CRISPR/Cas9와 재조합 조류 Herpesvirus 벡터 생성 편집 진

1. Cas9/gRNA 식 및 기증자 구성 준비 Cas9/gRNA 식 플라스 미드의 건설 GRNA 시퀀스 HVT22위에서 설명한 대로의 UL45 및 UL46 유전자 사이 intergenic 지역 대상으로 디자인. 배제 HVT 게놈에서 어떤 잠재적인 오프 대상 시퀀스 HVT 게놈에 대 한 가이드 RNA 대상 시퀀스를 정렬 합니다. 합성 하 고 UL45/46 지역 및 pX459 v 222이전에 설명 된 대로 게시 된 데이터23 에서 sg-A 시퀀스를 대상으로 하는 gRNA 시퀀스를 복제. 생어 시퀀싱 U6 Fwd 뇌관24를 사용 하 여 복제 gRNA 시퀀스를 확인 합니다. 기증자 플라스 미드의 건설 VP2 식 카세트 이동식 GFP 기자 카세트와 태그를 포함 하는 기증자 플라스 미드를 생성 하려면 oligos 기증자-F와 기증자-R (그림 1A 와 그림 3A)는 다음과 같은 요소가 포함 된 디자인: sg-A 대상 시퀀스 끝, GFP 기자 카세트 복제 및 절단, 두 LoxP 시퀀스와 형벌 PacI 사이트와 VP2 식 카세트의 복제에 대 한 두 개의 SfiI 사이트에서. PGEM-T-쉬운 벡터에 시퀀스를 복제 하 고, 다음, pGEM-sgA-GFP-VP222로 지정 된 기증자 플라스 미드를 생성 하는 결과 벡터에 GFP와 VP2 유전자 카세트를 복제.참고: 모든 복제 벡터 기증자 플라스 미드를 만드는 데 사용할 수 있습니다. 플라스 미드 DNA 준비 기증자 플라스 미드와 Cas9/gRNA 식 플라스 미드 DNAs 제조업체의 지침에 따라 상업 DNA 추출 키트를 사용 하 여 준비 합니다. 2. CRISPR/Cas9-중재 노크-에서: Transfection 및 감염 Transfection, 전날 transfection/감염, 5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 10 %tryptose 인산 염 국물, 스-100 U/mL 페니실린, 보충 M199 매체에서 10 일 된 배아를 사용 하 여 병아리 태아 섬유 아 세포 (CEFs)을 준비 하 고 0.25 µ g/mL fungizone입니다. 매체의 2.5 ml에서 6 잘 플레이트의 각 음에 잘 당 종자 1.3 x 106 셀.참고: CEF 세포 보관 하실 수 있습니다 3 d 4 ° c.에 CEF 셀 (2.1에서 준비 단계) UL45/46-gRNA의 0.5 µ g, sg-a, 0.5 µ g와 pGEM-sgA-GFP-VP2 제조업체의 지침에 따라 적절 한 transfection 시 약을 사용 하 여의 1 µ g transfect (5% CO238.5 ° C)에 인큐베이터에 12 h에 대 한 셀을 품 어. Cas9/gRNA 및 기증자 플라스 미드의 12 h posttransfection 1 x 105 pfu/mL에 M199 문화 매체와 HVT 바이러스 재고 희석. Transfected 세포의 각 음에 희석된 바이러스의 130 µ L을 추가 하 고 바이러스의 동일한 수량으로 부정적인 컨트롤로 untransfected 셀의 한 우물을 설정. 5% CO238.5 ° C에서 3 d 페/감염 된 세포를 품 어. 모든 절차는 공동 코드의 연습 (JCoPR)는 funders에 의해 승인를 사용 하 여 수행 합니다. 3. 수확 및 HVT 재조합 바이러스의 정화 형광 활성화 된 세포 분류 정렬 하기 전에 잘 일 당 2 × 104 CEF 셀 미리 두 96 잘 접시를 준비 합니다. CEFs 3 d 바람직합니다 페/감염 trypsinize 각 우물에서 매체를 발음 하 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 셀 시트를 헹 굴. Trypsinize 약 5 분 동안 38.5 ° C 배양 기에서 세포를 트립 신-EDTA (0.48 m m) 0.05%의 1 mL를 추가 합니다. Resuspend와 microcentrifuge 튜브 1.5 mL FBS의 50 µ L로 세포를 전송. 5 분 동안 200 x g 에서 원심 분리기. 1%와 PBS의 1 mL에 셀 resuspend FBS. hemocytometer를 사용 하 여 셀 수를 계산 하 고 1 x 106 셀/mL을 셀 수를 조정 합니다.참고: 셀 1-2 h에 대 한 얼음에 보관할 수 있습니다. 폴리스 티 렌 그것의 여과기 모자를 통해 튜브를 정렬 하는 셀을 전송 합니다. 제조업체의 지시에 따라 셀 정렬을 사용 하 여 CEFs로 시드 96 잘 접시에 GFP를 표현 하는 단일 셀을 정렬 합니다. 5 d 5% CO238.5 ° C에서 정렬된 셀을 품 어.참고: 재조합 형 바이러스에의 한 통로 경우 너무 많은 단일 GFP 식 세포와 원래 잘에서 몇 GFP-긍정적인 플 라크를 정렬 하기 전에 필요할 수 있습니다. 재조합 형 바이러스 뿌리고 1.3 통과 하기 전에 잘 하루 106 CEF 셀 x와 시드 6-잘 접시를 준비 합니다. 5 d postsorting, 형광 현미경 96 잘 접시를 확인 합니다. 단일 GFP-긍정적인 패를 포함 하는 우물을 표시 합니다.참고: 그림 2A 대표 GFP-긍정적인 플 라크에 대 한 참조. 트립 신-EDTA 3 분의 50 µ L로 잘 각 GFP-긍정적인 trypsinize 추가 문화 매체의 50 µ L, resuspend 하 고 CEFs와 6 잘 플레이트 한 우물으로 셀을 전송. 이 1 세대 재조합 HVT의 될 것입니다. 재조합 형 바이러스 3 d 나중의 1 세대를 수확, 중간 포함 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 10% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 및 80% 문화 매체, 동결의 1 mL에 각 한 유리병 아래로 고정 하 고 액체 질소에 바이러스를 저장 합니다.참고: 바이러스의 확산 및 용량에 따라 2-4 d에서 수확 시간이 달라 집니다. 바이러스의 각 1 세대의 1 x 105 셀을 수집 하 고, 원심은 상쾌한 삭제. 세포 DNA 추출-20 ° C에 저장 합니다. 연쇄 반응에 의해 게놈 삽입의 검출 DNA 추출에 대 한 서 리 없애다과 단계 3.2.4 버퍼를 첨 벙 첨 벙의 50 µ L에서에서 셀 펠 릿 resuspend (10 mM Tris HCl [pH 8], 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, 그리고 200 µ g/mL 가수분해 K) 30 분 동안 65 ° C에서 샘플을 lyse 고 고 다음, 가수분해 K. 비활성화를 2 분 동안 95 ° C에 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 3′ 접합 뇌관으로 (표 1) DNA 샘플의 1 µ L를 사용 하 여 수행 합니다. 각 샘플에 대 한 준비 얼음에 다음 20 µ L 반응 혼합: PCR 주인 혼합 x 2 (10 µ L), 10 µ M 업스트림 뇌관 (0.5 µ L), 10 µ M 다운스트림 뇌관 (0.5 µ L), DNA (1 µ L), 템플릿과 nuclease 무료 물 (8 µ L). 증폭 프로그램은: 95 ° C 2 분; 95 ° C 30에 대 한 s, 55 ° C 30에 대 한 s, 그리고 40 72 ° C s 35 주기; 72 ° C 1 %agarose 젤 젤 전기 이동 법에의 한 음을 증폭 제품의 7 분 부하 2 µ L에 대 한.참고: 그림 2A 3′ 접합 PCR의 대표적인 결과 대 한 참조. 4. 시스템 통해 Cre lox 형광 성 취재 원 유전자의 절단 재조합 형 바이러스에서 GFP 유전자를 제거, Cre recombinase 식 플라스 미드의 2 µ g 6 잘 플레이트에 transfect CEF 셀, 제조업체의 지시에 따라 transfection 시 약을 사용 하 여 미리. 12 h posttransfection, 액체 질소에서 재조합 형 바이러스에의 한 유리병에 서 리 없애다, 부드럽게 resuspend, transfected 세포의 각 음에 50 µ L 씨 고 하나 잘 바이러스의 동일한 금액으로 부정적인 컨트롤로 설정 합니다. 5% CO238.5 ° C에서 3 d에서 품 어. 5. 플 라크 정화 형광 활성화 된 세포 분류 정렬 하기 전에 잘 일 당 2 × 104 CEF 셀 씨 두 96 잘 접시. 정렬에 감염 된 세포를 준비 (4 단계)에서 단계 3.1 72 h 바람직합니다에 설명 된 절차를 따릅니다. CEFs와 시드 96 잘 접시로 단일 nonfluorescence 셀을 정렬 합니다. 재조합 형 바이러스 및 PCR 확인 뿌리고 5-10 단일 nonfluorescence 패 5 d postsorting, 트립 신-EDTA 3 분, 38.5 ° C에서의 50 µ L 함께 trypsinize와 resuspend 셀 문화 매체의 50 µ L를 추가 선택 합니다.참고: 그림 2B 대표 GFP 네거티브 플 라크에 대 한 참조. 2 세대로 CEFs와 미리 6 잘 플레이트의 각 음에 셀의 절반을 전달 합니다. 5 분 동안 200 x g 에서 각 클론의 나머지 세포를 원심, 상쾌한, 삭제 하 고 셀 DNA 추출에 대 한 버퍼를 첨 벙 첨 벙의 50 µ L resuspend. 3.3.2 단계에서 설명한 대로 동일한 PCR 반응 조건으로 DNA 템플렛의 1 µ L를 사용 하 여 5′ 접합 뇌관 (표 1)으로 PCR을 수행 합니다.참고: 그림 2B 5′ 접합 PCR의 대표적인 결과 참조 하십시오. PCR 결과에 따라 달라 집니다, 추가 구절 및 검증을 위한 재조합 형 HVT의 3 ~ 5 긍정적인 클론을 선택 합니다. 6입니다. 재조합 형 HVT의 확인 간접 면역 형광 분석 결과 재조합 HVT 감염 전날 105 CEFs x 2.5 시드 24-잘 접시에 단계 5.2에서에서 얻은의 두 번째 세대와 함께 CEFs를 감염. 세포 배양 매체 48 h 바람직합니다 제거 하 고 셀을 해결 하기 위해 PBS에 4 %paraformaldehyde 500 µ L를 추가. 30 분 동안 실내 온도에 격판덮개를 품 어,는 정착 액을 제거 하 고 세척 셀 레이어 3 x PBS.참고: 셀 저장할 수 있습니다이 단계에서 4 ° C에서 몇 주 동안. PBS를 제거 하 고 추가 500 µ L 0.1%의 15 분 세척 셀에 대 한 세포를 permeabilize에 Triton X-100 레이어 PBS 가진 3 배. 블로킹 버퍼 (PBS에 5% 소 세럼) 1 시간을 추가 하 여 블록 일반적인 바인딩. 1 차적인 항 체 안티 VP2 단일 클론 항 체 차단 버퍼에서 1: 200에서 닭 혈 청 HH7 또는 HVT 감염을 묽 게 하십시오, 잘, 당 200 µ L을 추가 하 고 1 h. 세척 셀 레이어 PBS 가진 3 배 대 한 실 온에서 품 어. 이차 항 체 염소 반대로 마우스 IgG 알 렉 사 568 또는 염소 항 치킨 IgG 알 렉 사 488 블로킹 버퍼에서 1: 200 희석, 잘 당 200 µ L을 추가, 1 시간, 실 온에서 품 어와 셀 3 세척 PBS와 x. 형광 현미경에서 단백질 발현을 확인 하십시오.주: 결과 얼룩이 지기 대표 VP2 그림 4 를 참조 하십시오. VP2 유전자의 시퀀싱 고 충실도 DNA 중 합 효소와 뇌관 UL45-f 1와 UL46-R1 (표 1) 전체 삽입 감지 UL45 및 UL46 intergenic 지역에 걸친 DNA 순서를 증폭. 다음 50 µ L 반응 혼합 준비: 5 µ L 10의 x Pfx 반응 혼합, 10 µ M 상류의 1.5 µ L 및 다운스트림 뇌관 믹스, 10mm dNTP 믹스의 1 µ L, 50 mM MgSO4의 1 µ L, DNA 템플렛의 1 µ L 그리고 Pfx DNA 중 합 효소의 0.5 µ L 50 µ L nuclease 무료 물 추가. 증폭 프로그램은: 95 ° C 2 분; 95 ° C 15에 대 한 s, 55 ° C 30에 대 한 s, 그리고 35 사이클에 대 일 분 68 ° C. 젤 전기 이동 법에 대 한 1 %agarose 젤에 PCR 제품의 모든 로드. 명령 다음에 DNA 젤 정화 키트의 PCR 제품을 정화. PCR 제품 (30 ng / µ L)의 10 µ L VP2 유전자의 노크에서 확인 하는 시퀀싱 회사에 보내기. 7입니다. 재조합 바이러스의 안정성 각 T25 플라스 크 바이러스 확장 하기 전에 하루에 씨 2.6 x 106 CEF 셀. 5.2; 단계에서 적어도 3 개의 긍정적인 클론을 녹여 각 T25 플라스 크에 세포/바이러스에의 한 병을 추가 합니다. 50 %cytopathic 효과 관찰 될 때까지 5% CO2 38.5 ° C에서 품 어. 세포 배양; 2 mL에 수확 다음 세대를 위해 CEF 셀 미리 새로운 T25 플라스 크를 50 µ L를 감염. 적어도 15 세대를 위한 재조합 형 바이러스를 뿌리고 계속. 각 세대 바이러스 VP2 시퀀스의 존재에 대 한 PCR 및 재조합 형 바이러스의 안정성을 평가 하기 위해 VP2 식 간접 면역 형광 분석 결과 (IFA)의 분석.