JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Génétique

חלבון אנדוגני תיוג-אנוש המושרה בתאי גזע Pluripotent באמצעות CRISPR/Cas9

Published: August 25, 2018
doi:
10.3791/58130
, , , , ,
1Allen Institute for Cell Science

Summary

המתוארים כאן הוא פרוטוקול עבור תיוג endogenously לידי ביטוי חלבונים עם תגי פלורסנט בתאי גזע pluripotent המושרה האנושי באמצעות CRISPR/Cas9. תאים putatively הערוך מועשרים ידי קרינה פלואורסצנטית מופעל מיון תא, שורות תאים המשובטים נוצרים.

Abstract

פרוטוקול מוצג ליצירת תאי גזע pluripotent המושרה אנושי (hiPSCs) כי חלבונים אקספרס אנדוגני דבוקה תגיות פלורסנט N – או C-מסוף במסגרת. מערכת CRISPR/Cas9 prokaryotic (קצר באופן קבוע interspaced באשכולות 9 חזרה/CRISPR-הקשורים palindromic) עשוי לשמש להציג רצף אקסוגניים גדולים לתוך לוקוסים גנומית באמצעות תיקון הומולוגיה בוים (HDR). כדי להשיג את טוק-in הרצוי, פרוטוקול זה מעסיקה את ribonucleoprotein (RNP)-המבוסס על הגישה שבה פראי סוג הפישחה ינפל תומימת סטרפטוקוקוס Cas9 חלבון, סינתטי 2-חלק ה-RNA (gRNA), הוראות פלסמיד תבנית של התורם נמסרות על התאים באמצעות אלקטרופורציה. תאים putatively הערוך לבטא את החלבונים fluorescently מתויג מועשרים ידי תא פלורסצנטיות מופעל מיון (FACS). קווים המשובטים אז נוצרות, ניתן לנתח לתוצאות עריכה מדויקת. על ידי הצגת את תג ניאון על מיקומה גנומית של הגן עניין, וכתוצאה מכך subcellular לוקליזציה של הדינמיקה של החלבון פיוז’ן שניתן ללמוד תחת שליטה תקינה אנדוגני, שיפור מפתח על-קונבנציונאלי ביטוי מערכות. השימוש hiPSCs כמערכת מודל עבור ג’ין תיוג מספק הזדמנות ללמוד את החלבונים מתויג בתאים דיפלואידי, nontransformed. מאז hiPSCs יכול להיות מובחן סוגי תאים מרובים, גישה זו מספקת את ההזדמנות ליצור וללמוד חלבונים מתויג במגוון של הקשרים הסלולר isogenic.

Introduction

השימוש של אסטרטגיות לעריכת הגנום, במיוחד CRISPR/Cas9, ללמוד תהליכים תאיים הופכת יותר ויותר נגיש ובעל ערך1,2,3,4,5, 6 , 7. אחד היישומים רבים של CRISPR/Cas9 הוא המבוא (באמצעות תיקון הומולוגיה בוים (HDR)) של רצפי אקסוגני גדולים כגון GFP לתוך לוקוסים גנומית מסוים ואז לשרת ככתבים לפעילות של מוצר גן או חלבון8 . טכניקה זו ניתן לצרף רצף החלבון הניאון מסגרת קריאה פתוחה אנדוגני איפה החלבון פיוז’ן endogenously מוסדרים וכתוצאה מכך יכול לשמש כדי להמחיש את לוקליזציה subcellular ואת הדינמיקה של החלבון עניין5 ,6,9,10,11. בעוד חלבונים מתויגות endogenously מציעים יתרונות רבים לעומת מערכות ביטוי, החדרת רצפים גדולים לתוך הגנום האנושי הוא תהליך לא יעיל בדרך כלל בדרישה בחירה או העשרה אסטרטגיה להשגת אוכלוסיה של תאים שיכולים ניתן בקלות למדה5,12.

פרוטוקול זה מתאר את ההוספה של רצף ה-DNA קידוד חלבון פלואורסצנטי (FP) לתוך לוקוס גנומית הרצוי. הפרוטוקול כולל תכנון ואספקה של פלסמיד תבנית של התורם, את ribonucleoprotein (RNP) מורכבים (חלבון פראי סוג הפישחה ינפל תומימת ס Cas9 בשילוב עם CRISPR סינתטי RNA (crRNA), טרנס-הפעלת crRNA (tracrRNA)). תיאר גם הוא העשרת של תאים putatively הערוכות באמצעות תא פלורסצנטיות מופעל מיון (FACS) ואת התהליך דור קו תא המשובטים. עד כה, נעשה שימוש בשיטה זו כדי ליצור קווים hiPSC עם monoallelic או תגיות (לעתים רחוקות) דו-allelic חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תיוג חלבונים עשרים וחמש המייצג מבנים הסלולר העיקרי. תאים הערוך המתקבלת מן המאמצים האלה אושרו לעשות ההוספה גנטי הצפוי, אקספרס של חלבון כימרי לאיתור כראוי, לשמור על pluripotency, קריוטיפ יציב12 (, נתונים שלא פורסמו). שיטה זו שימש גם להפיק מספר השני יחיד, כפול (שני חלבונים שונים מתויגים באותו התא) נערך אוכלוסיות של hiPSCs (נתונים שלא פורסמו).

IPSCs האדם נגזר מתורם בריא נבחרו למאמצים אלו לעריכת הגנום כי, בניגוד שורות תאים קונבנציונליים רבים, הן דיפלואידי, karyotypically, שאינם טרנספורמציה ויציב המקדימות. מאפיינים אלה מספקות מודל אטרקטיבי ללמוד ביולוגיה של התא הבסיסי ומודלים המחלה. יתר על כן, הפוטנציאל בידול של hiPSCs מספק הזדמנות ללמוד בשלבים התפתחותיים רבים במקביל מעבר שושלות שונות, סוגי תאים באמצעות תאים isogenic כולל organoids, רקמות, “מחלת בצלחת” מודלים13 14, ,15. בעוד פרוטוקול זה פותחה עבור hiPSCs (קו WTC), זה יכול להיות אינפורמטיבי לפיתוח פרוטוקולים באמצעות קווים בתרבית של תאים אחרים.

Protocol

1. אין סיליקו בעיצוב של crRNA, התורם תבנית פלסמיד עבור FP טוק- להשיג את רצף ההתייחסות המבואר מ NCBI16 או דפדפן הגנום UCSC17 (למשל, תבנית GenBank) של הגן עניין ולייבא אותם תוכנה ביואינפורמטיקה של בחירה. אם רצף הגנום מארח ידוע להשתלט. משתנים ביחס ההפניה, כוללים את אלה עכשיו על ידי התאמת רצף ההתייחסות בתוכנה ביואינפורמטיקה (ראה דיון). אתר את האתר הרצוי של ההכנסה FP. עבור C-מסוף תגים, הרצף עבור התג FP יוכנסו בין הבסיס האחרון של codon האחרון הבסיס הראשון של stop codon. עבור N-מסוף תיוג, הרצף עבור התג FP בדרך כלל יוכנסו בין הבסיס האחרון של codon התחל הבסיס הראשון של codon הבא. במקרים מסוימים, כגון מתי codon ההתחלה אקסון codon יחיד, או שבו רצף האות קיים חלבון בתחנה הסופית, האתר הרצוי של ההכנסה FP עשוי להיות ממוקם במיקום 3ʹ יותר, כל עוד הוא ממשיך להיות במסגרת. שימוש 50 bp בכל צד של אתר הכניסה הרצויה כמו לרצף הקלט עבור כל כלי עיצוב crRNA זמין לציבור. לאחר 2-4 crRNA מטרות מזוהים בקרבת הכניסה לאתר, להוסיף ביאורים איגוד crRNA אתרים, מוטיב protospacer סמוכים (פאם) רצפים (הגולה) בתוכנה ביואינפורמטיקה. CrRNAs אלה ישמש לזירוז מעברי נטושים כפול (ראה דיון כדי לקבל הנחיות נוספות על עיצוב crRNA).הערה: ניתן להגיש רצפים crRNA מותאם אישית עבור סינתזה עם ספק מסחרי (מומלץ), או הרצף יכול לשמש כנקודת התחלה כדי לעצב להכפלה או במבחנה סינתזה אסטרטגיה, אשר מעבר להיקף של פרוטוקול זה (ראה דיון ). ליזום את פלסמיד תבנית של התורם, להשתמש 1 kb של רצף במעלה הזרם של אתר הכניסה הרצויה כזרוע הומולוגיה 5ʹ (זה אמור לכלול את codon התחלה עבור N-מסוף הוספות) ולהשתמש 1 kb של רצף במורד הזרם של אתר הכניסה הרצויה כמו 3ʹ הומולוגיה הזרוע (זה אמור לכלול את stop codon עבור C-מסוף הוספות). בסיסים בין שתי הידיים הומולוגיה בדרך כלל מושמטים לא. כולל גרסאות ספציפיות תא קו בזרועות הומולוגיה תשמר את אלה משתנים גנטיים בתאים הערוך וכתוצאה מכך. בין שתי הידיים הומולוגיה, להוסיף את רצף FP (או רצף אחרים בטוק) ואת הרצף מקשר (ראה דיון כדי לקבל הנחיות נוספות על linkers). עבור N-מסוף תגים, הרצף מקשר (linker) צריך להיות ישירות 3ʹ של FP; עבור C-מסוף תגים, הרצף מקשר להיות ישירות 5ʹ של FP. לשבש crRNA אתרי קישור בתוך פלסמיד תבנית התורם למניעת Cas9 חיתוך של התורם רצף (ראה דיון במשך משיקולים כשאתה משנה אתרי קישור crRNA). במידת האפשר, שיבוש פאם לרצף הגולה או לנדנד היא עדיפה. לחלופין, היכרות עם מוטציות נקודה שלושת הבסיסים באזור זרע crRNA (proximal לפאם 10 בסיסים) הוא חזה מספיק לשבש איגוד crRNA. כמה אתרי קישור crRNA הם מובסים בגלל הקדמה של הרצף FP בתוך פלסמיד תבנית התורם; ודא כי לא פאם או אזור שלם מחייב עדיין קיימת במקרים אלה.הערה: ניתן להגיש סיליקו התורם תבנית פלסמיד עבור ג’ין סינתזה על ידי ספק מסחרי, או זה יכול לשמש כנקודת התחלה לתכנן אסטרטגיה שיבוט, אשר מעבר להיקף של פרוטוקול זה. שדרה פשוטים כגון pUC19 או pUC57 מספיקה. 2. ribonucleoprotein (RNP) תקנים עבור CRISPR/Cas9 מתווכת טוק ב- hiPSCs הערה: פרוטוקול זה, המונח ‘gRNA’ מתאר סינטטי crRNA ו- tracrRNA כראוי מחדש על תנאי, כימות ו pre-ומורכבת לפי הוראות היצרן (ראה טבלה של חומרים). תוספת של כל אמצעי התקשורת עם 1% פניצילין סטרפטומיצין. הנחיות כלליות culturing של הקו hiPSC WTC מתוארים לפרטי פרטים אלן תא Explorer18,19. WTC hiPSCs משמשים פרוטוקול זה, אך עם אופטימיזציה נכונה תרביות תאים, אלקטרופורציה של RNP, התורם תבנית פלסמיד עשוי להיות מותאם בהצלחה על סוגי תאים אחרים. הכינו 10 מיקרומטר מניות עבודה של gRNA, פראי סוג הפישחה ינפל תומימת ס Cas9 חלבון2,20; לשמור על הקרח. להכין 1 µg/µL עובד מלאי של התורם תבנית פלסמיד; לשמור בטמפרטורת החדר (RT). השתמש pH 8.0 טה מאגר דילולים כל. להכין צלחת תרביות רקמה של 6-ובכן מצופים מטריצה עם 5 מ של מדיה צמיחה טרי בתוספת 10 מעכב רוק מיקרומטר (Ri) לכל טוב. לשמור צלחת עם מדיה בחממה ב- 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 עד מוכן לתאים צלחת לאחר ההליך תרביות תאים (מקסימום 2 h).הערה: כל הצלחות מצופים מטריצה בשימוש פרוטוקול זה נעשים על-ידי הוספת שנפח של Matrigel קר כקרח בדילול 1:30 בתקשורת DMEM/F12 קר על פי מכון אלן עבור הפרוטוקול של התא המדע עבור culturing WTC hiPSC קו19. באמצעות ריאגנט דיסוציאציה תא בודד עדין כמומלץ טבלה של חומרים, מעבר hiPSCs לתוך תא בודד הבולם, ספירת תאים באמצעות מונה תא אוטומטית, או hemocytometer.הערה: פרוטוקול מפורט עבור שורת hiPSC WTC המשמש כאן ניתן למצוא את אלן תא Explorer19. בקצרה, לשטוף את התאים פעם אחת עם RT DPBS, להתייחס עם ריאגנט דיסוציאציה למשך 3-5 דקות. ואז triturate תאים לתוך תא בודד השעיה על ידי עדינה pipetting צנפה על ידי צנטריפוגה. Resuspend בגדר תא חי בתקשורת גדילה בתוספת 10 מיקרומטר Ri. להכין aliquot של 1.84 x 106 תאים עבור כל תנאי הניסוי להיות transfected צינורות mL 1.5 נפרדים.הערה: כל אמצעי האחסון מחושבות עבור אמצעי אחסון התגובה הכולל 4.5 µL באמצעי אחסון אלקטרופורציה 100 µL, פי 2.3 תגובות. זה חשבונות עבור תקנים כפולים, עודף לטעויות pipetting. להכין ribonucleoprotein טורפדו מורכבים (RNP) עבור כל תנאי הניסוי על-ידי הוספת 2.88 µL של 10 מיקרומטר gRNA µL 2.88 של 10 מיקרומטר Cas9 על צינור 1.5 מ ל. דגירה-RT למשך תקופה מינימלית של 10 דקות (מקסימום 1h). גלולה אחת תא aliquot (להכין בשלב 2.3.1) ב g x 211 למשך 3 דקות על תגובת שיקוע RT. וביופסיה, resuspend תא גלולה ב 220 µL מאגר אלקטרופורציה של היצרן. הוסף µL 220 של תאים resuspended הצעד 2.5 1.5 mL RNP הצינור מורכבים מוכן בשלב 2.4. להוסיף µL 4.60 של התורם µg/µL 1 תבנית פלסמיד הצינור 1.5 mL מוכן בשלב 2.4. השתמש nucleofection עצה פיפטה כדי לערבב את תוכן צינור 2 – 3 פעמים, ולאחר מכן להעביר µL 100 של השעיה המכשיר אלקטרופורציה מוכן. להימנע מהחדרה בועות בקצה. החל 1300 V 1 הדופק של 30 ms. בעדינות העבר התליה המשקולת 6-ובכן מוכן מהשלב 2.2 עם תנועה מתערבל. לפזר תאים על-ידי הזזת בעדינות את הצלחת מצד לצד, הכניסה אל גב. באמצעות טיפ nucleofection חדש, חזור על שלבים 2.8 2.9 עם µL 100 הנותרים של השעיה והעברה לבאר השני של צלחת 6-ובכן מוכן. חזור על הצעדים 2.4 דרך 2.10 כל gRNA התורם תבנית פלסמיד שילוב, כולל gRNA ללא פילוח, התורם תבנית פלסמיד רק מאגר רק שולטת. לטפל כדי לשנות פיפטה ו- nucleofection טיפים למניעת זיהום צולב. דגירה transfected תאים-CO 37 ° C ו-5%2. לשנות את המדיה למדיה צמיחה רגיל (לא Ri) ב 24 שעות ולהמשיך להאכיל hiPSCs כל 24 שעות ביממה עבור h 72-96, ניטור confluency. כאשר hiPSCs מגיעים למפגש 60-80%, המשך לשלב 3.הערה: מוות תאי כבד (> 70%, העריך) הוא נורמלי 24-48 שעות לאחר תרביות תאים. 3. FACS-העשרה של Putatively נערך hiPSCs הערה: בעת מיון תאי גזע, להתאים את הגדרות המכשיר כדי לקדם את הישרדות cell כפי שהוצע בדיון. בקצרה, להשתמש הגדול הזרבובית אפשרי (130 מיקרומטר), נמוך, קצב הזרימה (≤ 24 µL/דקה), נוזל הנרתיק ללא חומר משמר (כגון תמיסת מלח, ראה טבלה של חומרים), ואת הלחץ מדגם נמוך (10 psi). לפני תחילת ניסוי FACS, לשנות מדיה למדיה גדילה בתוספת 10 מיקרומטר Ri, דגירה תאים-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עבור 2-4 h כדי לקדם את ההישרדות לאחר FACS. באמצעות ריאגנט דיסוציאציה תא בודד עדין כמומלץ טבלה של חומרים, מעבר hiPSCs אל תא בודד ההשעיה בתקשורת גדילה בתוספת 10 מיקרומטר Ri19. ינוע hiPSC ההשעיה 35 מיקרומטר רשתי למסננים לתוך צינורות להטלטל סיבוב פוליסטירן. מיין תאים באמצעות פיזור קדימה ופיזור צד (לרבות גובה לעומת רוחב) כדי לא לכלול פסולת ו- doublets. שימוש בשידור חי, מאגר רק לשלוט תאים כדי להגדיר שער FP-חיוביים, כך < 0.1% של תאים בלבד מאגר ליפול בתוך השער. סוג האוכלוסייה של FP-חיוביות תאים לתוך צינור פוליפרופילן 1.5-15 מ ל המכילה 0.5-2 מ”ל של RT צמיחה מדיה בתוספת 10 מיקרומטר Ri.הערה: פוליפרופילן מפחית את פוטנציאל התא אדהזיה על הפלסטיק. צנטריפוגה התאים שנאספו ב g 211 x למשך 3 דקות ב- RT. בזהירות תשאף תגובת שיקוע, resuspend תא גלולה ב 200 µL של צמיחה מדיה בתוספת 10 מיקרומטר Ri. העברת תאים ממוינים עד 3,000 טוב יחיד של צלחת 96-ובכן מצופים מטריצה טריים19.הערה: בהתקנת מכשיר המתאים, התאים ניתן גם למיין (בכמויות) ישירות לבאר בודדת של צלחת תרביות רקמה של 96-ובכן מצופים מטריצה המכילה 200 µL של צמיחה מדיה בתוספת 10 מיקרומטר Ri-צפיפות המומלצת של 1,000-3,000 תאים לכל טוב עבור hiPSC. דגירה תאים ממוינים-CO 37 ° C ו-5%2. לשנות את המדיה מדיה גדילה בתוספת 5 מיקרומטר רי ב 24 שעות. ב 48 שעות מתחילים להאכיל תאים צמיחה קבוע מדיה (אין Ri) כל 24 שעות ביממה עבור h 72-96, ניטור confluency. הישרדות לאחר FACS מוערך גדול מ-50% אם מינימום 500 תאים הם נזרע בבאר אחת של צלחת 96-ובכן. מתי hiPSCs להגיע למפגש 60-80% ולהראות בוגרת מורפולוגיה (מושבה חלקה, ארוזה היטב מרכזי), מעבר לתוך צלחת בתבנית גדולה יותר כגון צלחת 24-ובכן, לאחר מכן מתוך צלחת 24-ובכן לתוך צלחת 6-. טוב. כאשר hiPSCs בצלחת 6-טוב להגיע למפגש 60-80% ולהראות בוגרת מורפולוגיה, להרחיב את צלחת 100 מ מ, לוחית רישוי מחדש עבור הדמיה, cryopreserve או זרע-שיבוט האיסוף צפיפות (שלב 4)19. 4. יצירת Putatively קווים hiPSC נערך המשובטים באמצעות ריאגנט דיסוציאציה תא בודד עדין כמומלץ טבלה של חומרים, מעבר hiPSCs אל תא בודד ההשעיה וקבע את מספר התאים לכל מ ל19. תאי זרע 10,000 באוכלוסייה הערוך של hiPSCs על גבי צלחת תרביות רקמה טריים מצופים מטריצה 100 מ”מ באמצעות מדיה גדילה בתוספת 10 מיקרומטר Ri19. לשנות את התקשורת למדיה צמיחה בלי Ri 24 שעות לאחר זריעה, להאכיל את hiPSCs עם צמיחה טריים מדיה בכל 24 שעות ביממה במשך 5-7 ימים. כאשר hiPSCs הקימו מושבות הגלויים בעין בלתי מזוינת (כ-500 מיקרומטר) הם גדולים מספיק כדי להיות מבודדים. להכין צלחת 96-ובכן מצופים מטריצה על-ידי כ רפה בעברית מטריקס עודף והוספת µL 100 של צמיחה מדיה בתוספת 10 מיקרומטר Ri לכל טוב19. פיפטה לשימוש P-200 מיקרוסקופ ויבתר, או דומה, לגרד ובעדינות תשאף מושבות בודדות מהמשטח צלחת. העברת אמצעי אחסון (~ 20-100 µL) המכילה את המושבה לבאר בודדת של צלחת 96-ובכן מוכן בשלב 4.3. לאחר כל המושבות הועברו, דגירה על צלחת חממה תרביות רקמה-CO 37˚C ו-5%2. לשנות את המדיה למדיה צמיחה רגיל (לא Ri) ב 24 שעות ולהמשיך לאכול תאים בכל 24 שעות ביממה עבור h 72-96 עד מושבות שולש בגודל (בערך 1500 מיקרומטר).הערה: איסוף 24-96 מושבות לכל crRNA בשימוש של תרביות תאים מומלץ. הישרדות של שיבוטים מבודד הוא בדרך כלל יותר מ 95%. באמצעות ריאגנט דיסוציאציה תא בודד עדין כמומלץ טבלה של חומרים, מעבר hiPSC שיבוטים לתוך צלחת 96-ובכן חדשה מצופים מטריצה כדלקמן19. באמצעות העצמות של ערוץ 8, להסיר ולמחוק את המדיה מן העמודה הראשונה של צלחת 96-ובכן. באמצעות פיפטה רב-ערוצי P-200, להוסיף העמודה הראשונה של צלחת 96-ובכן לשטוף את התאים ~ 200 µL של DPBS. באמצעות העצמות של ערוץ 8, להסיר ולמחוק DPBS שטיפת מהעמודה הראשונה של צלחת 96-ובכן. באמצעות פיפטה רב-ערוצי P-200, להוסיף µL 40 של דיסוציאציה ריאגנט העמודה הראשונה של צלחת 96-ובכן. חזור על צעדים 4.5.1-4.5.3 עבור עד סך של שישה טורים של צלחת 96-ובכן, שינוי טיפים כדי להיות בטוח לא קרוס-לזהם בארות. מקם את הצלחת בחממה 37 º C למשך 3-5 דקות מרגע שהכימית דיסוציאציה נוספה העמודה הראשונה (שלב 4.5.3).הערה: מומלץ המעבר היחיד לכל היותר שש עמודות (48 וולס) במועד בשל הזמן שלוקח לבצע שלבים אלה. בעת ביצוע פרוטוקול זה בפעם הראשונה, להתחיל עם passaging רק עמודה אחת או שתיים בכל פעם. הגבלת מספר עמודות passaged בבת אחת מבטיחה כי התאים הם לא משאירים הכימית דיסוציאציה יותר מדי זמן, אשר מזיקים hiPSCs. כאשר התאים בעמודה הראשונה של הצלחת החלו תמריא בתחתית צלחת, להשתמש פיפטה רב-ערוצי P-200 כדי להוסיף 160 µL של DPBS העמודה הראשונה של צלחת 96-ובכן, בעדינות triturate התאים “12:00” , “3:00”, “6”, ל “9:00” העמדות של כל טוב. להעביר את כל נפח התא ההשעיה (200 µL) צלחת V-התחתון 96-ובכן. חזור על שלב 4.5.5 עבור העמודות הנותרים של תאי יש דיסוציאציה ריאגנט בהן; לשנות טיפים כדי לא לחצות-וולס. ספין צלחת V-התחתון ומפרידה ב 385 x g למשך 3 דקות ב- RT. באמצעות פיפטה רב-ערוצי P-200, הסר בעדינות את תגובת שיקוע, resuspend תאים µL 200 של מדיה צמיחה טרי בתוספת 10 מיקרומטר Ri לכל טוב. חזור על כל בארות, שינוי טיפים כדי לא קרוס. העברת כל של התליה תא טריים מצופים מטריצה 96-ובכן צלחת19. דגירה על צלחת חממה תרביות רקמה-CO 37 ° C ו-5%2. לשנות את המדיה למדיה צמיחה רגיל (לא Ri) ב 24 שעות ולהמשיך לאכול תאים בכל 24 שעות ביממה במשך 72-96 שעות, עד הרוב המכריע של שיבוטים להגיע למפגש 60-80%.הערה: קטע זה מסייע לפרוס את התאים ולאפשר צמיחה נוסף על השטח כולו של צלחת 96-ובכן. להתבונן שיבוטים ולזהות יחס פיצול המתאימה עבור כל המשובטים בודדים בצלחת 96-ובכן (למשל, 1:10 או 1:8). באמצעות ריאגנט עדין דיסוציאציה תא בודד כפי שהוצע ב טבלה של חומרים, מעבר hiPSC שיבוטים לתוך מצופים מטריצה 96-ובכן צלחת חדשה (צעדים 4.5.1-4.5.8) העברת יחס של המתלה התא המתאים עבור כל המשובטים. דגירה על צלחת חממה תרביות רקמה-CO 37˚C ו-5%2. לשנות את המדיה למדיה צמיחה רגיל (לא Ri) ב 24 שעות ולהמשיך לאכול תאים בכל 24 שעות ביממה במשך 72-96 שעות, עד הרוב המכריע של שיבוטים להגיע למפגש 60-80%, ולהראות מורפולוגיה בשלה.הערה: כל המשובטים ייתכן יחס שונה מפוצל בגלל קצב הצמיחה שונה במקצת או הישרדות מן המעבר הקודם, אז מעבר זה מסייע לנרמל את מספר התאים לכל טוב של כל המשובטים לשלב ההקפאה לעקוב. בשל שיעור משתנה של הישרדות וצמיחה, כמה שיבוטים והדבר או להיכשל לגדול בתקופות אלה passaging צעדים. שמור את השארית של התא ההשעיה, גלולה לבידוד gDNA על ידי תאים צריך שתוציאו בצלחת התחתונה V 96-ובכן ב 385 x g למשך 3 דקות על הסרת RT. supernatant להמשיך gDNA בידוד באמצעות ערכת 96-ובכן, או לאחסן צלחת של תאים מגורען בטמפרטורה – 20 ˚ c עבור עד חמישי שבועות הנדסת חשמל. 5. הקפאה קריוגנית של שורות תאים המשובטים בתבנית צלחת 96-ובכן באמצעות תגובה כימית בתא יחיד דיסוציאציה, המעבר שיבוטים hiPSC תיאר כאמור (צעדים 4.5.1-4.5.7). וארוקן את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה רב-ערוצי P-200 והשהה מחדש ב- 60 µL של צמיחה מדיה בתוספת 10 מיקרומטר Ri. חזור על כל בארות; לשנות טיפים כדי לא קרוס. להעביר 30 µL של התא השעיה צלחת מטריצה שאינו מצופה 96-ובכן תרביות רקמה. ואז להוסיף במהירות 170 µL קפוא מאגר (ראה טבלה של חומרים) על כל טוב, ללא ערבוב. אני חוזר על ידי העברת את µL 30 הנותרים של השעיה לתוך אחות צלחת והוספת µL 170 קפוא מאגר.הערה: תהליך זה נעשית אחות כפולים צלחות כך קיימת אוכלוסיה גיבוי של תאים לאחר מפשיר באחד הלוחות בודדים. מכניסים תאים cryopreserved רק כל עוד עמודות של צלחת 96-ובכן מאפשר מפשיר מהר יותר (שלב 5.6). לעטוף את צלחת עם מצלמות-מיקרוסקופים ומניחים בתוך קופסת קלקר RT עם מכסה. הצב את תיבת כל במקפיא-80 ° C. לאחר 24 שעות צלחות יכולים להיות מועברים מהקופסה קלקר ומאוחסנים ב- 80˚C עד ארבעה שבועות.הערה: התאים מאוחסנים באופן זמני ב-80 מעלות צלזיוס, בקרת איכות גנטית מבחני ניתן לבצע את gDNA שנקטפו מתאי שהושג בשלב 4.6.1 כדי לזהות את השיכפולים להפשיר, להפיץ הלאה, כמתואר בעבודה שפורסמו בעבר 12. בקצרה, העתק מספר droplet דיגיטלי PCR assay יכול לשמש כדי לזהות שיבוטים המכילים אחד או שני עותקים של ה-GFP ושילוב לא תורם תבנית פלסמיד המרכזי (backbone). שילוב של מבחני ה-PCR מובילים והוא יכול רצף סנגר ואז לזהות שיבוטים המכילים של הוספה מדויק. להפשיר, להביא את הצלחת כולה 37 מעלות צלזיוס חממה תרביות רקמה, צופה בזהירות כדורי קרח להמיס. וולס בקצה של הצלחת נוטים להפשיר קודם. כאשר בגדר קרח של שיבוט הרצוי נמס, בעדינות להעביר µL 200 כל צינור חרוטי 15 מ”ל המכיל 3 מ”ל של RT צמיחה מדיה בתוספת 10 מיקרומטר רי ו צנטריפוגה ב 211 x g למשך 3 דקות ב- RT. האחות תגובת שיקוע, resuspend מגורען בתאים 1 מ”ל של RT צמיחה מדיה בתוספת 10 מיקרומטר Ri. להעביר את צלחת 24-ובכן טרי מצופים מטריצה, דגירה-CO 37˚C ו-5%2. לשנות את המדיה למדיה צמיחה רגיל (לא Ri) ב 24 שעות ולהמשיך לאכול תאים בכל 24 שעות ביממה עבור h 72-96 עד השיבוט מגיע ל- 60-80% confluency ויש מורפולוגיה בשלה19.

Representative Results

המטרה של הניסוי הזה היה שתתיך mEGFP (GFP משופרת monomeric) החלבון B1 מיטל זהר גרעינית על ידי החדרת את רצף mEGFP עד הסוף 5ʹ של הגן LMNB1 (קצה אמיני של החלבון). מקשר (חומצת אמינו רצף SGLRSRAQAS) נבחרה בהתבסס על הקודם cDNA בונה מייקל דוידסון אוסף החלבון הניאון21. כי האזור crRNA מחייב פלסמיד תבנית התורם עבור כל מועמד crRNA הופרעו לאחר ההוספה סיליקו mEGFP ואת הרצף מקשר, אין מוטציות נקודה צריכה להתבצע כדי לשבש את המחשוף מאת והכרה פוטנציאליים crRNA Cas9 של הרצף התורם (איור 1). הרצף התורם הכיל 1 kb הומולוגיה זרועות איגוף בשני הקצוות של הרצף mEGFP-מקשר. 2,734 וכתוצאה מכך bp של ה-DNA היה משובטים לתוך עמוד השדרה pUC57, רצף אומתה, וטיהרו פלסמיד תבנית וכתוצאה מכך התורם היה שימוש של הכנה ללא אנדוטוקסין maxi. התורם תבנית פלסמיד ואת RNP מורכבים היו transfected, תאים putatively הערוך היו מועשר, הלוקליזציה של חלבון כימרי B1 מיטל זהר גרעיני mEGFP אושרה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ (איור 2). רק תוצאות תרביות תאים crRNA1 מתוארים כאן, למרות שני רצפים crRNA המיוצר אוכלוסיות הערוך putatively12. בהשוואה הפקד שליליים, אשר הכיל אין gRNA, Cas9 חלבון או תורם פלסמיד תבנית בהתגובה אלקטרופורציה (מאגר בלבד), את crRNA1 LMNB1 transfected התאים הכלולים 0.95% תאים mEGFP-חיוביות המייצג את הערוך putatively mEGFP גרעיני מיטל זהר B1 אוכלוסייה (איור 3 א). תוצאה זו היה בטווח של טוק-אין יעילות שנצפה על-פני לוקוסים גנומית רבים באמצעות שיטה זו, כפי שדווחה בעבר12. התאים mEGFP-חיוביות היו מבודדים על ידי FACS, עם תמונה על ידי מיקרוסקופ בשידור חי כדי לאשר לוקליזציה הצפוי של גרעיני mEGFP מיטל זהר B1 פיוז’ן החלבון על המעטפה גרעיני. לאחר FACS-העשרה, כ- 90% של תאים ממוינים מהאוכלוסייה crRNA1 LMNB1 היו mEGFP-חיוביות (כפי שנקבע על ידי מיקרוסקופ), מציע את זה כמה תאים mEGFP-שלילי שיתוף טיהור עם תאי ה-GFP-חיוביות במהלך ההליך מיון. זה היה רמת העשרה מותרים עבור איסוף של שיבוטים 96 שהקרין יכול אז להיות גנטית לצורך עריכה מוצלחת. באופן כללי, ניתוק העשרה מוצלח הוא 50% חיובי GFP. הרוב המכריע של האוכלוסייה הסלולרי ממויינת מוצגים פלורסצנטיות מעטפת הגרעין (הגרעין לפריפריה) בתאים nondividing הנדן גרעיני המורחבת בתוך הציטופלסמה במהלך מיטוזה מתן אמון הנכון גנומית לערוך LMNB1 לוקוס. האוכלוסייה מועשר הכיל תאים עם אות או בהירים או עמום. ההבדל בעוצמת האות ומשקפים שילוב של נכונות ושגויות עריכה תוצאות והדגשים השירות של יצירת קו המשובטים המאומת גנטית נוספת מחקרים (ראה דיון) (איור 3b)12. אחרי דור קו המשובטים, גנטית לאמת תאים הראתה עוצמת GFP אחיד בניסויים מיקרוסקופ (איור 3 c). איור 1 . עיצוב אסטרטגיה עבור אמיני GFP תיוג של ג’ין LMNB1. תג ה-GFP תוכנן עבור N-מסוף 5ʹ ההכנסה של אקסון הראשון של LMNB1 הממוקם על כרומוזום 5. הומולוגיה הן 5ʹ והן 3ʹ זרועות הינם 1 kb כל הפגישה בין codon את ההתחלה (ATG) את codon השני (הומולוגיה נשק באופן חלקי בלבד מיוצג באיור). שני המועמדים crRNAs תוכננו כדי להנחות Cas9 כדי לדבוק קרוב האתר ההכנסה המיועדת ככל האפשר, תוך שהם עדיין ייחודי הגנום. רצף mEGFP, מקשר של חומצת אמינו היו שנוסף רק 3ʹ של codon ההתחלה (רצף mEGFP, מקשר רציני). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 2 . זרימת עבודה להפקת endogenously מתויג קווים המשובטים hiPSC. רכיבים תרביות תאים, כולל המתחם RNP Cas9/crRNA/tracrRNA (מוצג חלבון Cas9 אדום עם crRNA זהב, סגול tracrRNA), התורם תבנית פלסמיד המכיל את הזרועות הומולוגיה (משמשת, המוצגים באותיות זהב), ו- FP + מקשר רצף (ראה ירוק), היו electroporated. אחרי ארבעה ימים, התאים FP-חיוביות putatively נערך היו מועשרים FACS מורחבת כאוכלוסייה על ידי זריעה כל התאים ממוינים לבאר בודדת של צלחת 96-ובכן (~ 1,000 תאים) ואת מכן התרחבה בתרבות עד אוכלוסיה עבודה של כמה מיליונים יכול להיות לבדיקה תאים כמו “האוכלוסייה מועשר” (ראה פרוטוקול שלב 3.8). התשואה של תאים FP-חיוביות בהפרש של הניסוי עקב תעריפים משתנים של HDR12; העשרה מוצלחת בדרך כלל עשוי לכלול ~ 300-5,000 תאים לאחר תקנים של 1.6 x 106 תאים הירכיים. מחקרי הדמיה ראשוני אישר את האות ולוקליזציה של החלבון פיוז’ן באוכלוסייה מועשר. המושבות היו לבחור באופן ידני לתוך צלחת 96-ובכן הרחבה, הקפאה קריוגנית. עוד גנומית בקרת איכות ההקרנה באמצעות droplet דיגיטלי PCR (ddPCR), מבחני אחרים מבוססי ה-PCR שימש אז כדי לזהות כראוי הערוך שיבוטים, כמו שתואר לעיל12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3 . העשרה של אוכלוסיות הערוך putatively תא. (A) cytometry זרימה חלקות LMNB1 לערוך תאים ארבעה ימים שלאחר תרביות תאים. ציר ה-y מציגה GFP בעוצמה ומציגה ציר x פיזור קדימה. מיון השערים נקבעו בהתבסס על הפקד מאגר בלבד. מאז hiPSCs רגישים ההפרעות, חי/מת הכתם הושמט, שער FSC/האס מאוד שמרן שימש במקום. (B) לאחר העשרה, אוכלוסיית LMNB1 Cr1 לערוך תאים הראה ~ 90% של תאים עם GFP לוקליזציה על המעטפה גרעיני (לוקליזציה LMNB1 הצפוי). האוכלוסייה המוכלים בתאים שונים GFP, בעוצמות שונות, כמו גם כמה תאים GFP-שלילי. גודל ברים הם 10 מיקרון. (ג) אחרי קו המשובטים דור, תאים הראתה עוצמת GFP אחיד, עם כמה הבדלים התלויים של מחזור התא. סולם בר הוא 20 מיקרון.

Discussion

השיטה המוצגת כאן עבור יצירת endogenously מוסדר חלבון פלואורסצנטי fusions ב hiPSCs היא גישה צדדי ורב עוצמה ליצירת שורות תאים ג’ין נערך עם יישומים ועד תא חי הדמיה תפקודית מחקרים שונים ” מודלים מחלת בצלחת”באמצעות hiPSC החולה-derived קווים13,14,15. כאשר נעשה שימוש בשיטה זו כדי להציג תגיות FP גדולים N – או קצה קרבוקסילי של חלבונים אנדוגני, פוטנציאל ניתן לנצל אותה כדי להציג תגיות או קטן שינויים גנטיים אחרים מודל או הנכון גורמי מחלות מוטציות22,23 . עבור מוסיף קטנות יותר, בגודל של הזרוע הומולוגיה עשוי להצטמצם, אך שהגישה הכללית עריכה הציג בשיטה זו עדיין עשויות לחול24,25. בזמן השימוש hiPSCs מומלץ עבור השירות העצום שלהם, עם אופטימיזציה זהירה, פרוטוקול זה שעשוי להיות מותאם כדי לערוך את הגנום של קווים בתרבית של תאים אחרים.

בשעת זיהוי הגן עניין לתיוג FP, התעתיק שפע הערכות (מתוך microarray או נתונים RNA-Seq) הם נקודת התחלה טובה עבור הערכת אם מצאה ביטוי של גנים או isoform של עניין, למרות רמות תעתיק לא תמיד לתאם עם רמות חלבון. האסטרטגיה FACS-העשרה המתוארים כאן שישתלבו בצורה הטובה ביותר את הגנים באים לידי ביטוי לפחות בצורה מתונה גם בסוג התא עניין. אסטרטגיה זו הצליחה גם בבחירת עבור fusions המציגים לוקליזציה punctate ו/או דיסקרטית דפוסי כגון centrin, desmoplakin ו- paxillin איפה האות רקע יחס נמוך מאוד12,19. הגנים אינם מבוטאים מאוד או באים לידי ביטוי רק סוגי תאים נגזרות עשויים לדרוש אסטרטגיות נוספים לבחירה.

נקודת המוצא crRNA התורם תבנית פלסמיד עיצובים בשימוש שורות תאים אנושיים צריך להיות הגנום האנושי הפניה (GRCh38). כי הגנום של שורות תאים שונים יכול להשתנות בתוך מאותו המין, מכיוון CRISPR/Cas9 הוא רצף ספציפי, זה עוזר מאוד לזיהוי. גרסאות ספציפי לשורה תא (פולימורפיזמים נוקלאוטיד יחיד או הוספות/מחיקות (indels)) זה שונה מן הגנום הפניה ולשלב אלה על עיצוב. פעולה זו מבטיחה כי crRNAs יהיה תואם הגנום מארח ואת הזרועות הומולוגיה התורם פלסמיד תבנית ישמרו כל גרסאות ספציפיות של התא-קו. אסטרטגיה המוצע נועד לשלב גרסאות homozygous crRNAs ושל התורמים של הזרועות הומולוגיה של תבנית פלסמיד במהלך תהליך העיצוב. שילוב גרסאות משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים היא אופציונלית. ריאגנטים ספציפיים ניסויים בטוק גדול והוא עוד שיקולים מרכזיים עבור פרוטוקול זה נדונים להלן.

Cas9 חלבון

היתרון העיקרי של שימוש Cas9 חלבון זה מציגה את Cas9 ואת gRNA כמו RNP מורכבים הוכח לגרום מוגבל משך של פעילות נוקלאז לעומת גישות מבוססות פלסמיד שבו הביטוי של Cas9, gRNA עשוי להמשיך ימים ולהוביל ל גדול יותר בהנחה-ויעד פעילות26,27. יתרון נוסף של שימוש Cas9 חלבון היא שזה זמין קליב פעם אחת בתוך התאים. זה מנוגד קונבנציונליים יותר שיטות של שימוש Cas9 mRNA או Cas9/gRNA פלסמיד הדורשים תמלול, תרגום, חלבון עיבוד26,28. Wildtype Cas9 הפישחה ינפל תומימת ס חלבון זמין כעת ממקורות מסחריים רבים.

מדריך ה-RNA

ישנם כלים רבים בציבור למציאת מטרות crRNA ליד האתר הרצוי של ההכנסה FP שיש אפס או מספר החזוי את המטרות המארח הגנום29,30,31,32. יעילות HDR ו דיוק התוצאה HDR משתנים בצורה משמעותית בין היעדים crRNA בשימוש של לוקוס נתון12. מסיבה זו, בדיקת מספר crRNAs (2-4, רצוי במרחק 50 bp של אתר הכניסה הרצויה) לכל לוקוס זה מומלץ כי הדבר עשוי להגדיל את ההסתברות של עריכת ניסוי יירוט מוצלח. האפשרויות הנוכחיות להעברת gRNA לכלול סינתטי 2-חלק crRNA, tracrRNA, gRNAs יחיד סינתטי (sgRNAs), במבחנה עיבד sgRNAs, או העברה של פלסמיד לתאים לבטא את sgRNA של מקדם U6. פרוטוקול זה לא אופטימלי עבור פעילות גבוהה מחשוף. CrRNA 2-חלק שלא שונתה, tracrRNA (ראה טבלה של חומרים) שימשו עם המטרה של יצירת שורות תאים מתויג FP מונו-allelic תוך גרימת את ההפרעות הפחות פוטנציאלית על התאים.

התורם תבנית פלסמיד

כי חלק הומולוגיה זרוע רצף בתנאי ב התורם תבנית פלסמיד ישולבו לתוך הגנום מארח במהלך האירוע HDR, צריך להכיר מוטציות נקודה אל אתרי זיהוי crRNA כדי למנוע המחשוף מאת Cas9 בעקבות HDR. לעיתים קרובות השינוי משובש הפשוט ביותר הוא מתכוון להפוך למוטציות. את רצף פאם. כי כמה רצפים פאם קאנונית עדיין ניתן לזהות לפי סוג הפרוע Cas9 הפישחה ינפל תומימת ס , עדיף להימנע משימוש הגולה, לנדנד או נגה33. מוטציה הזרוע הומולוגיה, הימנע מוטציות שם נרדף, כניסתה של codons נדיר. אם שינוי שם נרדף רצף פאם אינו אפשרי, לשקול ביצוע שלוש מוטציות נקודה נרדף באזור זרע (10 bp proximal לפאם) של אתר איגוד crRNA. נקטו זהירות יש לנקוט בעת ביצוע שינויים אלה באזור לא מתורגם 5ʹ (UTR) מאז אזורים אלה עשויים להכיל רצפי תקינה חשוב. ייעוץ מסד נתונים של שימור גנטיות כגון רצועות גנומיקה השוואתית של הדפדפן הגנום UCSC יכולים לספק הדרכה במקרים אלה, כמו שינויים שאינם והתפאורה בסיסים עשוי להיות טוב יותר נסבלת מאשר שינויים בסיסים מאוד שנשמרת17. לפעמים עצם החדרת הרצף FP זה מספיק כדי לשבש את אתר קישור crRNA (כמו באיור 1); עם זאת, הרצף החדש מצורף צריך להיבדק על התמדתו של איגוד crRNA ורצפים פאם.

חומצת אמינו linkers בין FP החלבון מקורי מומלץ כדי לשמר את הפונקציה של חלבון פיוז’ן34. לעיתים קרובות מקשר חומצת אמינו עשוי להיבחר עבור תשלום מסוים או הגודל שלה. אם cDNA פיוז’ן עם עיצוב דומה המיועד אנדוגני חלבון כימרי טוב נחקרה, כי אותו רצף מקשר יכול לשמש את הניסוי בטוק CRISPR/Cas912,19. אם מידע כזה אינו זמין, מקשר (linker) קצר כגון GTSGGS היה גם בעבר בהצלחה12. מחקרים אחרים הראו הצלחה עם רצף כלליים קטנים מקשר חומצה אמינו 3 עבור מגוון של מטרות35.

תרביות תאים והעשרה FACS

ריאגנטים זמינים מסחרית תרביות תאים רבים מנוסחות למסירה של סוגים מסוימים של מולקולות תאים, ואילו מערכת אלקטרופורציה יכול לשמש כדי לספק ריאגנטים עם מגוון רחב של גודל, תשלום הרכב. בנוסף להיותו שיטה נפוצה תקנים עבור תאים קשה-עד-transfect כמו hiPSCs, אלקטרופורציה נושאת גם את היתרון של אספקת כל שלושת הרכיבים FP CRISPR/Cas9-מתווכת ‘ טוק-אין כמתואר בשיטה זו. אלקטרופורציה נמצאה כדי להפיק את התוצאות הטובות ביותר בהשוואה אחרים ריאגנטים זמינים מסחרית כאשר לפתח שיטה זו (נתונים לא מוצג), שימש גם על ידי אחרים עבור RNP משלוח26,28,36 .

בעת שימוש בפרוטוקול זה לצורך עריכה hiPSCs, טיפול מיוחד יש לנקוט על מנת להבטיח טיפול עדין של התאים לפני ואחרי הגן עריכת תהליכי הישרדות cell אופטימלית של בידול ספונטנית מינימלי. בפרט, השיטות העשרה FACS צריך להיות מותאם לצורך מיון תאי גזע באמצעות הגדול הזרבובית אפשרי (130 מיקרומטר), נמוך, קצב הזרימה (≤24 µL/דקה), נוזל הנרתיק ללא חומר משמר (כגון תמיסת מלח, ראה טבלה של חומרים), ודגימת נמוך לחץ (10 psi). במקום לתא בודד מיון, דבר המתבטא הכדאיות שיוצרת בתאי גזע, hiPSCs מועשר FACS ממוינת בתפזורת, מורחבת כאוכלוסייה כדי למטב את הכדאיות תא ותקינות תאי גזע. אולם, מיון תא יחיד עשוי להיות מתאים פחות סוגי תאים רגישים. כדי לקדם את הישרדות cell, התאים הם חזרה אל תרבות יותר מאשר שעה אחת לאחר קציר העשרה FACS, המשיך בטמפרטורת החדר לאורך כל תהליך המיון. עבור סוגים מסוימים של התא, הישרדות cell יכול גם להיות מוגברת על ידי תאים ומוכנסות על קרח (4° C) לאורך כל תהליך המיון.

הרחבת בכמות גדולה של תאים FP-חיוביות מספקת הזדמנות להעריך את האוכלוסייה על-ידי ניתוח ההדמיה של פיוז’ן לוקליזציה חלבון לפני יצירת קווים המשובטים. בעוד האוכלוסייה מועשר וכתוצאה מכך של תאים עשוי להיות מספיק עבור מחקרים, אוכלוסיות אלה מציגים לעתים קרובות FP אותות שונים, בעוצמות שונות. הקווים המשובטים מבודד יש אות אחידה (איור 3), שהופך אותם מתאים יותר עבור ניסויים פונקציונלי12.

תא המשובטים קו הדור

לאורך כל עריכה של המשובטים קו הדור התהליך, חשוב לעקוב אחר מורפולוגיה תאים. מושבות hiPSC גדל בתנאים ללא מזין צריך להפגין קצוות חלקים ו-18,12,19מרכז תיקו, ארוזה היטב. תאים להתייחס פחות מ 5% של התרבות. כאשר בוחרים מושבות בודדות, בחר באלה מורפולוגיה טוב את התערוכה. במהלך לצלחת 96-ובכן, passaging אירועים, בדוק שיבוטים על מורפולוגיה, להפסיק את אלה יש מגודל כמו זה עלול להוביל בידול או אינדיקציה לחוסר יציבות גנטית.

דור של שורות תאים המשובטים מאפשר לאישור גנטי של עריכה מדויקת, וזה חשוב כי Cas9-induced גדיל כפול שובר הגנום לעיתים קרובות תוקנו imprecisely למרות התאגדות של התג-מיקומה הרצוי. מבחני מבוססי ה-PCR שתואר לעיל הראה כי מצטברת על פני עשר לוקוסים גנומית ייחודיים רבים (% 45) המשובטים לבטא-FP סבלו מתורם שילוב של עמוד השדרה פלסמיד מיקומה יישוב או באופן אקראי (לעתים רחוקות) הגנום12. בנוסף, 23% של GFP-חיוביות שיבוטים (n = 177) על פני עשר לוקוסים ייחודי נמצאו מוטציות ליד או באתר חיתוך crRNA הצפויה אלל לא מתויגות, ככל הנראה עקב NHEJ12פונדקאים. זה ניתוח גנטי של קווים רבים המשובטים (~ 100 שכפולים/עריכה) הדגיש את החשיבות של אימות גנטי שאינו אפשרי בקרב אוכלוסיה תא מאז FP-ביטוי ולוקליזציה פיוז’ן הצפוי חלבון לבד אינם מבטיחים12 עריכה מדויקת . בנוסף, אין אפשרות לבצע מבחני אלה מבוססי ה-PCR על אוכלוסיה מועשר של תאים עם ממשות, המצדיקים את הצורך קו המשובטים דור לפני ניתוח משמעותי ניתן להשלים. אישור גנטי של התג FP שנוספו ואימות של שלמות גנטית אלל ערוך (ב ערוכות כפיל מונו-allelic) נמצאים שניהם הדרושים כדי להבטיח עריכה מדויקת על מיקומה יישוב מעבר ביטוי התג.

קצב נמוך של פעולות עריכה דו-allelic, חוסר חופש-יעד מוטציות (בתור לבדיקה על ידי סנגר ורצף exome) נצפו עד כה שימוש זו שיטה (נתונים שלא פורסמו)12. . זה עקבי עם מחקרים קודמים המתאר את השימוש RNP לטווח קצר עבור26,CRISPR/Cas9 ניסויים27. חוסר של שורות תאים המשובטים בעריכה דו-allelic יכול להיות גם לוקוס ספציפי או בשל חוסר היכולת של התא לסבול שניים מתויג עותקים של חלבון חיוני כפי שהוצע של ניסויים שפורסמו קודם לכן איפה היו תאים בשם הערוך דו-allelic ציין עבור אחד לוקוס (LMNB1), אבל לא עוד (TUBA1B)12. קווי דו-allelic תא המשובטים מאומת לחלוטין נוצרו באמצעות זו שיטה תג ST6 בטא-galactoside אלפא 2, 6-sialyltransferase 1 (ST6GAL1), וחבר RAB5A ראס אונקוגן המשפחה (RAB5A) עם mEGFP19.

מעבר המאשרת את הדיוק של ערוך הגנום, יש מגוון של מבחני בקרת איכות יכול לשמש עוד יותר לאפיין את הקו המשובטים ולזהות שיבוטים זה למלא את כל תאי גזע, גנומית, ולהשתמש התא הביולוגי לקריטריונים בעתיד מחקרים . תא ביולוגי, פונקציונלי מבחני יכול לשמש כדי לאשר את הביטוי המתאים, לוקליזציה, הפונקציה של חלבון פיוז’ן12. ההשוואה ערוך ל’בקרת הורים יעזרו להעריך את ההשפעה של תהליך העריכה על לוקליזציה, דינמיקה, ופועלים. מבחני אחרים כגון ניתוח גדילה, בדיקות יציבות גנומית יכולים גם לעזור לקבוע אם החלבון מתויג הוא perturbing לתא. בעת שימוש hiPSC ב פרוטוקול זה, הערכת סמנים pluripotency ופוטנציאל בידול יכול להיות קריטי בקביעת שיבוט זה יקר עבור במורד הזרם מחקרים12. כי מורחב של תרבות hiPSC הוכח להוביל לחוסר יציבות גנטית, ניטור קצב הגידול, קריוטיפ של שורות תאים המשובטים גם חשוב12,37. עם זאת, הסופי מיועד לשימוש של התאים הערוך בסופו של דבר יקבע את רמת ולרוחבה של בקרת איכות ניתוח משתנים בהתאם ליישום.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים דפני Dambournet על תובנה דיונים רבים וייעוץ בנושא ג’ין עריכה, לעשות תאו להמחשה, אנג’ליק נלסון לקריאה ביקורתית של כתב היד, ו אנדרו טאקר ליצירת קו מתויג mEGFP תא B1 למינציה. ברצוננו להודות על תאי גזע, ג’ין ועריכה צוותי פיתוח Assay במכון אלן למדע תא על תרומתם ג’ין עריכה, תהליך בקרת איכות. הקו WTC שבהן השתמשנו כדי ליצור קו תא נערך-הגן שלנו סופק על ידי המעבדה קונקלין ר ברוס גלדסטון, קליפורניה בסן פרנסיסקו. אנו מודים מכון אלן תא המדע מייסד, פול אלן ג’י, על חזונו, עידוד, ותמיכה.

Materials

Geneious R9 Biomatters, or similar bioinformatics software for in silico donor plasmid design
TE Buffer pH 8.0 IDT, or similar 11-01-02-05
HERAcell VIOS 160i CO2 incubator, or similar ThermoFisher Scientific, or similar 51030408
Pipettes (1000 µL, 200 µL, 20 µL, 10 µL, 2 µL) Rainin, or similar
Pipette tips (1000 µL, 200 µL, 20 µL) Rainin, or similar
Multi-channel Pipette (200 µL) Rainin, or similar
Serological pipetes (25 mL, 10 mL, 5 mL) Costar, or similar
BRAND 8-Channel Manifold for Quiksip, Autoclavable Millipore Sigma, or similar BR704526-1EA use with non-filtered pipet tips, such as Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10, below
Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10 Thermo Fisher, or similar 3501-05
XP2 Pipette Controller Drummond, or similar 4-000-501
Disposable Pasteur Pipets VWR, or similar 53300-567
Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet CELLGARD, or similar NU-481
Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced Corning 354230 lot tested before use with hiPSC
DMEM/F12 (-phenol red) Gibco 11039-021 cold, for diluting Matrigel 1:30
mTeSR1 Complete Media StemCell Technologies 85850 recommended growth media for WTC hiPSC line
Penicillin-streptomycin Gibco 15070-063
WTC hiPSC line Coriell GM25256 the hiPSC line used in this protocol is available through Coriell
Tissue culture dish 100 mm Falcon 353003
6-well Cell Culture Plate CELLSTAR 657160
StemPro Accutase Gibco A11105-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) no calcium, no magnesium Gibco 14190144
15 mL polystyrene conical Sarstedt 62.554.100
Y-27632 (ROCK Inhibitor) StemCell Technologies 72308
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic crRNA, unmodified (custom sequence) Dharmacon Custom0247
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA Dharmacon U-002005-05
Recombinant wild-type Streptococcus pyogenes Cas9-NLS purified protein, 40 µM University of California-Berkeley QB3 Macrolab
Custom donor plasmid (PriorityGENE) Genewiz donor insert design was synthesized and cloned into pUC57 backbone by Genewiz
DNA LoBind Tube 1.5 mL Eppendorf 22431021
NucleoBond Xtra Maxi EF Clontech 740424.50
Neon Transfetion System ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System, 100 µL kit ThermoFisher Scientific MPK10096
5 mL Polystyrene Round-bottom Tube with Cell Strainer Cap Falcon 352235
15 mL High Clarity Polyproylene Conical Tube Falcon 352196
FACSAriaIII Fusion BD Biosciences 656700
FACSDiva software BD Biosciences
FlowJo version 10.2 TreeStar
NERL Blood Bank Saline ThermoFisher Scientific 8504 used as preservative-free FACS Buffer
Olympus SZX7 Stereo Microscope, or similar Olympus, or similar
Tissue culture plate, 96-well Falcon 353072
96 well Cell Culture Plate, V-Bottom CELLSTAR 351180
CryoStor CS10 Sigma C2874-100ML used as cryopreservation buffer for cells in 96-well plate format
Parafilm Bemis PM-996
24 well Cell Culture Plate CELLSTAR 662160
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wood, A. J., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333 (6040), 307 (2011).
  2. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  3. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  4. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  5. Dambournet, D., Hong, S. H., Grassart, A., Drubin, D. G. Tagging endogenous loci for live-cell fluorescence imaging and molecule counting using ZFNs, TALENs, and Cas9. Methods in Enzymology. , 139-160 (2014).
  6. Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Sci Rep. 5, 9592 (2015).
  7. Hendriks, W. T., Warren, C. R., Cowan, C. A. Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells: Approaches, Pitfalls, and Solutions. Cell Stem Cell. 18 (1), 53-65 (2016).
  8. Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Cell Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
  9. Doyon, J. B., et al. Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells. Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).
  10. Cho, W. K., et al. Super-resolution imaging of fluorescently labeled, endogenous RNA Polymerase II in living cells with CRISPR/Cas9-mediated gene editing. Sci Rep. 6, 35949 (2016).
  11. White, C. W., Vanyai, H. K., See, H. B., Johnstone, E. K. M., Pfleger, K. D. G. Using nanoBRET and CRISPR/Cas9 to monitor proximity to a genome-edited protein in real-time. Sci Rep. 7 (1), 3187 (2017).
  12. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Mol Biol Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).
  13. Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations. Cell. 146 (2), 318-331 (2011).
  14. Young, J. E., Goldstein, L. S. Alzheimer’s disease in a dish: promises and challenges of human stem cell models. Human Molecular Genetics. 21 (R1), R82-R89 (2012).
  15. Soares, F. A., Sheldon, M., Rao, M., Mummery, C., Vallier, L. International coordination of large-scale human induced pluripotent stem cell initiatives: Wellcome Trust and ISSCR workshops white paper. Stem Cell Reports. 3 (6), 931-939 (2014).
  16. . . Gene, NCBI- National Center for Biotechnology Information. , (2017).
  17. . . Gene, NCBI- National Center for Biotechnology Information. , (2017).
  18. . . Allen Cell Methods: Single cell passaging human iPS cells. , (2018).
  19. . . Allen Cell Explorer. , (2017).
  20. Lingeman, E., Jeans, C., Corn, J. E. Production of Purified CasRNPs for Efficacious Genome Editing. Curr Protoc Mol Biol. 120, 31-31 (2017).
  21. . . Michael Davidson Fluorescent Protein Collection. , (2017).
  22. Cox, D. B., Platt, R. J., Zhang, F. Therapeutic genome editing: prospects and challenges. Nature Medicine. 21 (2), 121-131 (2015).
  23. Haas, S. A., Dettmer, V., Cathomen, T. Therapeutic genome editing with engineered nucleases. Hamostaseologie. 37 (1), 45-52 (2017).
  24. Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases. G3 (Bethesda). 3 (4), 657-664 (2013).
  25. Orlando, S. J., et al. Zinc-finger nuclease-driven targeted integration into mammalian genomes using donors with limited chromosomal homology. Nucleic Acids Research. 38 (15), e152 (2010).
  26. DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein. Methods. 121-122, 9-15 (2017).
  27. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  28. Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
  29. Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44 (W1), W272-W276 (2016).
  30. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
  31. Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
  32. . . CRISPOR V4.3. , (2017).
  33. Zhang, Y., et al. Comparison of non-canonical PAMs for CRISPR/Cas9-mediated DNA cleavage in human cells. Sci Rep. 4, 5405 (2014).
  34. Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Adv Drug Deliv Rev. 65 (10), 1357-1369 (2013).
  35. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).
  36. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
  37. Baker, D., et al. Detecting Genetic Mosaicism in Cultures of Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 7 (5), 998-1012 (2016).

Tags

CRISPR/Cas9Endogenous Protein TaggingHuman Induced Pluripotent Stem CellsRibonucleoproteinFluorescent TagFACSClonal Cell LinesGene EditingLive Cell ImagingCellular StructuresCellular Processes

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (138), e58130, doi:10.3791/58130 (2018).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image