Meting van de concentratie van de Ion in de ongemengde grenslaag met Open Patch-Clamp pipet: gevolgen in de controle van de ionenkanalen door Fluid Flow

Vloeistofstromen is een belangrijke milieu-cue waarmee veel fysiologische en pathologische processen zoals fluid flow-geïnduceerde vasodilatatie en vloeistof schuintrekken kracht-afhankelijke vasculaire remodeling en ontwikkeling^{1,2, 3,4,5}. Hoewel de moleculaire mechanismen voor de biologische reacties op vloeistofstromen schuintrekken kracht niet helemaal begrepen zijn, gaat men ervan uit dat de fluid flow-gemedieerde regulering van ion kanaal gating kritisch tot de vloeistof stroom-geïnduceerde reacties^{5 bijdragen kan , 6 , 7 , 8}. bijvoorbeeld de activering van het endotheel innerlijke gelijkrichter Kir2.1 en Ca^{2 +}-geactiveerde K⁺ (K_Ca2.3, KCNN3) kanalen na Ca^{2 +} toestroom door vloeistofstromen heeft gesuggereerd om bij te dragen tot vloeistof stroom-geïnduceerde vasodilatatie^6,7,8. Daarom veel ionenkanalen, vooral mechanisch-geactiveerde of -geremde kanalen, zijn bestudeerd in termen van vloeistof stroom/schuifspanning kracht gevoeligheid met de patch-clamp techniek^{6,9,10 , 11}. afhankelijk van het experimentele protocol taakuit patch-clamp opnemen, uitkomsten en interpretatie van de gegevens op de vloeistof stroom-Reglement van ionenkanalen kunnen echter foutieve^10,11.

Een bron van vloeibare stroom-geïnduceerde artefacten in patch-clamp opname is vanaf de samenvloeiing potentiële tussen de Badvloeistof en Ag/AgCl referentie elektrode¹¹. Het is algemeen aangenomen dat de vloeistof/metaal-kruising potentieel tussen de Baden vloeistof en Ag/AgCl-elektrode constant, is zoals de Cl^– -concentratie van de vloeistof zwemmen blijft constant, gelet op de chemische reactie tussen de zwemwater-oplossing en Ag/AgCl-elektrode te zijn:

AG + Cl^–↔ AgCl + elektron (e^–) (vergelijking 1)

Echter, in een geval waar de totale elektrochemische reactie tussen de zwemwater-oplossing en Ag/AgCl-elektrode (vergelijking 1) opbrengst van links naar rechts, de concentratie van de Cl^– van de Baden vloeistof grenzend aan de Ag/AgCl verwijzing elektrode (ongemengde grenslaag^12,13,14,15) wellicht veel lager dan die in de bulk van het zwemwater oplossing, tenzij genoeg convectional transport te waarborgen. Het gebruik van een oude of niet-ideale Ag/AgCl-elektrode met inadequate chlorering van Ag kan dergelijk risico verhogen. Deze vloeistof stroom-gerelateerde artefact op de referentie-elektrode, in feite, kan worden uitgesloten door het simpelweg plaatsen van een conventionele agarose-zout-brug tussen de Baden vloeistof en referentie-elektrode, aangezien het artefact is gebaseerd op wijzigingen in de reële Cl^– concentratie grenzend aan de Ag/AgCl-elektrode¹¹. Het protocol gepresenteerd in deze studie beschrijft hoe te voorkomen van de mogelijke wijzigingen van de stroom-gerelateerde junction en meten van echte ion concentraties in de ongemengde grenslaag.

Na het plaatsen van een agarose KCl brug tussen de Baden vloeistof en Ag/AgCl-elektrode, is er een andere cruciale factor die u moet overwegen: net zoals de verwijzing Ag/AgCl-elektrode fungeert als een Cl^– -elektrode, de ionenkanalen ook kunnen functioneren zoals een ion-selectieve elektrode. De situatie van een ongemengde grenslaag tussen de Baden vloeistof en Ag/AgCl-elektrode ontstaat tijdens de beweging van ionen tussen de extracellulaire en intracellulaire oplossingen via het membraan ionenkanalen. Dit impliceert dat voorzichtigheid moet worden gebruikt wanneer de interpretatie van het Reglement van ion kanalen door vloeistofstromen. Zoals besproken in onze eerdere studie¹¹, de beweging van ionen via een oplossing waarin een elektrochemische gradiënt aanwezig is via drie verschillende mechanismen kan optreden: diffusie, migratie en convectie, waar diffusie de beweging is geïnduceerd door verloop van de concentratie, migratie is de beweging gedreven door elektrische verloop en convectie is het verkeer door middel van vloeistof-flow. Onder deze drie vervoer mechanismen, draagt convectie modus bij de meeste aan de beweging van ionen¹¹ (> 1.000 keer groter is dan de verspreiding of migratie onder gebruikelijke patch-clamp-instellingen). Dit vormt de theoretische basis van waarom junction potentiële tussen de Baden vloeistof en Ag/AgCl-elektrode kan zeer onder verschillende voorwaarden voor statische en vloeistof-flow¹¹.

Volgens de hypothese voorgesteld hierboven, sommige facilitatory effecten van vloeistofstromen op de huidige ionkanaal kunnen worden afgeleid uit de convectie restauratie van echte ion concentraties grenzend aan de inlaat van kanaal aan de oppervlakte van het membraan (ongemengde grenslaag) ¹⁰. In dit geval de vloeistof stroom-geïnduceerde effecten op ion kanaal stromingen zijn eenvoudigweg ontstaan uit elektrochemische gebeurtenissen, niet van het Reglement van ion kanaal gating. Een soortgelijk idee was eerder voorgesteld door Barry en collega’s^12,13,14,15 op basis van strenge theoretische overwegingen en experimenteel bewijs, ook bekend als de ongemengde laag of vervoer nummer effect. Als sommige ionenkanalen voldoende voordoen enkellijns geleidingsvermogen en lang genoeg open-tijd om te zorgen voor voldoende vervoer tarieven via de kanalen (vervoer sneller in het membraan dan in het ongemengde membraan oppervlak), een grenslaag effect . Dus, de convectie-afhankelijke vervoer kan bijdragen tot de uiteindelijke vloeistof-stroom-geïnduceerde faciliteiten van ion huidige^{10,12,13,14,15}.

In deze studie, benadrukken wij het belang van het gebruik van een agar of agarose zout-brug terwijl het bestuderen van vloeistof-stroom-geïnduceerde verordening van ion stromen. We bieden ook een methode voor het meten van echte ion concentraties in de ongemengde grenslaag grenzend aan de Ag/AgCl referentie elektrode en membraan ionenkanalen. Bovendien, de theoretische interpretatie van vloeistof stroom-geïnduceerde modulatie van ion kanaal stromen (dat wil zeggen, convectie hypothese of ongemengde vervoer nummer laageffect) kunnen waardevolle inzichten voor het ontwerpen en het interpreteren van onderzoeken op de shear kracht-regulatie van ionenkanalen. Volgens het ongemengde grenslaag vervoer nummer effect voorspellen we dat ion kanaal stromen via alle soorten membraan ionenkanalen kunnen worden vergemakkelijkt door vloeistofstromen, onafhankelijk van hun biologische gevoeligheid voor vloeistofstromen schuintrekken kracht, maar alleen als de ionenkanalen hebben voldoende enkellijns geleidingsvermogen en open-lang. Hogere ion kanaal huidige dichtheden kan verhogen de ongemengde grenslaag effect op het oppervlak van de celmembraan.