توليد نواقل هربس إنفلونزا الطيور المؤتلف مع كريسبر/Cas9 الجينات تحرير
Summary
هربس من الديك الرومي (هفت) يستخدم على نطاق واسع كمنصة متجه لتوليد المؤتلف لقاحات ضد عدد من الأمراض إنفلونزا الطيور. توضح هذه المقالة نهج بسيط وسريع لجيل اللقاحات المؤتلف فيكتوريد هفت تستخدم نظاما متكاملا نهيج-كريسبر/Cas9 ولوكس Cre.
Abstract
هربس من الديك الرومي (هفت) متجه فيروسية مثالية لتوليد المؤتلف لقاحات ضد عدد من الأمراض إنفلونزا الطيور، مثل فيروس إنفلونزا الطيور (AI) ومرض نيوكاسل (ND)، والأمراض المعدية بورسال (بنك التنمية بين الأمريكتين)، استخدام (البكتيرية الصبغي الاصطناعي الطفرات BAC) أو أساليب جزئ التقليدية. بانتظام مجمع إينتيرسباسيد في تكرار المتناوب (كريسبر)/نظام Cas9 قد استخدمت بنجاح في العديد من الإعدادات للتحرير الجينات، بما في ذلك التلاعب جينوم فيروس الحمض النووي كبيرة عدة. وقد وضعنا سريعة وفعالة كريسبر/Cas9-بوساطة جينوم تحرير أنبوب لتوليد المؤتلف هفت. لتحقيق أقصى قدر من الاستخدام المحتمل لهذا الأسلوب، نقدم هنا معلومات مفصلة حول المنهجية توليد هفت المؤتلف معربا عن البروتين VP2 من إيبدف. يتم إدراج كاسيت التعبير VP2 إلى هفت الجينوم عن طريق نج (نونهومولوجوس نهاية-الالتحاق بالعمل)-مسار إصلاح معتمدة. كاسيت تعبير بروتين (بروتينات فلورية خضراء) فلورية خضراء ترتبط insert للتصور سهلة أولاً وثم إزالتها عن طريق لجنة المساواة العرقية-لوكسب النظام. هذا النهج يوفر طريقة فعالة لإدخال أخرى مولدات المضادات الفيروسية في الجينوم هفت للتطور السريع للقاحات المؤتلف.
Introduction
ماريك بالمرض (MD) مرض ليمفاوية الدجاج الناجمة عن النمط المصلي المسيطر 1 (جاليد هربس 2 [جاهف-2]) من جنس مارديفيروس في الفصيلية من الفاهيربيسفيريناي. مارديفيروس يشمل أيضا اللقاح nonpathogenic هما: النمط المصلي المسيطر 2 (جاب-3) والنمط المصلي المسيطر 3 (ميف 1، المعروفة تاريخيا هفت) التي تستعمل لقاحات ضد دكتوراه في الطب. هفت اللقاحات الحية (سلالة FC-126) هو الجيل الأول من ماريلاند اللقاحات المستخدمة في أوائل السبعينات ولا يزال يستخدم على نطاق واسع في تركيبات اللقاح الثنائي التكافؤ والشاملين لتوفير حماية محسنة ضد دكتوراه في الطب. هفت يستخدم أيضا على نطاق واسع كناقل لقاح للحث على حماية ضد عدد من الأمراض إنفلونزا الطيور نظراً لبراعة والسلامة سواء في ovo والتفريخ تحت الجلد الإدارة والقدرة على توفير حصانة مدى الحياة. استراتيجية لتوليد المؤتلف هفت اللقاحات تستند أما جزئ المتجانسة التقليدية في الخلايا المصابة بالفيروس، كوزميد تداخل السلطات الوطنية المعينة، أو الطفرات باك2. ومع ذلك، هذه الأساليب بشكل عام تستغرق وقتاً طويلاً وكثيفة العمالة، التي تتطلب بناء ناقلات نقل، والحفاظ على الجينوم الفيروسي في تنقية البلاك الإشريكيّة القولونية ، وإزالة تسلسل باك والتحديد ماركر من الفيروسات تم تحريرها3،4.
كريسبر/المرتبطة (Cas9) هو الجين الأكثر شعبية أداة التحرير في السنوات الأخيرة نظراً لبراعة وخصوصية. نظام كريسبر/Cas9 وقد استخدمت بنجاح في كفاءة توليد الخلايا المحورة وراثيا ونماذج حيوانية5،،من67،،من89،10، كما كذلك في التلاعب في عدة كبيرة فيروس الحمض النووي الجينوم11،،من1213،14،15،16،17، 18،،من1920. بعد الإبلاغ عن أسلوب بسيط وفعال باستخدام نظام كريسبر/Cas9 لتحرير الجينوم هفت21، قمنا بتطوير خط أنابيب لتوليد المؤتلف هفت22سريعة وفعالة.
من أجل توسيع نطاق إمكانية تطبيق هذا الأسلوب، يصف لنا منهجية مفصلة لتوليد المؤتلف لقاح هفت التعبير عن الجين VP2 من إيبدف في محور UL45/46 في هذا التقرير. النهج يجمع بين نج-كريسبر/Cas9 لإدراج الجين VP2 المفتاحية الجينات مراسل التجارة والنقل ونظام لجنة المساواة العرقية-لوكسب لإزالة كاسيت تعبير بروتينات فلورية خضراء في وقت لاحق. بالمقارنة مع جزئ التقليدية والتقنيات ريكومبينيرينج باك، علينا أن نبرهن أن نهيج-كريسبر/Cas9 جنبا إلى جنب مع نظام لوكس Cre نهج سريعة وفعالة لتوليد المؤتلف هفت اللقاح.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أصبح النظام كريسبر/Cas9 أداة قيمة في تحرير الجينات. وعادة ما تنطوي التكنولوجيات التقليدية المؤتلف هفت ناقل التنمية، مثل جزئ مثلى13 و BAC الطفرات التكنولوجيا25، عدة جولات من ناقل الاستنساخ والتحديد، فضلا عن فحص واسعة النطاق، الذي قد يستغرق عدة أشهر. البروتوكول هو موضح هنا باستخدام استراتيجية نج كريسبر/Cas9-على أساس جنبا إلى جنب مع نظام لوكس Cre وفرز الخلايا المفردة أكثر نهج ملاءمة وكفاءة وأسرع في توليد اللقاح الماشوب. استخدام خط الأنابيب هذا، يمكن الحصول على الفيروس المؤتلف في 1-2 أسابيع فقط24، ويمكن أيضا أن يخفض خطوات تنقية اللوحة إلى فصل واحد-جولة باستخدام خلية تنشيط fluorescence الفرز17. العملية برمتها، من تشييد جرنة التصميم والمانحين للحصول على الفيروس هفت المؤتلف المنقي، يمكن أن يتحقق في غضون شهر 1. وتشمل الخطوات الحاسمة لنجاح الجيل هفت المؤتلف التحديد جرنة ذات الكفاءة العالية لاستهداف الجينوم الفيروسي لضمان كفاءة الانقسام للإدراج الجينات الأجنبية، كفاءة عالية تعداء إلى أقصى حد الفرصة ل Cas9/ جرناس والفيروس للوفاء في نفس الخلية للتحرير، وفترة 12 ساعة بين تعداء البلازميدات المانحين وجرنة والعدوى الفيروسية للسماح Cas9 وجرنة للتعبير عنها عند مستوى معقول قبل أن يحصل هذا الفيروس في الخلايا.
الحد لتوليد المؤتلف هفت استنساخ تعقيد تحديد بروتينات فلورية خضراء-الإيجابية بتقاطع PCR. يمكن إدراج أشرطة VP2 التجارة والنقل في أي اتجاه. ملتقى PCR الموصوفة هنا فقط للتعرف على الإدراج في اتجاه الشعور. في حالة الإدراج في اتجاه العقاقير، لن تعمل PCR باستخدام أزواج التمهيدي ووصف، وقد تبادلت الإشعال الداخلية لهذا الغرض. مشكلة محتملة أخرى أن يمكن فقط استخدامها في بناء المانحة للإدراج أحد الجينات في نفس الفيروس بسبب الوجود تسلسل لوكسب المتبقية بعد إزالة بروتينات فلورية خضراء بمعاملة لجنة المساواة العرقية. يمكن استخدام تركيبة الجهات مانحة جديدة مع متغير التسلسل لوكسب بدلاً من ذلك لغرض إدراج متعددة.
نج وتقرير التنمية البشرية (إصلاح موجه التماثل) على مسارين لإصلاح فواصل مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل (دسبس) التي تم إنشاؤها بواسطة Cas926،27. نج أكثر كفاءة كما يحدث في جميع أنحاء دورة الخلية28، في حين أن تقرير التنمية البشرية أقل كفاءة ويحدث فقط خلال S و G2 المراحل6،،من2930. يمكننا استغلال نج أكثر كفاءة إصلاح المسار هنا لإدخال الجينات الأجنبية في المواقع المستهدفة. على الرغم من أن إصلاح نج قد يعرض إينديلس بالانضمام إلى نهايات الحمض النووي نونكومباتيبلي أو التالفة من خلال31،ميتشانيستيكالي مرنة عملية مستقلة عن التماثل32 بين المانحين ملصوق تسلسل والحمض النووي، إينديلس يمكن أن يحدث فقط في مواقع الانقسام منخفض الوزن، وكاسيت التعبير الجيني الأجنبية لا يتأثر. وهناك ميزة أخرى لهذا النهج أن نج مجاني من تقييد التماثل ذراع البناء، مما يجعل استنساخ خطوة بسيطة جداً. وهذا يدفعنا بإمكانات كبيرة لتطبيق نج للإدراج الجينات الأجنبية. وينتهي إدخال الموقع الهدف جرنة العالمي على حد سواء ليجعل كاسيت الجينات الأجنبية عملية أكثر سرعة كما يمكن تشييد القالب المانحة فورا مع عدم وجود حاجة لاختيار جرنة محددة. العمود الفقري بلازميد الجهات المانحة التي تحتوي على المواقع المستهدفة sgA ومواقع لوكسب ومواقع باشي وصفي يمكن أيضا أن تكون مشتركة على نطاق واسع بين الجينات مراسل مختلفة، والأشرطة الأجنبية في التعبير الجيني، ونواقل الفيروسات المختلفة، إعطاء هذا النهج الجديد في الاستفادة من التخصيص.
إدراج VP2 إيواء هفت كان يستخدم لوصف البروتوكول في هذه المخطوطة؛ ومع ذلك، يمكن استخدام نفس النهج لإدراج أكثر من المورثات الفيروسية في مواقع مختلفة الجينوم الجينوم هفت استخدام جرنة استهداف تسلسل المقابلة المرجوة لتطوير لقاحات هفت فيكتوريد المؤتلف متعددي. أخرى سلالات لقاح MDV، مثل بينالي الشارقة-1 و CVI988، هيربيسفيروسيس الطيور الأخرى، بما في ذلك الفيروسات المعدية لارينجوتراتشيتيس وبطة فيروس التهاب الأمعاء، وأيضا أخرى إنفلونزا الطيور فيروسات الحمض النووي، مثل فيروسات جدري وغديه، يمكن أن يكون هندسيا أيضا استخدام نفس نهج لتطوير اللقاح الماشوب متعددي. تطوير لقاحات فيكتوريد متعددي جديدة باستخدام منصة نظام كريسبر/Cas9 الموصوفة هنا سوف يكون مفيداً للغاية لصناعة الدواجن لحماية ضد أمراض الدواجن متعددة.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون هاويس بيبا للمساعدة في التصوير [كنفوكل]. أيد هذا المشروع التكنولوجيا الأحيائية، ومجلس بحوث العلوم البيولوجية (BBSRC) المنح BBS/E/أنا/00007034 و BB/L014262/1.
Materials
| M199 medium, Earle's Salts | Life technology | 11150059 | cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926 | cell culture medium |
| Penicillin and Streptomycin | Life technology | 15140148 | antibiotics |
| Fungizone | Sigma | 1397-89-3 | antifunigal |
| Tryptose Phosphate Broth | Sigma | T8782 | cell culture medium |
| HVT Fc126 strain | Avian Disease and Oncology Laboratory | wildtype HVT virus | |
| pX459-v2 | Addgene | Plasmid #62988 | Cas9 and gRNA expression vector |
| pGEM-T Easy Vector Systems | promega | A1360 | donor vector cloning |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | transformation |
| PacI | NEB | rR0547S | donor vector cloning |
| SfiI | NEB | R0123S | donor vector cloning |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | cloning |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | plasmid extraction |
| TransIT-X2 | Mirus | MIR 6004 | transfection |
| Cell Culture 6-well Plate | Thermofisher | 140675 | cell culture |
| GoTaq Master Mixes | Promega | M7123 | junction PCR amplification |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Thermofisher | 11708021 | PCR amplification of full insert |
| Goat anti-Chicken IgY (H+L) Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11039 | immunoflourescence staining |
| Goat anti-Mouse IgG Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11004 | immunoflourescence staining |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP5 LASAF | immunoflourescence |
| FACS cell sorter | BD biosciences | BD FACSAria | single cell sorting |
| Paraformaldehyde (4% in PBS) | Santa cruz biotechnology | SC-281692 | cell fixation |
| Triton X-100 | GeneTex | GTX30960 | permeabilization |
References
- Witter, R. L., Solomon, J. J. Experimental infection of turkeys and chickens with a herpesvirus of turkeys (HVT). Avian Diseases. 16 (1), 34-44 (1972).
- Baigent, S. J., et al. Herpesvirus of turkey reconstituted from bacterial artificial chromosome clones induces protection against Marek’s disease. Journal of General Virology. 87, 769-776 (2006).
- Messerle, M., Crnkovic, I., Hammerschmidt, W., Ziegler, H., Koszinowski, U. H. Cloning and mutagenesis of a herpesvirus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14759-14763 (1997).
- Zhao, Y., Nair, V. Mutagenesis of the repeat regions of herpesviruses cloned as bacterial artificial chromosomes. Methods in Molecular Biology. 634, 53-74 (2010).
- Ma, Y., et al. Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9. Cell Research. 24 (1), 122-125 (2014).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Niu, Y., et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via. Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156 (4), 836-843 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nature Biotechnology. 32 (6), 551-553 (2014).
- Zhang, Y., et al. CRISPR/Cas9 mediated chicken Stra8 gene knockout and inhibition of male germ cell differentiation. PLoS One. 12 (2), 0172207 (2017).
- Bi, Y., et al. High-efficiency targeted editing of large viral genomes by RNA-guided nucleases. PLoS Pathogens. 10 (5), 1004090 (2014).
- Bierle, C. J., Anderholm, K. M., Wang, J. B., McVoy, M. A., Schleiss, M. R. Targeted mutagenesis of guinea pig cytomegalovirus using CRISPR/Cas9-mediated gene editing. Journal of Virology. 90 (15), 6989-6998 (2016).
- Suenaga, T., Kohyama, M., Hirayasu, K., Arase, H. Engineering large viral DNA genomes using the CRISPR-Cas9 system. Microbiology and Immunology. 58 (9), 513-522 (2014).
- Xu, A., et al. A simple and rapid approach to manipulate pseudorabies virus genome by CRISPR/Cas9 system. Biotechnology Letters. 37 (6), 1265-1272 (2015).
- Yuan, M., et al. Efficiently editing the vaccinia virus genome by using the CRISPR-Cas9 system. Journal of Virology. 89 (9), 5176-5179 (2015).
- Yuen, K. S., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing of Epstein-Barr virus in human cells. Journal of General Virology. 96, 626-636 (2015).
- Liang, X., et al. A CRISPR/Cas9 and Cre/Lox system-based express vaccine development strategy against re-emerging Pseudorabies virus. Scientific Reports. 6, 19176 (2016).
- Zou, Z., et al. Construction of a highly efficient CRISPR/Cas9-mediated duck enteritis virus-based vaccine against H5N1 avian influenza virus and duck Tembusu virus infection. Scientific Reports. 7 (1), 1478 (2017).
- Peng, Z., et al. Pseudorabies virus can escape from CRISPR-Cas9-mediated inhibition. Virus Research. 223, 197-205 (2016).
- Tang, Y. D., et al. Live attenuated pseudorabies virus developed using the CRISPR/Cas9 system. Virus Research. 225, 33-39 (2016).
- Yao, Y., Bassett, A., Nair, V. Targeted editing of avian herpesvirus vaccine vector using CRISPR/Cas9 nucleases. Journal of Vaccine and Technologies. 1, (2016).
- Tang, N., et al. A simple and rapid approach to develop recombinant avian herpesvirus vectored vaccines using CRISPR/Cas9 system. Vaccine. 36 (5), 716-722 (2018).
- He, X., et al. Knock-in of large reporter genes in human cells via. CRISPR/Cas9-induced homology-dependent and independent DNA repair. Nucleic Acids Research. 44 (9), 85 (2016).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Petherbridge, L., et al. Cloning of Gallid herpesvirus 3 (Marek’s disease virus serotype-2) genome as infectious bacterial artificial chromosomes for analysis of viral gene functions. Journal of Virological Methods. 158 (1-2), 11-17 (2009).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2014).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
