Physikalische Charakterisierung einzelner metallischer Nanopartikel in hoher Auflösung
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Detektion diskreter Metallsauerstoffcluster, Polyoxometallate (POMs) an der Grenze zu einzelnen Molekülen, mithilfe einer biologischen Nanoporen-basierten elektronischen Plattform vor. Die Methode bietet einen komplementären Ansatz zu traditionellen analytischen Chemiewerkzeugen, die bei der Untersuchung dieser Moleküle verwendet werden.
Abstract
Einzelne Moleküle können erkannt und charakterisiert werden, indem sie den Grad messen, durch den sie den ionenförmigen Strom reduzieren, der durch eine einzelne Nanometer-Pore fließt. Das Signal ist charakteristisch für die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Moleküls und seine Wechselwirkungen mit der Pore. Wir zeigen, dass die durch das bakterielle Protein-Exotoxin Staphylococcus aureus alpha hämolysin (HL) gebildete Nanopore Polyoxometalate (POMs, anionische Metallsauerstoffcluster) an der Grenze zu einzelnen Molekülen nachweisen kann. Darüber hinaus werden mehrfache Abbauprodukte von 12-Phosphotungstic Acid POM (PTA, H3PW12O40) in Lösung gleichzeitig gemessen. Die Einzelmolekülempfindlichkeit der Nanoporenmethode ermöglicht es, POMs in deutlich niedrigeren Konzentrationen als für die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) zu kennzeichnen. Diese Technik könnte als neues Werkzeug für Chemiker dienen, um die molekularen Eigenschaften von Polyoxometalaten oder anderen metallischen Clustern zu untersuchen, um pom synthetische Prozesse besser zu verstehen und möglicherweise ihre Ausbeute zu verbessern. Hypothetisch könnte mit dieser Methode die Position eines bestimmten Atoms oder die Rotation eines Fragments im Molekül und der Metalloxidationszustand untersucht werden. Darüber hinaus hat diese neue Technik den Vorteil, dass die Echtzeitüberwachung von Molekülen in Lösung ermöglicht wird.
Introduction
Die Detektion biomolekularer Analyten auf einzelmolekülebene kann durch Nanoporen und Messung von Ionenstrommodulationen durchgeführt werden. Typischerweise werden Nanoporen aufgrund ihrer Herstellung in zwei Kategorien eingeteilt: biologisch (selbstzusammengesetzt aus Protein oder DNA-Origami)1,2,3, oder Festkörper (z.B.hergestellt mit Halbleiterverarbeitungswerkzeuge)4,5. Während Festkörper-Nanoporen als potenziell physikalisch robuster und über eine Vielzahl von Lösungsbedingungen verwendet werden können, bieten Protein-Nanoporen bisher eine höhere Empfindlichkeit, eine höhere Resistenz gegen Fouling, eine größere Bandbreite, eine bessere chemische Selektivität und ein größeres Signal-Rausch-Verhältnis.
Eine Vielzahl von Proteinionenkanälen, wie z. B. der von Staphylococcus aureus (Hämolysin (HL) gebildete, kann verwendet werden, um einzelne Moleküle zu detektieren, einschließlich Ionen (z.B., H+ und D+)2,3, Polynukleotide (DNA und RNA)6,7,8, geschädigte DNA9, Polypeptide10, Proteine (gefaltet und entfaltet)11, Polymere (Polyethylenglykol und andere)12,13 , 14, gold nanoparticles15,16,17,18,19, und andere synthetische Moleküle20.
Kürzlich haben wir gezeigt, dass die ‘HL-Nanopore auch metallische Cluster, Polyoxometalate (POMs), auf der Ebene einzelner Moleküle leicht erkennen und charakterisieren kann. POMs sind diskrete nanoskalige anionische Metallsauerstoff-Cluster, die 182621entdeckt wurden, und seitdem wurden viele weitere Typen synthetisiert. Die verschiedenen Größen, Strukturen und elementaren Zusammensetzungen von Polyoxometallen, die jetzt verfügbar sind, führten zu einer Vielzahl von Eigenschaften und Anwendungen, einschließlich Chemie22,23, Katalyse24, Materialwissenschaft25 ,26, und biomedizinische Forschung27,28,29.
Die POM-Synthese ist ein Selbstmontageverfahren, das typischerweise in Wasser durch Mischen der stoichiometrisch erforderlichen Mengen monomerer Metallsalze durchgeführt wird. Einmal gebildet, zeigen POMs eine große Vielfalt an Größen und Formen. Zum Beispiel besteht die Keggin Polyanion Struktur, XM12O40q- aus einem Heteroatom (X) umgeben von vier Sauerstoffn, um ein Tetraeder zu bilden (q ist die Ladung). Das Heteroatom befindet sich zentral in einem Käfig, der durch 12 oktaeder MO 6-Einheiten gebildet wird (wobei M = Übergangsmetalle in ihrem hohen Oxidationszustand), die durch benachbarte gemeinsame Sauerstoffatome miteinander verbunden sind. Während die Struktur von Wolframpolyoxometallaten unter sauren Bedingungen stabil ist, führen Hydroxidionen zur hydrolytischen Spaltung von Metall-Sauerstoff-Bindungen (M-O)30. Dieser komplexe Prozess führt zum Verlust einer oder mehrerer MO6 Oktaeder-Untereinheiten, was zur Bildung von monovacantn und trivacant Arten und schließlich zur vollständigen Zersetzung der POMs führt. Unsere Diskussion wird sich hier auf die partiellen Zersetzungsprodukte von 12-Phosphotungssigsäure bei pH 5,5 und 7,5 beschränken.
Ziel dieses Protokolls ist es, diskrete Metallsauerstoffcluster an der Grenze zu einzelnen Molekülen mithilfe einer biologischen nanoporenbasierten elektronischen Plattform zu erkennen. Diese Methode ermöglicht die Detektion von metallischen Clustern in Lösung. Mehrere Arten in Lösung können mit einer größeren Empfindlichkeit als herkömmliche Analysemethoden diskriminiert werden33. Damit können feine Unterschiede in der POM-Struktur aufgeklärt werden und bei Konzentrationen deutlich niedriger als bei der NMR-Spektroskopie. Wichtig ist, dass dieser Ansatz sogar die Diskriminierung von isomerischen Formen von Na8HPW9O341ermöglicht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aufgrund ihrer anionischen Ladung werden POMs wahrscheinlich durch elektrostatische Wechselwirkungen mit organischen Gegenkationen assoziiert. Daher ist es wichtig, die richtigen Lösungsbedingungen und die richtigen Elektrolytumgebungen (insbesondere Kationen in Lösung) zu identifizieren, um komplexe Bildungen mit POMs zu vermeiden. Besondere Sorgfalt ist bei der Pufferwahl erforderlich. Beispielsweise ist die Erfassungsrate von POMs mit Tris(Hydroxymethyl)Aminomethan und Zitronensäure-gepufferten Lösungen deutlich n…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar für die finanzielle Unterstützung durch die European Molecular Biology Organization für ein Postdoktorandenstipendium (an J.E.) und ein Stipendium des NIH NHGRI (an J.J.K.). Wir schätzen die Hilfe der Professoren Jingyue Ju und Sergey Kalachikov (Columbia University) für die Bereitstellung heptamerischer HL und für inspirierende Diskussionen mit Professor Joseph Reiner (Virginia Commonwealth University).
Materials
| Nanopatch DC System | Electronic Biosciences, Inc., EBS | ||
| Millipore LC-PAK | Millipore vacuum filter | ||
| 1,2-Diphytanoyl-sn- Glycero-3-Phosphocholine (DPhPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850356P | |
| Decane, ReagentPlus, ≥99%, | Sigma-Aldrich | D901 | |
| αHL | List Biological Laboratories, Campbell, CA | ||
| Ag wire | Alfa Aesar | ||
| 2 mm Ag/AgCl disk electrode | In Vivo Metric | E202 | |
| High-impedance amplifier system | Electronic Biosciences, San Diego, CA | ||
| quartz capillaries | |||
| custom polycarbonate test cell | |||
| Data Processing and Analysis MOSAIC | https://pages.nist.gov/mosaic/ | ||
| Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 455970 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma-Aldrich | 71507 |
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