Expresión transitoria en Nicotiana Benthamiana las hojas para la producción de triterpeno a escala preparativa

Nota: Antes de seguir este protocolo, familiarizarse con los datos de seguridad del material para todas las sustancias utilizadas y tomar precauciones de seguridad apropiadas. Éstos incluyen pero no están limitados a: usar gafas de seguridad cuando se trabaja con el vidrio bajo vacío y el manejo de Silicagel seco en un armario del humo. También es esencial que la legislación local con respecto a trabajar con material transgénico es comprobada y observada, incluyendo siguientes apropiados procedimientos de contención. 1. generar cepas de a. tumefaciens para infiltración Nota: Aquí proporcionamos una descripción simplificada de los pasos necesarios para generar adecuados a. tumefaciens cepas de expresión transitoria. Más detalles de estos pasos son descritos por Sainsbury et al. 8. Amplificar por PCR o sintetizar la proteína codificación región del gen de interés flanqueado por secuencias attB 5′ y 3′ adecuadas para la generación de un clon de una entrada para el uso con una recombinación específica del sitio clonación protocolo18,19. Use primer avance: GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTANNNNNNNNNNNNNNNNNN, primer revés: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTANNNNNNNNNNNNNNNNNN (NNNN… = secuencia de secuencia específica). Condiciones PCR (representantes) del uso: almacenador de intermediario (25 μl, total), mezcla de reacción (x 5, 5 μl, véase Tabla de materiales), dNTPs (10 mM, 0,5 μl), primer avance (10 μm, 1,25 μl), primer revés (10 μm, 1,25 μl), plantilla de ADN (concentración variable, 50-250 ng), 0.5 μl ), Polimerasa de la DNA (2000 U/mL, 0.25 μl, véase Tabla de materiales), agua libre de nucleasas (para 25 μl). Ejecutar el termociclador como sigue: desnaturalización inicial (98 ° C, 30 s); iniciar el ciclo (98 ° C, 30 s; 45 – 72 ° C, 20 s; 72 ° C, 30 s/kb) terminar ciclo; 35 ciclos; extensión final (72 ° C, 10 minutos). Seguir una estándar recombinación específica del sitio clonación protocolo18,19 para generar un clon de entrada usando cualquier vector de entrada no basado en la kanamicina (usamos pDONR207 que está comercialmente disponible).Nota: La integridad de la copia de entrada debe ser confirmada por secuenciación, antes de usar para generar pEAQ -HT-DEST1 construcción de expresión. PEAQ -HT-DEST1 está disponible a petición del laboratorio Lomonossoff en el centro John Innes en Norwich, Reino Unido. Aislar la pEAQ -HT-DEST1 vector del clon de expresión generada en paso 1.1.3 y almacenar a-20 ° C antes de usarlo en el paso 1.3.Nota: Cualquier kit de purificación de plásmido basada en columna de giro conveniente disponible en el mercado diseñado para la extracción de plásmidos de cepas de e. coli la clonación es conveniente. Siga las instrucciones específicas de la purificación del plásmido solicitadas kit (véase Tabla de materiales). Preparar químicamente competentes a. tumefaciens para la transformación. Inocular un LB selectivo (medio de Luria-Bertani: bacto-triptona 10 g/L, 10 g/L de NaCl y 5 g/L Extracto de levadura, agar 10 g/L, pH 7.0) placa de agar (50 rifampicina μg/mL, estreptomicina 100 μg/mL), por rayas de a. tumefaciens LBA4404 de un cultivo stock de glicerol. Incubar durante una noche a 28 ° C en un incubador de pie. Sembrar 50 mL de medio LB líquido selectivo (50 rifampicina μg/mL, estreptomicina 100 de μg/mL) con una muestra de las células a. tumefaciens LBA4404 paso 1.2.1. Incubar durante una noche a 28 ° C en un incubador de agitación a 200 rpm. Enfriar la cultura del paso 1.2.2 en hielo durante 10 min y luego sedimenten las células a. tumefaciens por centrifugación a 4 ° C y 4500 x g durante 5 minutos (descarte el sobrenadante). Resuspender el precipitado de paso 1.2.3 en 1 mL de CaCl2 solución acuosa de helada de 20 mM y repetir la centrifugación del paso 1.2.3 (descarte el sobrenadante). Resuspender el precipitado de paso 1.2.4 en 1 mL de CaCl2 solución acuosa de helado 20 mM y la parte alícuota de la suspensión resultante a 50 lotes μl. Flash congelar las porciones de líquido N2 y conservar a-80 ° C antes de usarlo. Transformar el preparado a. tumefaciens LBA4404 pEAQ aislado -HT-DEST1 vector generado en el paso 1.2. Descongelar 50 μl de suspensión de a. tumefaciens generó en el paso 1.2 en el hielo e incubar con 100 \u2012 200 ng de aislados pEAQ -HT-DEST1 vector, generada en el paso 1.1, a 0 ° C durante 5 minutos. Choque de frío la suspensión se incubó de paso 1.3.1 líquido N2 30 s, luego permite a temperatura ambiente. Añadir 200 μL de medio SOC (SOC: 20 g/L bacto-triptona, extracto de levadura 5 g/L, 0,58 g/L de NaCl, 0,19 g/L de KCl, 2,03 g/L de MgCl2, sulfato de magnesio 7-hidrato de 2,46 g/L, glucosa 3,6 g/L) a la suspensión shock frío de paso 1.3.2 e incubar durante 4 h a 28 ° C en un incubador de agitación a 200 rpm. Inocular una placa de agar LB selectivo (50 rifampicina μg/mL, kanamicina de 50 μg/mL, estreptomicina 100 de μg/mL) con la cultura de la SOC de paso 1.3.3. Bien se difundió e incubar durante 3 días a 28 ° C en un incubador de pie. Inocular los 5 mL de medios selectivos de LB (50 rifampicina μg/mL, kanamicina de 50 μg/mL, estreptomicina 100 de μg/mL) con una sola Colonia de paso 1.3.4. Incubar durante una noche a 28 ° C en un incubador de agitación a 200 rpm. Añadir 200 μL de glicerol a 1 mL del cultivo líquido de paso 1.3.5, mezclar bien y guardar a-80 ° C.Nota: Esta cultura puede ser revivida para experimentos futuros por estriamiento en placas con agar LB con los antibióticos apropiados (se describe a continuación). 2. preparar suspensión de infiltración Inocular una placa de agar LB selectivo con las rayas de la cepas de a. tumefaciens de la glicerol acción culturas generadas en el paso 1. Incubar durante una noche a 28 ° C en un incubador de pie.Nota: Una cepa con tHMGR dentro de un pEAQ -HT-DEST1 vector también puede ser incluido. Individualmente inocular 50 mL de medios selectivos de LB con una muestra de cada cepa de a. tumefaciens , crecido en el paso 2.1 e incubar durante una noche a 28 ° C en un incubador de agitación a 200 rpm. Individualmente transferir las culturas 50 mL de paso 2.1.1 a 1000 mL de medios selectivos de LB (kanamicina, rifampicina 50 μg/mL, 50 μg/mL estreptomicina 100 μg/mL) e incubar durante una noche a 28 ° C en un incubador de agitación a 200 rpm. Individualmente de la pelotilla de a. tumefaciens por centrifugación (4000 x g), de las culturas líquidas generadas en el paso 2.1.2 (descarte el sobrenadante). Individualmente vuelva a suspender los pellets de paso 2.1.3 en 50 mL de tampón MMA recién preparada (Buffer de MMA: 10 mM 2-(N-morpholino)-ethanesulphonic ácido, pH 5.6 (KOH), 10 mM de MgCl2, 150 μM 3’5 ‘-dimetoxi-4’-acetofenona) e incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 1 hora. Combinar el volumen apropiado de cada suspensión de a. tumefaciens MMA (generada en paso 2.1.4) para producir un final OD600 por lo menos 0.2 para cada cepa en un volumen final total de 10 L. Añadir amortiguamiento adicional de MMA a las suspensiones combinadas generadas en el paso 2.1.5 hasta un volumen final de 1 L (uso inmediatamente en el paso 3).Nota: Es recomendable preparar un 2 L adicional de suspensión de infiltración para mantener el nivel de líquido durante el proceso de infiltración. Preparar 1 L de tampón MMA de fuerza de x 10. 3. realizar infiltración vacío Nota: Vea la figura 2 para una descripción de la construcción de aparatos de vacío de la infiltración. Uso de 5 semanas de edad las plantas de N. benthamiana en macetas de 9 cm x 9 cm para los pasos del procedimiento. Plántulas deben ser sembradas en compost de F1 (por ejemplo de Levington) y crecidas durante 2 semanas antes de ser trasladado a macetas individuales que contengan compost F2. Plantas deben cultivarse en un invernadero a 25 ° C, con 16 horas diarias de agua (uso complementario de iluminación cuando sea necesario), luz día, densidad máxima de 100 plantas/m2. Transferencia de 1 L de suspensión de infiltración generada en el paso 2 y la 1 L de 10 x buffer MMA de fuerza al baño de la infiltración, seguido por un adicional 8 L de agua. Quitar las alas desmontables de la titular de la planta a medida, introducir 4 plantas (plantas de 5 semanas de edad ver nota anterior) y vuelva a colocar las alas. Invierta el soporte y coloque encima de la bañera de infiltración con el fin de sumergir las hojas en la suspensión de la infiltración.Nota: Asegúrese de que la suspensión alcanza la superficie superior del titular de la planta. Elevar el nivel con la incorporación de la suspensión de infiltración extra si es necesario. El baño de infiltración con plantas sumergidas de transferencia a la cámara de infiltración y cierre la puerta. Compruebe que la válvula de admisión de aire esté cerrada en el infiltrado. Encienda la bomba de vacío y abrir la válvula en línea el depósito vacío seguido de válvula de admisión de vacío en la cámara de infiltración. Una vez que ha reducido la presión en la cámara de infiltración por 880 mbar, cerrar la válvula de toma de aspiración y abrir la válvula de admisión de aire. Una vez que la cámara de infiltración ha regresado a la presión atmosférica, abra la puerta y retire la bañera de infiltración. Levante el soporte de la planta hasta que las plantas no estén sumergidas en la suspensión de la infiltración, luego agitar suavemente el soporte para permitir la suspensión exceso escurr las hojas en el baño de la infiltración. Devolver el soporte a la posición vertical, quite las alas desmontables y retire las plantas. Repita los pasos 3.1.1 a 3.1.5 hasta el número deseado de plantas ha sido infiltrado. Autoclave de la suspensión de infiltración usado antes de la eliminación. Autoclave de la infiltración del baño antes de su reutilización en experimentos posteriores. Esterilizar el interior de la cámara de infiltración por limpieza con etanol al 70% y dejar al aire seco antes de su reutilización en experimentos posteriores. 4. crecer las infiltradas plantas Arreglar las plantas infiltradas desde el paso 3 a una densidad máxima de 100 plantas/m2 en un invernadero. Crecer durante 5 días a 25 ° C y 16 h / día de luz (uso complementario de iluminación cuando sea necesario) y el agua diariamente. 5. cosecha las hojas infiltradas Después de 5 días de crecimiento, la cosecha las hojas. Autoclave de residuos material vegetal, macetas y suelo antes de la eliminación. 6. secar las hojas cosechadas Nota: El procedimiento de liofilización exacto que se describe a continuación depende de la naturaleza de los aparatos de liofilización disponibles disponibles. Liofilizar las hojas recolectadas hasta que se seque. Coloque las hojas recolectadas en una bolsa polipropileno de 2 mm de espesor. Congelar las hojas cosechadas por almacenar en un congelador de-80 ° C durante 30 minutos. Perforar la bolsa con muchos pequeños orificios con un alfiler. Lugar deja bolsas congeladas en la cámara central del liofilizador. Asegúrese de que todos los frasco accesorio grifos están cerrados y luego en el liofilizador. Asegúrese el condensador alcanza menos de-50 ° C y la presión se reduce a por lo menos 0,15 mbar y luego dejar durante la noche. Apague el liofilizador y ventear el vacío abriendo un grifo de accesorio del matraz. Quitar las hojas secas de la cámara central y vaya al paso 7. 7. presión de extracción por solvente Nota: Los pasos de procedimiento se refieren al uso de un instrumento PSE comercialmente disponible (véase Tabla de materiales). Por favor refiérase a la literatura del fabricante para obtener más información sobre el funcionamiento. El instrumento lleva a cabo extracciones de 4 en paralelo. Moler las hojas secas en un polvo de curso a través de un método conveniente (por ejemplo, para la mayoría de los compuestos triterpénicos de interés utilizar un procesador de alimentos doméstico, o machacar manualmente las hojas mientras que dentro de una bolsa).Nota: Muele con un mortero y mortero con nitrógeno líquido no es generalmente necesario. Mezclar el polvo de la hoja con arena de cuarzo (\u2012 0,3 0,9 mm, 20% por volumen) en un recipiente adecuado; Esto actúa como un dispersante y mejora la eficiencia del proceso de extracción. Preparar 4 células de extracción (120 mL) para el relleno. Para ello, invertir las celdas de extracción e Inserte el filtro de fibra de vidrio, seguido por el metal de la frita y sosteniendo el tapón. Volver las células de extracción a la vertical posición y agregar una capa profunda de 1 cm de arena de cuarzo (\u2012 0,3 0,9 mm). Rellenar las celdas de extracción. Llene las celdas de extracción con el polvo de la hoja preparada generada en el paso 7.1 hasta la línea de llenado. Si es necesario, comprimir suavemente el polvo durante este proceso para facilitar la adición de una cantidad mayor en cada célula de extracción. Añadir una pequeña capa de arena de cuarzo (\u2012 0,3 0,9 mm) en la parte superior del polvo embalado e inserte el filtro de celulosa superior. Introduzca las células de extracción embalado al instrumento PSE y ejecute el método deseado. Utilice la siguiente configuración y material; Solvente: 100% acetato de etilo; temperatura: 100 ° C, presión: 130 bar. Ejecutar los siguientes 3 ciclos: ciclo 1: 0 min tiempo de retención, ciclo 2 y 3: 5 minuto espera tiempo, termina con una descarga de disolvente de 2 min y 12 min nitrógeno gas ras.Nota: Es recomendable primero optimizar el método de extracción a pequeña escala. Sin embargo, el siguiente método es a menudo suficiente para agliconas triterpeno más oxidados. El licor de cada célula de extracción puede combinarse en el mismo recipiente para recogida externa, especificando la línea de residuos como el destino de la extracción, en lugar de las líneas de la colección individual estándar. Tenga en cuenta la cantidad de solvente utilizado es dependiente en el embalaje de las celdas de extracción y la temperatura y la presión. El método anterior normalmente genera aproximadamente 800 mL de licor de extracción de 4 extracciones paralelas. Repita los pasos 7.2 a 7.3.3 hasta que todo el polvo de la hoja ha sido procesada. Concentrar el licor extracción combinada a secado mediante evaporación rotatoria bajo vacío. Busque la salida esperada (es decir, mezcla de verde oscurezca).Nota: El procedimiento exacto puede variar dependiendo el set up del evaporador rotatorio disponible. Siempre utilice gafas de protección cuando se realiza la evaporación rotatoria y compruebe cristalería por daños antes de someter a condiciones de vacío. Encienda el reciclador de refrigerador y permita que el líquido de transferencia de calor enfriar por lo menos 5 ° c. Encender el baño de agua y ajustar la temperatura a 35 º C. Transferir el licor de extracción a un matraz de evaporación (no llenar más de la mitad del volumen del frasco). Concentrar el licor batch-wise (en el mismo matraz) si el volumen total es superior a esto. Coloque el matraz de evaporación rellena en el conducto de vapor del evaporador rotatorio (seguro con un clip conjunto). Ajustar el matraz posición y ángulo, con el fin de sumergir la parte inferior tercera del matraz de evaporación en el baño de agua a un ángulo aproximado de 45 °. Iniciar el frasco girando a una velocidad que comienza a extenderse el licor de la extracción por las paredes del matraz. Asegurar se cierra el grifo de salida y comenzar a reducir la presión (con el controlador de la bomba de vacío) hasta un goteo moderado se observa entre el matraz del condensador y receptor.Nota: No permita que el licor de extracción empezar a hervir. Si esto ocurre disminuir la fuerza del vacío para llevar la destilación bajo control. Monitorear y ajustar la velocidad fuerza y giro vacío según el caso hasta que el solvente se evapora. 8. tratamiento de resina de intercambio iónico básico para la extracción de clorofilas Nota: Las cantidades indicadas en los siguientes pasos asumen una escala original de trabajo de 100 \u2012 150 plantas. Paso 8 no es adecuado para productos que contienen grupos de ácido carboxílico, o grupos funcionales que se hidroliza bajo condiciones básicas tales como esteres. Disolver el extracto crudo generado en el paso 7 en un volumen mínimo de etanol. Añadir 50 mL de granos de la resina de intercambio iónico básicas (véase Tabla de materiales) a la salida de paso 7.1.1 y agitar a temperatura ambiente durante 30 minutos.Nota: No sustituya los temblores durante el uso de aparatos de agitación. Sobrecarga magnética o mecánica agitación puede comprometer la integridad de los granos de resina. Agitación adecuada puede también convenientemente conseguirse lenta rotación del matraz de reacción en un evaporador rotatorio con vacío a presión atmosférica o desconectado. Añadir un adicional 50 mL de granos de la resina de intercambio iónico básicas cada 30 minutos hasta que la reacción ha llegado a la conclusión; los granos de la resina de intercambio iónico básicas cambia de color de rosa a verde en color, y la fase líquida cambiará de verde a anaranjado o un color marrón turbio según la escala. En caso de duda de que la reacción ha ido a la terminación, 0,5 mL del líquido de la muestra. Filtrar la muestra a través de una pequeña columna de tierra de diatomeas y observar el color del filtrado; la reacción es generalmente completa en 1,5 horas. Filtrar la mezcla de reacción a través de una columna corta de tierra de diatomeas. Realizar esto mediante filtración de vacío, o mediante una columna de cromatografía flash de vidrio con fuelles de mano para aplicar presión. Si la tasa de filtración disminuye, molestar a la parte superior de la plataforma de tierra de diatomeas con una varilla. Recoger el filtrado. Enjuagar los granos recogidos resinas con etanol, seguida por etanol: hexano 1:1 y finalmente hexano. Utilizar un volumen de enjuague suficiente para resuspender los granos en la parte superior de la columna de tierra de diatomeas. Combinar el filtrado de paso 8.4 y los enjuagues en el paso 8.5 y concentrar a sequedad mediante evaporación rotatoria bajo vacío. 9. fraccionamiento áspero inicial Nota: El siguiente método es generalmente apropiado para agliconas típico triterpeno oxidado y emplea un instrumento automatizado cromatografía flash. Consulte la literatura del fabricante para más detalles sobre la operación. Absorber el producto bruto generado en el paso 8 en grado flash gel de sílice (tamaño de poro: 60 Å, tamaño de las partículas: 35 \u2012 75 μm) para la aplicación a un cartucho de la cromatografía flash vía metodología de carga seca. Disolver el producto bruto generado en el paso 8 en un volumen mínimo de disolvente orgánico apropiado. Asegurar la completa disolución.Nota: Diclorometano con la adición de unas gotas de metanol suele ser una elección adecuada del disolvente. Destornille la parte superior de un cartucho de jeringas cromatografía flash de 100 g (véase Tabla de materiales) y retire el inserto para revelar el espacio de carga seca cabeza. Utilice el espacio principal para medir el volumen adecuado del gel de silicona para carga seca. Transfiera el volumen medido de gel de silicona para carga seca a la solución de producto crudo y eliminar el disolvente por evaporación rotatoria bajo vacío.Nota: El gel de sílice debe volver al polvo de flujo libre. Hacia el final de la evaporación proceso suave raspado se requiera liberar el gel de silicona de la parte del matraz de evaporación. Equilibrar el cartucho de la cromatografía flash de 100 g a 100 mL/min por lo menos 5 volúmenes de columna de 100% hexano, pero idealmente hasta que el contenido del cartucho esté completamente y uniformemente húmedo. El gel de sílice de cargamento seco preparado generado en el paso 9.1.3 al espacio de carga seca cabeza de cartucho equilibrado 100 g cromatografía flash, vertiendo la transferencia. Suspensión en hexano y una pipeta de boca ancha puede utilizarse para facilitar la transferencia de cualquier carga seca restante del gel de silicona. Húmedo el gel de sílice de transferir carga seca cama con 100% de hexano para extraer el aire desde el espacio de carga seca. Ejecutar el siguiente método de cromatografía: solvente [A]: hexano, solvente [B]: acetato de etilo, caudal: 100 mL/min, gradiente: 0% [B] 100% [B] más de 3000 mL, Colección: recoger todo, tamaño de fracción: 250 mL. Analizar las fracciones de cromatografía (TLC) de capa delgada8 o cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS)8y concentración a sequedad el fraction(s) que contiene el compuesto de interés mediante evaporación rotatoria bajo vacío. Realizar depuración fina aguas abajo hasta alcanzar el nivel de pureza deseado.Nota: Depuración fina descendente es enteramente compuesto específico y no es posible dar pasos estandarizados (véase la sección discusión).