זיהומים arbovirus כמו כלים ההקרנה לצורך זיהוי גורמים אנטי ויראלי Immunomodulators ומנחה

היכולת של וירוס לשכפל באופן פרודוקטיבי שורה מסוימת כפוף באופן חלקי הזמינות של התא המארח גורמים התומכים נגיפי כניסה של שכפול¹. הטווח וירוס-המארח יכול גם יכתיב את הקיבולת של וירוס מונה הגנות אנטי ויראליים הסלולר הפוגעים אחרת שכפול ויראלי^2,3. זה התוצאה של אינטראקציות אלה מורכבים וירוס-מארח זה בסופו של דבר להחליט אם וירוס יהיה מסוגל להשלים את מחזור חייו מארח מסוים. לאור ההשלכות החולני שעשויות להיות עבור המארח אם שכפול ויראלי מתפתח, זה קריטי לפתח אסטרטגיות ניסיוני כדי לקדם את ההבנה שלנו של אינטראקציות וירוס מפתח-מארח זה יכול להטות את הכף בין שנכשל ופורה זיהומים. שחקרתי את התכונות מולקולרית של וירוס-פונדקאי הגומלין יהיה אינסטרומנטלי הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות אנטי ויראליים חדשה ואלטרנטיבית.

עם כניסתו של RNA הפרעה (RNAi)^4,5 , כלים לעריכת הגנום (למשל., CRISPR-Cas9, אבץ אצבע nucleases, TALENs)^6,7, זה הפך ריאלי השפעול לשנות הביטוי של גורמים הסלולר על הגנום כולו מאזני ולחקור את ההשפעה של שינויים אלה על שכפול הוירוס. ואכן, רבים RNAi, מסכי הגנום-עריכת מבוססי נערכו סוגי תאים הגעה והמארח חוליות זה יש חשפה היבטים חדשים של וירוס-פונדקאי אינטראקציות^{8,9,10, 11 , 12}. המסכים הבאים בדרך כלל מעסיקים וירוסים קידוד כתבים, כמו גחלילית לוציפראז (לוק) או חלבונים פלורסנט (למשל., ה-GFP, DsRed), אשר מספקים אמצעי נוח באופן כמותי להערכת ביטוי גנים ויראליים כמו הבדיקה שכפול ויראלי^9,12. אסטרטגיה זו מאפשרת לחוקרים לזהות גורמים מארח או לקדם או להרגיז שכפול ויראלי, כפי שמעידים עליות או ירידות, בהתאמה, ב כתב ויראלי אותות^9,12. עם זאת, ברוב המכריע של המקרים, את המסכים הבאים נערכו באמצעות וירוסים מותאמים היטב סוג התא המארח שבו הם נמצאים נחקר. אסטרטגיה זו יכול להיות חשוב להבנת היחסים coevolutionary בין פתוגנים ויראליים מארחיהם טבעי, זה להוות יסוד חששות לגבי השימוש בהם במסגרת חשיפת מארח גורמים אנטי-ויראלי. במקרים אלה, שיפור בוירוס כתב אות RNAi נוקאאוט הוא להיות חיפש, או איון של הסלולר גורם בדרך כלל פוגעת שכפול ויראלי. ראשית, אם וירוס כבר אפשרות לשכפל robustly בתא המארח נבדק בתנאים שליטה, הטווח הדינמי של המסך (כלומר, את היכולת להבחין בין הרקע לבין אותות משופרת כתב ויראלי) עלולה להיות מוגבלת. שנית, בעיה זו מורכב עוד יותר על ידי המצבים בהם הנגיף הוא סטוש לתא המארח ויעיל -המאבק מארח ההגנה מסלולים המיועדים במסך.

בשל החשש לעיל לגבי האינטראקציה וירוס המסורתי-מארח הקרנות שיטות, פיתחנו פרדיגמה חדשה ללמוד אינטראקציות וירוס-פונדקאי לנצל arbovirus שנכשל באופן טבעי זיהומים בתאי חרקים lepidopteran. אסטרטגיה זו נובעת התבוננות arbovirus למד היטב האדם, VSV, עובר זיהום שנכשל בתאים שמקורם עש הצועני (ל’ dispar)¹³. VSV מועברת באופן טבעי על ידי חרקים dipteran (קרי, זבובי חול) בתרבית של המארחים, הוכח בניסוי כדי להדביק את מגוון רחב של חסרי חוליות, מארחים חוליות ב תא תרבות, אין ויוו¹⁴. הגנום RNA חד-גדילי של שלילי-סנס 11-kb של VSV מקודד mRNAs subgenomic חמש אחד המתורגמים לתוך החלבונים המרכיבים את מעטפת virion. עם זאת, מערכות גנטיות הפוכה VSV אפשרו ליצירת זנים שכפול-המוסמכת קידוד לוק או חלבונים פלורסנט, בנוסף חמש טבעי VSV ג’ין מוצרים^15,16,17. כי לא משולבים חלבונים אלה כתב virion VSV, הם מספקים readout נוח של ביטוי גנים VSV המתרחשת הפוסט פוסט. באמצעות זנים VSV קידוד GFP או לוק, אנחנו בעבר הראו כי ביטוי גנים VSV היא הוגבלה בצורה קשה על כניסתם של תאים LD652, כי VSV titers לא להגדיל על ידי 72 שעות לאחר הפגיעה (מדד מחירי הבתים. של). לעומת זאת, coinfection של תאים LD652 עם VSV, את בתרבית של poxvirus, וירוס vaccinia (VACV), מוביל לוגריתמי מגביר התבטאות גנים VSV והן titers ובשלב זה הזמן. VACV עובר מוקדם ביטוי גנים, שכפול ה-DNA, ביטוי גנים מאוחר LD652 תא זיהומים, אבל בסופו של דבר שנכשל בשל virion לא שלם מורפוגנזה¹⁸מחזור שכפול VACV. הגנום גדולות של DNA ~ 192 kb של VACV מקודד > 200 חלבונים, שרבים מהם להציג מאפייני immunomodulatory לקדם שכפול ויראלי דרך הדיכוי של תגובות חיסוניות מארח¹⁹. לכן, שיערנו כי “חילוץ” שכפול VSV בתאים LD652 על ידי VACV coinfection היה ככל הנראה מתווכת על-ידי immunomodulators VACV זה עכבות תגובות ל’ dispar בדרך כלל הגבלת VSV שכפול. כדי לתמוך בזה, הטיפול של תאים LD652 עם מארח ה-RNA פולימראז II המדכא ואקטינומיצין D גם מציל שכפול VSV בתאים LD652, המציין כי התגובות תלויי-תמלול מארח לחסום VSV שכפול פוסט-הפוסט¹³.

התצפיות הנ ל מציע כי הטבע מגבילות באופן טבעי של תאי LD652 לזיהום VSV עשוי לספק רקע נמוך יחסית בעת הקרנת עבור התנאים המשפרים את הכתב מקודד VSV אותות (כלומר, כאלה לעכב את המארח הגנות אנטי-ויראלי). כאן, אנו מספקים שיטות באמצעות קרינה פלואורסצנטית או מבוסס-לוק מבחני המסך עבור תנאי זה להקל על הגבלת VSV בתאים lepidopteran. ראשית, אנו מראים כמה מבחני אלה ניתן להשתמש כדי לזהות גורמים לשווק מקודד immunomodulatory לשבור את ההגבלה VSV במהלך ניסויים או coinfection, או דרך ביטוי חוץ רחמי של גורמים נגיפיים המועמד. כדוגמה, אנחנו מדגימים איך היינו אלה טכניקות ההקרנה כדי לזהות חלבונים A51R מקודד poxvirus כמשפחה חדשה של גורמים immunomodulatory להציל את שכפול VSV בהיעדרו של גורמים אחרים poxvirus¹³. שנית, אנחנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש RNAi הקרנת מגבילות VSV-LD652 תא זיהומים ישירות לזהות מארח האיקריוטים הגורמים המעורבים הגבלת arbovirus¹³.