Generierung von rekombinanten aviären Herpesvirus Vektoren mit CRISPR/Cas9 gen bearbeiten

1. Vorbereitung des Cas9/gRNA Ausdruck und Spender baut Bau von Cas9/gRNA Ausdruck Plasmide Entwerfen einer gRNA Sequenz targeting intergenetischer Region zwischen UL45 und UL46 gen der HVT bereits22beschrieben. Richten Sie die Zielsequenz Reiseführer-RNA gegen HVT Genoms keine potenziellen Ziel Sequenzen im Genom HVT auszuschließen. Synthetisieren Sie und Klonen Sie die gRNA Sequenz targeting UL45/46 Region und sg-A-Sequenz von veröffentlichten Daten23 in pX459-V2 bereits22beschrieben. Überprüfen Sie die geklonten gRNA Sequenz von Sanger-Sequenzierung mit der U6-Fwd Grundierung24. Bau des Spenders plasmid Um eine Spender-Plasmid enthält die VP2 Expressionskassette getaggt mit einer abnehmbaren GFP-Reporter-Kassette zu generieren, entwerfen Oligos Spender-F und Spender-R enthält die folgenden Elemente (Abbildung 1A und Abbildung 3A): ein sg-A Zielsequenz an beiden Enden, eine PacI Seite flankiert von zwei LoxP-Sequenzen für die GFP Reporter Kassette Klonen und Exzision und zwei SfiI Standorte für das Klonen der VP2 Expressionskassette. Die Sequenz in einem pGEM-T-easy Vektor zu klonen und dann Klonen der GFP und VP2 gen-Kassetten in den resultierenden Vektor der Spender-Plasmid als pGEM-SgA-GFP-VP222generieren.Hinweis: Jeden Klonen Vektor kann verwendet werden, um Spender Plasmid zu konstruieren. Plasmid DNA-Vorbereitung Bereiten Sie Spender Plasmid und Cas9/gRNA Ausdruck Plasmid DNA mit einem kommerziellen DNA Extraktion Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. (2) CRISPR/Cas9-vermittelten Knock-in: Transfektion und Infektion Am Vortag Transfection Küken Embryos Fibroblasten (CEFs) bereiten die Transfektion/Infektion, mit 10 – Tage alten Embryonen in M199 Medium mit 5 % fetalen bovine Serum (FBS), 10 % Tryptose Phosphat Brühe, 100 U/mL Penicillin-Streptomycin, ergänzt und 0,25 µg/mL Fungizone. 1.3 x 106 Samenzellen pro Bohrloch in jede Vertiefung eine 6-Well-Platte im 2,5 mL des Mediums.Hinweis: CEF Zellen können für 3-d bei 4 ° c aufbewahrt werden Transfizieren Sie CEF Zellen (vorbereitet in Schritt 2.1) mit 0,5 µg UL45/46-gRNA, 0,5 µg von sg-A und 1 µg pGEM-SgA-GFP-VP2 über eine entsprechende Transfection Reagens gemäß den Anweisungen des Herstellers. Inkubieren Sie die Zellen für 12 h im Inkubator (bei 38,5 ° C mit 5 % CO2). 12 h Posttransfection von Cas9/gRNA und Spender Plasmide, verdünnen den HVT Virus bestand mit M199 Kulturmedium bis 1 x 105 Pfu/mL. 130 µL des verdünnten Virus in jede Vertiefung der transfizierten Zellen und ein gut von den untransfected Zellen als Negativkontrolle mit der gleichen Menge des Virus. Inkubieren Sie die transfiziert/infizierte Zellen für 3-d bei 38,5 ° C mit 5 % CO2. Führen Sie alle Verfahren, die mit der gemeinsamen Code of Practice (JCoPR) genehmigt durch die Geldgeber. 3. Ernte und Reinigung des HVT rekombinanten Virus Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung Bereiten Sie zwei 96-Well-Platten mit 2 x 104 CEF Zellen pro gut am Vortag Sortierung voreingestellt. Transfiziert/infiziert CEFs 3 d Postinfection trypsinize. Aspirieren Sie das Medium aus jedem Brunnen und spülen Sie die Zelle Blatt mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Fügen Sie 1 mL 0,05 % Trypsin-EDTA (0,48 mM) auf die Zellen im Inkubator 38,5 ° C für ca. 5 min trypsinize. Aufschwemmen Sie und übernehmen Sie die Zellen in einen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 50 µL der FBS. Zentrifuge bei 200 X g für 5 Minuten. Aufschwemmen der Zellen in 1 mL PBS mit 1 % FBS. Zählen Sie die Zellzahlen unter Verwendung einer Hemocytometer und passen Sie die Anzahl der Zellen, 1 x 106 Zellen/mL.Hinweis: Zellen können für 1-2 h auf Eis gehalten werden. Übertragen Sie die Zellen auf Polystyrol Rohr durch Schutzkappe Sieb sortieren. Sortieren Sie die einzelnen Zellen GFP in 96-Well-Platten ausgesät mit CEFs mit der Zelle Sorter nach Anweisungen des Herstellers zum Ausdruck zu bringen. Inkubieren Sie die sortierten Zellen für 5D bei 38,5 ° C mit 5 % CO2.Hinweis: Eine Passage des rekombinanten Virus kann erforderlich sein, vor dem sortieren gibt es zuviele GFP-Ausdruck Einzelzellen und einigen GFP-positiven Plaques in den ursprünglichen Brunnen. Passagierung rekombinante Viren Bereiten Sie 6-Well-Platten mit 1,3 x 106 CEF Zellen auch täglich vor der Passage ausgesät. 5D postsorting, überprüfen Sie die 96-Well-Platten unter dem Fluoreszenzmikroskop. Markieren Sie die Brunnen mit einer einzigen GFP-positiven-Plakette.Hinweis: Siehe Abbildung 2A für eine repräsentative GFP-positiven-Plakette. Trypsinize jede GFP-positiven gut mit 50 µL Trypsin-EDTA für 3 min, 50 µL Kulturmedium hinzufügen, Aufschwemmen und übertragen Sie die Zellen in einem Brunnen einer 6-Well-Platte mit CEFs. Dies wird die erste Generation der rekombinanten HVT sein. Ernten Sie die erste Generation von rekombinanten Viren 3 d später, unten ein Fläschchen jeweils in 1 mL des Einfrierens Medium mit 10 % fetalen Kälberserum (FCS), 10 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO) und 80 % Kulturmedium fixieren Sie und speichern Sie die Viren in flüssigem Stickstoff.Hinweis: Die Erntezeit variiert von 2 bis 4 d je nach Umfang und Verbreitung des Virus. Sammeln Sie 1 x 105 Zellen jeder erste Generation von Viren zu, Zentrifugieren sie und verwerfen Sie den überstand. Speichern Sie die Zellen bei-20 ° C für DNA-Extraktion. Erkennung von genomischen Einfügung durch Polymerase-Kettenreaktion Für die DNA-Extraktion, Auftauen und Aufschwemmen der Zelle Pellet aus Schritt 3.2.4 mit 50 µL Puffer anquetschen (10 mM Tris-HCl [pH 8], 1mM EDTA, 25 mM NaCl, und 200 µg/mL Proteinase K) und lösen Sie die Proben bei 65 ° C für 30 min und , dann, bei 95 ° C für 2 min, inaktivieren die Proteinase K. Führen Sie eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit Verzweigung Zündkapseln 3′ (Tabelle 1) mit 1 µL DNA-Probe. Für jede Probe bereiten die folgenden 20 µL Reaktion Mischung auf Eis: 2 x PCR Master Mix (10 µL), 10 µM upstream Primer (0,5 µL), 10 µM nachgelagerten Grundierung (0,5 µL), DNA-Vorlage (1 µL) und Nuklease-freies Wasser (8 µL). Die Verstärkung-Programm ist: 95 ° C für 2 min; 95 ° C für 30 s, 55 ° C für 30 s und 72 ° C für 40 s für 35 Zyklen; 72 ° C für 7 min. Last 2 µL der Amplifikationsprodukte zu einem Brunnen von 1 % Agarose-Gel für die Gelelektrophorese.Hinweis: Siehe Abbildung 2A für ein repräsentatives Ergebnis der Kreuzung 3′ PCR. (4) Exzision von fluoreszierenden Reporter-Gen über die Cre Lox System Um das GFP-gen aus der rekombinanten Virus entfernen, transfizieren Sie 2 µg der Cre-Rekombinase-Expressionsplasmid in der 6-Well-Platte mit CEF Zellen, mit einem Transfection Reagens nach Anweisung des Herstellers voreingestellt. 12 h Posttransfection, Auftauen einer Ampulle des rekombinanten Virus von flüssigem Stickstoff, Aufschwemmen sanft Samen 50 µL in jede Vertiefung von transfizierten Zellen und setzen einen Brunnen als Negativkontrolle mit der gleichen Menge des Virus. 3 d bei 38,5 ° c mit 5 % CO2inkubieren. (5) Plaque Reinigung Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung Samen zwei 96-Well-Platten mit 2 x 104 CEF Zellen pro gut am Vortag sortieren. Folgen Sie den Anweisungen in Schritt 3.1 72 h Postinfection (von Schritt 4) beschrieben, um die infizierten Zellen sortieren vorzubereiten. Sortieren Sie die einzelnen Nonfluorescence Zellen in 96-Well-Platten mit CEFs ausgesät. Passagierung rekombinante Viren und PCR-Bestätigung Wählen Sie 5-10 einzelne Nonfluorescence Plaques 5D postsorting, trypsinize sie mit 50 µL Trypsin-EDTA bei 38,5 ° C für 3 min und 50 µL Kulturmedium zu Aufschwemmen der Zellen hinzufügen.Hinweis: Siehe Abbildung 2B für eine repräsentative GFP-negativ-Plakette. Übergeben Sie die Hälfte der Zellen in jeder Brunnen ein 6-Well-Platte als zweite Generation mit CEFs voreingestellt. Die verbleibenden Zellen von jeder Klon bei 200 X g für 5 min Zentrifugieren, überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zellen mit 50 µL Puffer für DNA-Extraktion zu zerquetschen. Durchführen Sie PCR mit 5′ Verzweigung Zündkapseln (Tabelle 1) mit 1 µL DNA Schablone mit der gleichen Bedingung der PCR-Reaktion, wie unter Punkt 3.3.2 beschrieben.Hinweis: Siehe Abbildung 2B für ein repräsentatives Ergebnis von 5′ Kreuzung PCR. Auf der Grundlage der PCR-Ergebnisse wählen Sie drei bis fünf positive Klone von rekombinanten HVT für weitere Passagen und Verifizierung. 6. Überprüfung der rekombinanten HVT Indirekte Immunfluoreszenz-assay CEFs mit der zweiten Generation des rekombinanten erhalten HVT aus Schritt 5.2 in der 24-Well-Platte mit 2,5 x 105 CEFs am Vortag Infektion ausgesät zu infizieren. Entfernen Sie der Zelle Kulturmedium 48 h Postinfection und 500 µL 4 % Paraformaldehyd in PBS, die Zellen zu beheben. Die Platte bei Raumtemperatur für 30 min inkubieren, dann entfernen Sie das Fixiermittel und Waschen der Zellschicht 3 X mit PBS.Hinweis: Die Zellen können für mehrere Wochen bei 4 ° C bei diesem Schritt gespeichert werden. Entfernen der PBS und 500 µL von 0,1 % Triton x-100, die Zellen 15 min Waschen der Zelle permeabilize layer 3 X mit PBS. Block unspezifische Bindung durch Zugabe von blockierenden Puffer (5 % Rinderserum mit PBS-Puffer) für 1 h. Verdünnen Sie der primäre Antikörper Anti-VP2 monoklonale Antikörper infiziert HH7 oder HVT Huhn Serum bei 1: 200 in blocking-Puffer, fügen Sie 200 µL pro Bohrloch und bei Raumtemperatur inkubieren Sie für 1 Stunde waschen der Zelle Schicht 3 X mit PBS. Der Sekundärantikörper Ziege Anti-Maus IgG Alexa 568 oder Ziege Anti-Huhn IgG Alexa 488 am 1: 200 in blocking-Puffer verdünnen, fügen Sie 200 µL pro Bohrloch Inkubation bei Raumtemperatur für 1 h und waschen die Zellen 3 X mit PBS. Überprüfen Sie die Proteinexpression unter dem Fluoreszenzmikroskop.Hinweis: Siehe Abbildung 4 für einen Vertreter VP2 Färbung Ergebnis. Sequenzierung des Gens VP2 Verstärken Sie die DNA-Sequenz über die UL45 und UL46 intergenetischer Region mit High-Fidelity-DNA-Polymerase und Primer UL45 F1 und UL46-R1 (Tabelle 1) zu erkennen, das ganze einfügen. Die folgenden 50 µL Reaktion Mischung vorbereiten: 5 µL 10 X Pfx Reaktion Mix, 1,5 µL 10 µM stromaufwärts und stromabwärts Grundierung Mischung 1 µL 10 mM dNTP-Mix, 1 µL 50 mM MgSO4, 1 µL DNA Schablone und 0,5 µL Pfx DNA-Polymerase , und 50 µL Nuklease-freies Wasser hinzufügen. Die Verstärkung-Programm ist: 95 ° C für 2 min; 95 ° C für 15 s, 55 ° C für 30 s und 68 ° C für 3 min für 35 Zyklen. Laden Sie alle das PCR-Produkt um 1 % Agarosegel für die Gelelektrophorese. Reinigen Sie das PCR-Produkt entsprechend den Anweisungen eines DNA-Gel Reinigung Kit. Eine Sequenzierung Unternehmen bestätigen die Knock-in des Gens VP2 schicken Sie 10 µL des PCR-Produktes (30 ng/µL). 7. Stabilität des rekombinanten Virus 2.6 x 106 CEF Samenzellen in jedem T25 Kolben am Vortag die Virus-Erweiterung. Tauen Sie mindestens drei positive Klone aus Schritt 5.2; Fügen Sie ein Fläschchen von Zellen/Viren in jedem T25-Kolben. Inkubieren Sie bei 38,5 ° C mit 5 % CO2 , bis ein 50 % zytopathischen Effekt beobachtet. Die Zellen in 2 mL Kulturmedium zu ernten; 50 µL in eine neue T25 Kolben voreingestellt mit CEF Zellen für die nächste Generation zu infizieren. Halten Sie die rekombinante Virus Passagierung mindestens 15 Generationen. Analysieren Sie jede Generation von Viren mittels PCR für das Vorhandensein der VP2 Reihenfolge und durch indirekte Immunfluoreszenz-Assay (IFA) für VP2 Ausdruck, um die Stabilität der rekombinanten Viren untersuchen.