雌激素原代牛颗粒细胞的组织培养模型

注意: 牛卵巢是从商业屠宰场获得的。屠宰副产品的收集不需要根据德国法律的道德批准。 1. 工作条件和准备 为了保证不孕, 在专门的细胞培养实验室中使用层流工作台, 进行所有培养基和组织准备以及所有的文化工作。 准备1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS, pH 值 7.4) 补充100毫克青霉素, 0.1 镁/毫升链霉素和0.5 µg/µL 两性霉素为卵巢的运输。注意: 在接受卵巢和隔离 GC 之间的最大持续时间是 2 h 在这个设置。 2. 牛颗粒细胞的分离 在 1x PBS 中多次冲洗卵巢 (含100微克青霉素, 0.1 毫克/毫升链霉素, 0.5 µg/µL 两性霉素), 在开始隔离手术前从表面清除任何血液。使用烧杯, 将卵巢放在里面, 用 1x pbs 填充, 然后再次丢弃 pbs。 重复这个洗涤步骤 3–4x, 直到卵巢被清除任何剩余的血液。 用70% 酒精浸泡过的实验室擦拭一个子房, 以尽量减少可能的污染物。 用3毫升注射器和18克针, 通过穿刺小到中等大小的卵泡 (< 6 毫米, 用尺子测量) 吸入 GC, 并将滤泡液在一个50毫升离心管中池中。注: 要滋润注射器, 请服用少量 1x PBS (含100毫克青霉素、0.1 毫升链霉素和0.5 µg/µL 两性霉素)。这有助于收集少量的滤泡液, 防止细胞黏附在注射器内。 穿刺几个卵泡后, 用 1x PBS 冲洗注射器和针头, 进行中间清洗。 3. 细胞的超低温保存 使用台盼蓝染色, 数 hemocytometer 下的细胞。 要计算活细胞的数量, 请准备一个1.5 µL 的0.25% 台盼蓝溶液的管。注意: 活细胞将保持无瑕, 因为台盼蓝只能进入死细胞的细胞屏障, 然后出现蓝色。 将颗粒细胞悬浮液中的15µL 加入到台盼蓝溶液中, 并轻轻搅拌。 把混合物放在 hemocytometer 的两个房间里。计算每室一个大正方形的生活 (例如, 无瑕) 细胞数。注意: 虽然可以看到一些血细胞, 但它们可以用非常小的尺寸来区分。 根据一般准则计算两个腔室平方均值的活细胞数;活细胞的比例可以在卵巢之间变化, 但应超过 60。 从新鲜分离的颗粒细胞池中抽取样本作为进一步分析的参考。 根据分离的 GC 的细胞计数, 预留适当数量的细胞作为参考样品为 RNA、脱氧核糖核酸或者蛋白质准备。注意: 对于 RNA 的分离和随后对基因表达的评价, 1 x 105细胞是足够的, 而随后的其他分析可能需要不同的, 通常更高的细胞数。 将一个或几个整除数的参考细胞在一个新鲜的管和离心机在室温和最大速度 (1.2万 x g), 以获得细胞颗粒。放弃上清。 立即对液氮中的样品进行冲击冻结。将样品存放在摄氏-80 摄氏度。 按如下方式执行超低温保存。 用80% 胎小牛血清 (FCS) 和20% 二甲基亚砜 (亚砜) 制备冷冻培养基。 为了将 gc 轻轻地颗粒, 在室温和 500 x g上离心气相色谱为3分钟。 仔细取出上清液, 轻轻地将100% 细胞 (如1 毫升) 并用重悬, 直到再也看不到细胞团簇。 将所制备的冷冻介质的1体积 (例如1 毫升) 添加到细胞悬浮液中, 并将混合物转移到低温瓶中。注: 冷冻保护介质的最终浓度将为 90% FCS 和10% 亚砜。 将低温瓶放在专门的 (商用) 冷冻容器中, 防止快速结冰。样品的冷却速率不应超过-1 摄氏度/分钟. 将冷冻容器转移到-80 °c 冰箱中, 至少4小时。 为了更长的贮存, 将低温瓶放在超低温容器中 (如液相氮气容器)。注意: 该协议可以在这里停止, 因为冷冻保存允许更长的存储。 4. 细胞培养用培养基和培养板的制备 0.02% 胶原蛋白 R 的涂层细胞培养板。注意: 胶原蛋白 R 被称为在培养中更好地附着 GC 的必要条件。 制备0.02% 胶原 R 溶液, 纯化水适合细胞培养。 在24井板 (= 2 厘米2/井) 中添加150µL, 并确保培养的整个表面都覆盖了胶原 R 溶液。 让溶液干燥的盖子打开几个小时或一夜之间的层流罩。 当培养皿完全干燥时, 用 UV 光照射它们, 以10–15最小的污染。 如有必要, 将板材贮存在摄氏4摄氏度, 长达2月。 在层流罩下为文化工作准备培养基和补充剂。为了成功回收 GC, 必须在解冻后立即处理。 准备以下媒体。 补充α极小的基本培养基 (α-内存) 与2毫米 l-谷氨酰胺, 0.084% 碳酸氢钠, 0.1% 牛血清白蛋白 (BSA), 20 毫米 HEPES, 4 ng/毫升亚硒酸钠, 5 µg/毫升转铁蛋白, 10 ng/毫升胰岛素和1毫米非必需氨基酸。 另外, 在培养基上加入100毫克青霉素和0.1 毫升链霉素。注: 抗生素, 一旦加热, 是稳定的大约48小时。因此, 整除文化设置和计划媒体交换所需的媒体量。预热仅媒介整除数到37°c 在水浴。准备好的介质可以储存在4摄氏度, 不超过3月。 在培养的牛气相色谱中诱导甾体活性, 另外辅以 20 ng/毫升卵泡刺激激素 (FSH)、50 IGF-1/ml R3 、2µM androstenedione。注: 在文化或媒体交流开始前不久, 总是对这些组件进行补充。避免重复冻融循环的 FSH 和 IGF-1 的库存解决方案, 因为这可能会损害类固醇活动。 5. 细胞培养工作 快速解冻细胞在水浴在37°c 为 3–4 min 并且转移细胞悬浮入37°c 预先预热的α-记忆 (没有激素补充)。对于离心, 建议最后的体积为10毫升。 在室温和 500 x g处离心气相色谱3分钟。放弃上清。添加预热和补充的α记忆, 并并用重悬细胞仔细。 将 GC 的种子密度为 1 x 105或 1 x 106个单元格, 并在最终体积为500µL. 包括每种条件下至少三个养殖井的技术复制。 孵化细胞培养在一个孵化器在37°c 与 5% CO2为 8 d。 每隔一天进行一次媒体交流。仅更换2/3 的培养基以减少压力, 并减轻细胞对新鲜介质的适应性。注: 在培养几天后, GC 形成典型的成纤维细胞样表型, 并趋于聚集在一起。在高细胞密度的培养中, 比正常密度 GC 培养更频繁地发现更大的簇 (图 1, 左对右面板)。 6. 培养颗粒细胞的后续分析 进行类固醇激素分析, 收集媒体和冻结在-20 摄氏度。使用适当的方法分析乏培养基中雌二醇和孕酮浓度 (如放射免疫 (RIA))14。 对于不同靶分子 (RNA、DNA、蛋白质等) 的后续分析, 溶解细胞直接在培养基中与供应商推荐的合适的株溶藻剂结合。注意: 对于大多数隔离过程, 有可能在这里停止协议, 因为裂解单元可以存储在-20 摄氏度, 长达1周。为了更长的贮存, 细胞应保持在摄氏-80 摄氏度。 通过定量的实时聚合酶链反应 (qPCR) 技术, 确定转录丰度, 合成 cDNA 并测量特定转录量15。统计评价应包括至少三种不同细胞培养的复制, 其起源于不同的细胞制剂 (生物复制)。