Livre de calibração em Vitro quantificação da proteína Homo-oligomerização usando instrumentação comercial e livre, Open Source Software de análise de brilho
Summary
Este protocolo descreve uma abordagem livre de calibração para quantificação da proteína homo-oligomerização em vitro baseado em espectroscopia de fluorescência flutuação utilizando microscopia de luz comercial. As configurações corretas de aquisição e métodos de análise são mostrados.
Abstract
Número e o brilho é uma técnica de espectroscopia (FFS) de flutuação livre de calibração fluorescência para detectar proteínas homo-oligomerização. Pode ser empregado usando um microscópio confocal convencional equipado com detectores digitais. Um protocolo para o uso da técnica em vitro é mostrado por meio de um caso de uso, onde o número e o brilho podem ser vistos para quantificar com precisão o estado oligoméricos de FKBP12F36V mVenus-rotulados antes e após a adição da droga dimerizing AP20187. A importância de usar os parâmetros de aquisição de microscópio correto e os métodos de pré-processamento e análise de dados corretos são discutidos. Em particular, a importância da escolha de fotobranqueamento correção está estressada. Este método de baixo custo pode ser empregado para estudar interações da proteína-proteína em muitos contextos biológicos.
Introduction
Da proteína-proteína interações eu n Vitro
Tradicionalmente, cristalografia e experimentos de ressonância magnética nuclear combinados com microscopia cryo-elétron (cryoEM) são as tecnologias escolhidas para descrever com precisão a arquitetura tridimensional de proteínas e inferir sua função por examinando seus detalhes estruturais de alta resolução. Proteínas, no entanto, não são estruturas estáticas e podem se submeter a uma variedade de mudanças conformacionais e vibrações no tempo e no espaço. Eis porque estruturais informações cristalográficas ou CryoEM de dados precisa ser complementado com outras técnicas (por exemplo, simulações de dinâmica molecular e molécula técnicas): a função de uma proteína está relacionada com sua conformacional alterações e interações e esta informação não está presente em uma estrutura estática. A fim de sondar para dinâmica intra molecular, técnicas baseadas numa única molécula Forster ressonância transferência de energia (smFRET) são muito eficaz1. Essas abordagens são capazes de avaliar diferentes subpopulações de moléculas em meios complexos. Isto é muito importante, como essas mudanças são rápidas e ocorrem durante a aquisição dos dados (ou seja, nanossegundos para segundo intervalo).
Duas abordagens principais são comumente empregadas para detectar e quantificar estas mudanças: proteínas em solução e superfície-imobilização. Para a deteção de interações inter moleculares e, em particular, o processo de dimerização induzida por ligantes, smFRET nem sempre é a melhor ferramenta. Com efeito, FRET depende não só a distância (≈10 nm), mas também na orientação dos dois dipolos (doador e aceptor, χ2) e a sobreposição das emissões doador com espectros de absorção2 do aceitador, mas talvez esta última circunstância é menor importante desde que o experimentalista pode escolheu o casal certo de traste. Uma desvantagem particular do smFRET para sondar homo-dimerização provém da rotulagem da proteína de interesse: para smFRET hetero, dimerização só pode ser detectado até 50% (ou seja, hetero-FRET só será capaz de detectar o doador-aceitador e doador-aceitador homo-dímeros mas não doador-doador ou aceptor-aceitador, que é os outros 50% dos dímeros). O uso de espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) e derivados (FCCS, etc.3) para determinar as constantes de difusão de proteína e vinculação constantes em vitro é outra alternativa. Essas abordagens não são capazes de totalmente quantificar homo-dimerização ou, como no FCS um medidas concentração e difusão e o raio e a difusão coeficiente de uma partícula difusão dependem muito mal o peso molecular; por exemplo um aumento de 10 vezes o peso molecular apenas implicará uma mudança de 2,15 dobra na difusão coeficiente4. No caso de duas cores FCS ou FCCS, apenas 50% dos homo-dímeros será considerada pelo mesmo motivo acima. Abordagens mais práticas e quantitativas para detectar homo-dimerização in vitro e em vivo são homo-FRET5 e o número e o brilho (N & B)6. Dado o fato de que homo-FRET requer recuperação de instrumentação específica do anisotropy valor (ou seja, óptica elementos/analisadores para recuperar a polarização paralela e perpendicular), N & B é apresentado aqui como uma técnica favorável para detecta a proteína homo-dimerização e agregação. Pode ser empregado tanto in vitro e em vivo com uma armadilha comercial.
Número e brilho
N & B tem sido recentemente revistos7. Essa revisão focada sobre a aplicação da técnica em células vivas. Vale a pena reproduzir aqui o formalismo matemático como estas equações será aplicado aos dados coletados em vitro. Em primeiro lugar, é necessário definir alguns termos e quantidades matemáticas:
- Uma entidade é um conjunto de moléculas que são vinculados juntos.
- O brilho ε de uma entidade é o número de fótons que emite por unidade de tempo (por quadro).
- n é o número de entidades presentes.
- Para um determinado pixel ao longo de uma série de imagem, é que sua média intensidade e σ2 é a variância em sua intensidade.
Em seguida, com contagem de fótons detectores e assumindo entidades móveis e sem fundo,
onde N é o número aparente e B é o brilho aparente. Isso resulta em
Damasceno et al 8 mostrou que com equipamento analógico, um precisa de três termos de correção: o fator de S, o fundo em deslocamentoe o ruído de leitura σ02. Então, novamente, supondo que entidades móveis,
dando
Observe que a equação acima é diferente que dado em Damasceno et al 8 e uma revisão posterior. 7 em Damasceno et al a S no denominador foi omitido devido a um erro de digitação, e esse erro foi reproduzido na revisão. A equação acima é a correta. Instruções para medição S, deslocamento e σ02 – juntamente com uma explicação do seu significado – são dadas por Damasceno et al 8
Ε o brilho é proporcional ao estado oligoméricos das entidades difusão: ε será duas vezes tão grande por dímeros como para monômeros, três vezes maior para Trímeros como para monômeros, o dobro do tamanho para hexâmeros como para Trímeros e assim por diante. Desta forma, medindo o brilho ε, pode-se quantificar qualquer tipo de multimerization.
Se há uma mistura de Estados oligoméricas número de presente, e brilho não é capaz de recuperar os Estados individuais oligoméricos presentes. Esta é uma limitação da técnica.
Detrend software algoritmo e nandb
A importância de corrigir por fotobranqueamento tem sido salientada anteriormente9. Fotobranqueamento inevitavelmente ocorre durante experimentos de microscopia de luz no modo de lapso de tempo; tanto em células vivas e em vitro. Muitas abordagens têm sido descritas na literatura para corrigir para o branqueamento de7. A técnica de filtragem exponencial com escolha automática de detrending parâmetro T é o atual melhor. Ele é integrado com o livre, open source software nandb9. Com efeito, software que requer que o usuário escolher manualmente o parâmetro detrending pode levar a resultados incorretos porque esta escolha do parâmetro provavelmente será arbitrário e incorrecto. O algoritmo automático inspeciona os dados e determina o parâmetro apropriado para ele, sem a necessidade de intervenção do usuário9. Mesmo com a melhor escolha de parâmetro de suavização, detrending tem suas limitações e funciona bem apenas com fotobranqueamento porcentagens inferiores a 25%, como mostrado com simulações9. Curiosamente, quando usando a rotina detrending automática, sua precisão é tal que um pode trabalhar com valores de brilho baixo (mesmo B < 1.01) e, portanto, de baixa intensidade e ainda ser suficientemente precisas para quantificar homo-dimerização.
Fotobranqueamento também causa outro problema: a presença de fluorophores foto em um complexo de multimer. Assim, por exemplo, um trímero aparecem como um dímero quando uma das três unidades no trímero é não-fluorescente. Hur e Mueller10 mostraram como corrigir para isso e esta correção também salientou em uma posterior revisão7. O software de nandb inclui esta correção9.
A FKBP12 F36V sistema
FKBP12F36V é uma proteína que naturalmente não oligomerize, mas é conhecida por dimerizam após a adição da droga (coloquialmente conhecida como o BB dimerizing ligante)11,AP2018712. Isso torna um caso de teste ideal para número e brilho: com FKBP12F36V rotulados, uma duplicação de estado oligoméricos deve ser observada após a adição do BB.
Protocol
Representative Results
Discussion
N & B são uma técnica para detectar multimerization usando luz comercial varredura confocal microscópios equipados com detectores digitais. Esta abordagem é bastante atraente em relação ao único ponto FCS, FCCS e smFRET porque é livre de calibração e o cálculo de brilho é simples e independente de concentração6. É de grande importância, no entanto, para corrigir a flutuações de intensidade do branqueamento e a longo prazo antes de executar os cálculos de brilho…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho tem sido apoiado pela Wellcome Trust conceder 105278/Z/14/2 ao R.N. Centro Wellcome Trust de genética humana é financiado pelo Wellcome Trust núcleo prêmio 203852/Z/16/2. Trabalho no grupo C.S. é suportado pelo Cancer Research UK (C20724/A14414) e o Conselho Europeu de investigação no âmbito da União Europeia Horizonte 2020 investigação e inovação programa Grant 647278.
Materials
| RosettaTM (DE3) pLysS cells | Novagen | 70956-3 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID 329824407 | |
| Chloramphenicol | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID: 24892250 | |
| LB starter culture | QIAGEN | ||
| LB medium | QIAGEN | https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif | |
| IPTG | Sigma Aldrich | PubChem Substance ID 329815691 | |
| IMAC buffer | Medicago | 09-1010-10 | |
| EDTA-free protease inhibitors | Sigma Aldrich | 11873580001 | |
| TALON resin | Clonetech | ||
| Nickel sepharose | GE Healthcare | ||
| S200 16/60 column | GE Healthcare | ||
| Glass bottom 8 well observation dish | Ibidi | 80827 |
References
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