreceptors correlates with histone modifications. PLoS One. 5 (6), e11039 (2010).
  53. Singh, R. K., Kolandaivelu, S., Ramamurthy, V. Early alteration of retinal neurons in Aipl1-/- animals. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 3081-3092 (2014).
  54. Eberhart, A., Kimura, H., Leonhardt, H., Joffe, B., Solovei, I. Reliable detection of epigenetic histone marks and nuclear proteins in tissue cryosections. Chromosome Research. 20 (7), 849-858 (2012).

Tags

Immunohistochemistry5-methylcytosine5-hydroxymethylcytosineMouse RetinaRetinal DevelopmentChromatinFrozen Histological PreparationCryosectioningImmunostainingDNA Methylation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Singh, R. K., Diaz, P. E., Binette, F., Nasonkin, I. O. Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina. J. Vis. Exp. (138), e58274, doi:10.3791/58274 (2018).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image