Генерации векторов рекомбинантных птичьего герпеса с ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена редактирования

1. Подготовка Cas9/gRNA выражения и доноров конструкции Строительство Cas9/gRNA выражение плазмиды Дизайн gRNA последовательность ориентации intergenic область между UL45 и UL46 генов HVT, как описано ранее22. Выравнивание гид РНК последовательности против HVT генома, чтобы исключить любые потенциальные пробить последовательности в геноме HVT. Синтезировать и клонировать последовательности gRNA, ориентированные на UL45/46 региона и sg-A последовательность из опубликованных данных23 в pX459-V2, как описано ранее22. Проверьте последовательность клонированных gRNA Сэнгером виртуализации с помощью U6-передний грунт24. Строительство доноров плазмиды Для создания доноров плазмида, содержащий выражение кассеты с VP2, отмеченных съемной кассеты репортер GFP, Дизайн oligos доноров-F и доноров-R, содержащие следующие элементы (рис. 1A и Рисунок 3A): sg-A последовательности целевых объектов на концах, Голд сайт, окруженный с двух LoxP последовательностей для GFP репортер кассеты клонирования и иссечения и два ГИФКУ сайты для клонирования VP2 выражение кассеты. Клонировать последовательности в pGEM-T-легко вектор и, затем, клонировать кассеты гена GFP и VP2 в результирующий вектор для создания плазмида доноров, как pGEM-sgA-GFP-VP222.Примечание: Любой вектор клонирования может использоваться для построения доноров плазмиды. Подготовка плазмида ДНК Подготовьте доноров плазмиды и Cas9/gRNA выражение плазмида ДНК с помощью коммерческих комплект экстракции ДНК согласно инструкциям производителя. 2. ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной забивные: Transfection и инфекции За день до трансфекции, подготовиться трансфекции/инфекции, используя 10 – дневных эмбрионов в среде M199 дополнена плода бычьим сывороточным (ФБС) 5%, 10% tryptose фосфат бульон, пенициллин 100 ед/мл стрептомицином, куриных эмбрионов фибробластов (CEFs) и fungizone 0,25 мкг/мл. Семя 1.3 x 106 клеток на колодец в каждой скважине 6-ну плиты в 2,5 мл среды.Примечание: CEF клетки могут храниться в течение 3 d при 4 ° C. Transfect клетки (подготовленные в шаг 2.1) CEF с 0,5 мкг UL45/46-gRNA, 0,5 мкг sg-a и 1 мкг pGEM-sgA-GFP-VP2, используя соответствующие трансфекции реагент согласно инструкциям производителя. Инкубируйте клетки для 12 h в инкубаторе (на 38,5 ° C с 5% CO2). 12 ч posttransfection Cas9/gRNA и доноров плазмид, разбавляют HVT вирус складе с M199 культуры среднего до 1 x 105 ОРП/мл. 130 мкл разбавленного вируса в каждой скважине transfected клеток и установить один из хорошо untransfected клеток как отрицательный контроль же количеством вируса. Инкубируйте инфицированных/transfected клеток для 3 d на 38,5 ° C с 5% CO2. Провести все процедуры, с помощью совместного кодекса практики (JCoPR) утверждена спонсоров. 3. уборка и очистка HVT рекомбинантных вируса Сортировки активирован флуоресценции клеток Подготовьте два 96-луночных пластины, указывать ответы с 2 х 104 CEF клетки в хорошо день до сортировки. Trypsinize инфицированных transfected/CEFs 3 d postinfection. Аспирационная среднего от каждой скважины и промывать ячейки листа с фосфат амортизированное saline (PBS). Добавьте 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА (0.48 мм) для trypsinize клеток в инкубаторе 38,5 ° C приблизительно 5 минут. Ресуспензируйте и передачи клетки в 1,5 мл трубку microcentrifuge с 50 мкл FBS. Центрифуга на 200 x g за 5 мин. Ресуспензируйте клеток в 1 мл 1% раствора PBS FBS. Подсчет числа клеток с помощью Горяева и отрегулировать количество клеток до 1 x 106 клеток/мл.Примечание: Клетки могут храниться на льду для 1-2 ч. Передать полистирола, сортировка трубку через ее сетчатый фильтр крышки клетки. Сортировать отдельные ячейки, выражая GFP в 96-луночных пластины семенами с CEFs, с использованием клеток сортировщик согласно инструкции производителя. Инкубируйте сортировки клеток для 5 d на 38,5 ° C с 5% CO2.Примечание: Один проход рекомбинантных вируса могут быть необходимы перед сортировки, если есть слишком много одной клетки экспрессия гена GFP и несколько GFP-позитивных бляшек в оригинальной хорошо. Пассированый рекомбинантных вирусов Подготовка 6-ну пластины семенами с 1.3 x 106 клеток CEF хорошо день до прохождения. 5 d postsorting, проверить 96-луночных пластины под флуоресцентным микроскопом. Марк Уэллс, содержащий один налет GFP-положительных.Примечание: Смотрите Рисунок 2A для представителя GFP-позитивных налета. Trypsinize каждый GFP-положительных хорошо с 50 мкл трипсина ЭДТА на 3 мин, добавьте 50 мкл питательной среды, Ресуспензируйте и передачи ячеек в одну скважину 6-ну плиты с CEFs. Это будет первое поколение рекомбинантного HVT. Урожай первого поколения рекомбинатных вирусов 3 d позднее, заморозить вниз один флакон каждого в 1 мл замораживания среднего содержащие плода теленка 10% сыворотки (FCS), 10% диметилсульфоксида (ДМСО) и 80% питательной среды и хранения вирусов в жидком азоте.Примечание: Время сбора урожая варьируется от 2-4 d в зависимости от суммы и распространения способности вируса. Собирать 1 х 105 клеток каждого первого поколения вирусов, центрифуга их и удалить супернатант. Храните клетки при-20 ° C для экстракции ДНК. Обнаружение геномной вставки полимеразной цепной реакции Для экстракции ДНК, оттаивания и Ресуспензируйте клетки гранулы из шага 3.2.4 с 50 мкл squishing буфера (10 мм трис-HCl [рН 8], 1 ЭДТА, 25 мм NaCl и 200 мкг/мл протеиназы K) и лизируйте образцы на 65 ° C для 30 мин и , затем, на 95 ° C в течение 2 минут, чтобы инактивировать K. протеиназы Выполните полимеразной цепной реакции (ПЦР) с 3′ Джанкшен грунтовки (Таблица 1) с помощью 1 мкл образца ДНК. Для каждого образца, подготовить следующие реакции микс 20 мкл на льду: 2 x ПЦР Мастер микс (10 мкл), 10 мкм вверх по течению грунтовка (0.5 мкл), 10 мкм течению грунтовка (0.5 мкл), ДНК шаблон (в 1 мкл) и свободной от нуклеиназы вода (8 мкл). Программа усиления: 95 ° C на 2 мин; 95 ° C за 30 сек, 55 ° C за 30 s и 72 ° C для 40 s для 35 циклов; 72 ° C для 7 мин нагрузки 2 мкл усиление продукции одной скважиной гель агарозы 1% для электрофореза геля.Примечание: Смотрите Рисунок 2A для представителя результат перекрестка 3′ ПЦР. 4. иссечение флуоресцентные Репортер ген через Cre-lox системы Чтобы удалить гена GFP из рекомбинантных вирус, transfect 2 мкг Cre рекомбиназа выражение плазмида в пластину 6-ну указывать ответы с CEF клетки, с помощью трансфекции реагент после инструкции производителя. 12 h posttransfection, размораживание 1 флакон рекомбинантных вируса из жидкого азота, нежно ресуспензируйте, семян 50 мкл в каждой скважине transfected клеток и задать один колодец как отрицательный контроль с тем же количеством вируса. Инкубируйте 3 d на 38,5 ° C с 5% CO2. 5. доска очистки Сортировки активирован флуоресценции клеток Семя два 96-луночных пластины с 2 х 104 CEF клетки в хорошо день до сортировки. Выполните процедуры, описанные в шаг 3.1 72 h postinfection (из шага 4) подготовить инфицированных клеток для сортировки. Сортировка одного nonfluorescence клетки в 96-луночных пластины семенами с CEFs. Пассированый рекомбинантных вирусов и PCR подтверждения Выберите 5-10 одной nonfluorescence 5 d postsorting, trypsinize их с 50 мкл трипсина ЭДТА на 38,5 ° C в течение 3 мин и добавьте 50 мкл культуры средних Ресуспензируйте клетки.Примечание: Смотрите Рисунок 2B для табличкой представитель GFP-отрицательные. Передайте половина клеток в каждой скважине 6-ну плиты указывать ответы с CEFs в качестве второго поколения. Центрифуга оставшиеся ячейки каждого клона на 200 x g 5 минут, удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки с 50 мкл squishing буфер для экстракции ДНК. Выполняйте ПЦР с 5′ Джанкшен грунтовки (Таблица 1) с помощью 1 мкл ДНК шаблона с же условие реакции PCR, как описано в пункте 3.3.2.Примечание: Смотрите Рисунок 2B для представителя результат 5′ Джанкшен ПЦР. На основании результатов ПЦР, выберите три-пять положительных клонов рекомбинантных HVT дальнейшие ходы и проверки. 6. контроль рекомбинантный HVT Непрямой иммунофлюоресценции пробирного Заразить CEFs второго поколения рекомбинантного полученные HVT из шага 5.2 в пластине 24-ну семенами с 2.5 x 105 CEFs за день до инфекции. Удалить ячейку культуры среднего 48 h postinfection и 500 мкл параформальдегида 4% в PBS исправить клетки. Инкубировать пластины при комнатной температуре за 30 мин, затем снимите фиксатор и вымыть клетки слоя 3 x с PBS.Примечание: Клетки могут храниться при температуре 4 ° C на этот шаг в течение нескольких недель. Удаление PBS и 500 мкл 0,1% тритон X-100 для разрушения клеток для 15 минут вымыть клетки слоя 3 x с PBS. Блок неспецифического связывания, добавив блокирующий буфер (5% бычьим сывороточным в PBS) за 1 ч. Разбавить основного антитела анти VP2 моноклональных антител HH7 – или HVT-инфицированных курица сыворотки при 1: 200 в блокирующем буфере, 200 мкл в колодец и инкубации при комнатной температуре за 1 ч. вымыть клетки слоя 3 x с PBS. Разбавить вторичное антитело коза анти мыши IgG Alexa 568 или Коза анти курица Alexa 488 IgG в 1: 200 в блокирующем буфере, 200 мкл в колодец, инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч и вымыть клетки 3 x с PBS. Проверка выражения протеина под флуоресцентным микроскопом.Примечание: Смотрите Рисунок 4 для представителя VP2 пятнать результат. Секвенирование гена VP2 Усилить последовательности ДНК, охватывающих UL45 UL46 intergenic регионе и с высокой точностью ДНК-полимеразы и праймеры UL45-F1 и UL46-R1 (Таблица 1) для обнаружения весь вставки. Приготовить следующую смесь реакции 50 мкл: 5 мкл 10 x Pfx реакции микс, 1,5 мкл 10 мкм вверх по течению и течению грунтовка микс, 1 мкл 10 мм dNTP смеси, 1 мкл 50 мм MgSO4, 1 мкл шаблона дна и 0,5 мкл Pfx ДНК полимеразы и добавьте 50 мкл нуклеиназы свободной воды. Программа усиления: 95 ° C на 2 мин; 95 ° C 15 s, 55 ° C за 30 s и 68 ° C 3 мин для 35 циклов. Загрузите все ПЦР продукта гель агарозы 1% для электрофореза геля. Очищайте продукт PCR после инструкция набор ДНК гель для очистки. Отправьте 10 мкл продукта PCR (30 нг/мкл) виртуализации компании для подтверждения забивные VP2 гена. 7. стабильность рекомбинантных вируса Семя 2.6 x 106 клеток CEF в каждой T25 колбу за день до расширения вирус. Размораживание по меньшей мере три положительных клонов из шага 5.2; Добавьте один флакон клеток/вирусов в каждой T25 колбу. Инкубируйте на 38,5 ° C с 5% CO2 до 50% цитопатического эффекта наблюдается. Урожай клетки в 2 мл питательной среды; заразить 50 мкл на новый флакон T25 указывать ответы с CEF клетки для следующего поколения. Держите пассированый рекомбинантных вирус для по крайней мере 15 поколений. Анализируйте каждое поколение вирусов методом ПЦР на наличие VP2 последовательности и непрямой иммунофлюоресценции assay (IFA) для VP2 выражение для оценки стабильности рекомбинантных вирусов.