Summary

Produzindo a deleção do Gene na Escherichia coli por transdução P1 com fitas de resistência aos antibióticos sujeitos

Published: September 01, 2018
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Summary

Aqui nós apresentamos um protocolo para o uso de construções de exclusão de resistência aos antibióticos-gaveta pré-existente, como uma base para a tomada de mutantes de exclusão em outras estirpes de Escherichia coli . Tais mutações de exclusão podem ser mobilizadas e inseridas o locus correspondente de uma estirpe de destinatário usando transdução de bacteriófago P1.

Abstract

Uma primeira abordagem para estudar a função de um gene desconhecido em bactérias é criar um knock-out deste gene. Aqui, descrevemos um protocolo robusto e rápido para transferência de mutações do gene exclusão de uma estirpe de Escherichia coli para outro usando transdução generalizada com o bacteriófago P1. Este método requer que a mutação seja selecionável (por exemplo, baseado em interrupções de gene usando inserções de gaveta antibiótico). Tais fitas antibióticas podem ser mobilizadas a partir de uma estirpe de doador e introduziram uma destinatário estirpe de interesse para rapidamente e facilmente geram um mutante de apagamento do gene. A gaveta antibiótica pode ser projetada para incluir sites de reconhecimento de flipase que permitem que a excisão da fita por um site-specific recombinase para produzir um nocaute limpo com apenas uma sequência de ~ 100-base-par-longa cicatriz no genoma. Demonstramos o protocolo ao nocautear o gene de tamA codifica um fator de montagem envolvido na biogênese de autotransporter e testar o efeito desse nocaute sobre a biogênese e a função de dois autotransporter trimeric adesinas. Embora a supressão do gene por transdução P1 tem suas limitações, a facilidade e rapidez de sua implementação seja uma alternativa atraente para outros métodos de apagamento do gene.

Introduction

Uma primeira abordagem comum para estudar a função de um gene é executar o mutagenesis de mata-mata e observar o fenótipo resultante. Isto também é denominado genética reversa. A bactéria e. coli tem sido o carro-chefe da biologia molecular nos últimos 70 anos, ou então, devido à facilidade do seu cultivo e sua acessibilidade para manipulação genética1. Vários métodos foram desenvolvidos para produzir exclusões de gene em e. coli, incluindo troca de marcador a mutagênese2,3 e, mais recentemente, recombineering usando o λ vermelho ou Rac ET sistemas4,5 , 6.

Em um sistema amplamente utilizado, codificação de sequências de genes individuais são substituídas por uma gaveta de resistência aos antibióticos que pode mais tarde ser extirpada do cromossoma5,7. As sequências de codificação são substituídas, por exemplo, uma gaveta de resistência de canamicina (Kan), que é ladeada por sites de destino (FRT) de reconhecimento de flipase (FLP) em ambos os lados. Os sites da FRT são reconhecidos pela recombinase FLP, que medeia a site-specific recombinação entre os sites FRT, levando à supressão da fita Kan. Desta forma, uma exclusão total de sequência de código de um determinado gene pode ser conseguida, deixando para trás apenas uma sequência de cicatriz mínima de aproximadamente 100 pares de bases (bp) (Figura 1).

Pouco mais de uma década atrás, foi desenvolvida a coleção chamada de Keio. Esta é uma biblioteca bacteriana com base em um padrão de laboratório cepa de Escherichia coli K12, onde quase todos os genes não essenciais foram individualmente excluídos por λ recombinação vermelho7,8. Os clones dentro de cada coleção tem uma sequência de código substituída com uma gaveta de resistência Kan sujeitas. A coleção de Keio provou para ser uma ferramenta útil para muitas aplicações9. Uma tal aplicação é a produção de mutantes de exclusão em outras estirpes de Escherichia coli . A gaveta de Kan de um clone de exclusão determinada pode ser mobilizada por geralmente transducing bacteriófagos, tais como P110,11,12,13,14. Um estoque de fago preparado a partir de uma tensão tão grande pode ser usado para infectar um destinatário Escherichia coli cepa de interesse, onde em uma frequência baixa, mas de confiança o Kan região contendo gaveta pode ser incorporada o genoma destinatário por recombinação homóloga (Figura 2). Transductants podem ser selecionados para o crescimento em meio de Kan-contendo. Em seguida, se a remoção da fita resistência aos antibióticos é desejada, a recombinase FLP pode ser fornecido para a estirpe transductant em trans. Após a cura o plasmídeo contendo FLP, que transporta um marcador de resistência a ampicilina (Amp), clones de Kan e Amp-sensíveis são selecionados para, e a correta excisão de sequência de codificação a selvagem-tipo e a gaveta de Kan são verificadas por PCR de colônia.

Aqui, é apresentado um protocolo detalhado, descrevendo cada uma das etapas na produção de uma estirpe de Escherichia coli , baseado na estratégia delineada acima de mata-mata. Como exemplo, uma deleção do gene da tamA é demonstrada. tamA codifica uma proteína de β-barril de membrana exterior que é uma parte do transporte e módulo de montagem (TAM), que está envolvida na biogênese de certas proteínas autotransporter e pili15,16,17. Esta estirpe de mata-mata foi usado para examinar o efeito da exclusão tamA sobre a biogênese de dois autotransporter trimeric adesinas (TAAs), a Yersinia adesina YadA e a Escherichia coli imunoglobulinas (Ig)-vinculação TAA EibD 18,19.

Protocol

1. cepas e plasmídeos Estirpes bacterianas Use a e. coli as estirpes BW251135, JW4179 (BW25113 tamA::kan)7, BL21(DE3)20e BL21ΔABCF21. Consulte Tabela de materiais para mais informações. Bacteriófagos Use o fago P1vir para a transdução geral. Armazenar a Praga como um estoque líquido com a…

Representative Results

Geração de um tamA Knock-out de BL21ΔABCF: A estratégia acima descrita anteriormente foi usada para produzir uma tensão derivada de BL21(DE3), uma estirpe de laboratório padrão usada para a produção de proteína, que é otimizada para a produção de proteínas de membrana exterior e chamada BL21ΔABCF21. Esta tensão não possui quatro genes que codificam para proteínas de membrana extern…

Discussion

Transdução de P1 é um método rápido, robusto e confiável para a geração de exclusões de gene em e. coli. Isso é demonstrado aqui pelo transducing um mutante de exclusão de tamA de uma estirpe de doador de Keio para um destinatário BL21-derivado. As grandes etapas do processo de transdução são a produção do transducing lisada, a transdução em si, a excisão da fita Kan resistência e a verificação do knock-out pelo PCR. No total, o processo leva cerca de 1 semana e requer sem método…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cepas de coleção de Keio foram obtidas a partir do projeto nacional de BioResource (NIG, Japão): Escherichia coli. Agradecemos seu apoio contínuo Dirk Linke (departamento de Biociências, Universidade de Oslo). Este trabalho foi financiado pelo Conselho de pesquisa da Noruega jovem pesquisador grant 249793 (Jack C. Leo).

Materials

Strains
E. coli BW25113 NIG ME6092 Wild-type strain of Keio collection
E. coli BL21(DE3) Merck 69450-3 Expression strain
E. coli BL21DABCF Addgene 102270 Derived from BL21(DE3)
E. coli JW4179 NIG JW4179-KC tamA deletion mutant
P1 vir NIG HR16 Generally transducing bacteriophage
Plasmids
pCP20 CGSC 14177 conditionally replicating plasmid with FLP
pASK-IBA2 IBA GmbH 2-1301-000 expression vector
pEibD10 N/A N/A for production of EibD; plasmid available on request
pET22b+ Merck 69744-3 expression vector
pIBA2-YadA N/A N/A for production of YadA; plasmid available on request
Chemicals
Acetic acid ThermoFisher 33209
Agar BD Bacto 214010
Agarose Lonza 50004
Ampicillin Applichem A0839
Anhydrotetracycline Abcam ab145350
anti-collagen type I antibody COL-1 Sigma C2456
Bovine collagen type I Sigma C9791
Calcium chloride Merck 102382
Chloroform Merck 102445
Di-sodium hydrogen phosphate VWR 28029
DNA dye Thermo S33102
DNA molecular size marker New England BioLabs N3232S
DNase I Sigma DN25
dNTP mix New England Biolabs N0447
ECL HRP substrate Advansta K-12045
EDTA Applichem A2937
Glycerol VWR 24388
goat anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz sc-2005
goat anti-rabbit IgG-HRP Agrisera AS10668
HEPES VWR 30487
Isopropyl thiogalactoside VWR 43714
Kanamycin Applichem A1493
Lysozyme Applichem A4972
Magnesium chloride VWR 25108
Manganese chloride Sigma 221279
N-lauroyl sarcosine Sigma L9150
Skim milk powder Sigma 70166
Sodium chloride VWR 27808
tamA forward primer Invitrogen N/A Sequence 5'-GAAAAAAGGATATTCAGGAGAAAATGTG-3'
tamA reverse primer Invitrogen N/A Sequence 5'-TCATAATTCTGGCCCCAGACC-3'
Taq DNA polymerase New England Biolabs M0267
Tri-sodium citrate Merck 106448
Tryptone VWR 84610
Tween20 Sigma P1379
Yeast extract Merck 103753
Equipment
Agarose gel electrophoresis chamber Hoefer SUB13
Bead beater Thermo FP120A-115
CCD camera Kodak 4000R
Electroporation cuvettes Bio-Rad 165-2089
Electroporation unit Bio-Rad 1652100
Gel imager Nippon Genetics GP-03LED
Incubating shaker Infors HT Minitron
Incubator VWR 390-0482
Microcentrifuge Eppendorf 5415D
Microwave oven Samsung CM1099A
PCR machine Biometra Tpersonal
PCR strips Axygen PCR-0208-CP-C
pH meter Hanna Instruments HI2211-01
PVDF membrane ThermoFisher 88518
SDS-PAG electrophoresis chamber ThermoFisher A25977
Tabletop centrifuge Beckman Coulter B06322
Vortex mixer Scientific Industries SI-0236
Water bath GFL D3006
Wet transfer unit Hoefer TE22

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Citer Cet Article
Saragliadis, A., Trunk, T., Leo, J. C. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (139), e58267, doi:10.3791/58267 (2018).

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