Ein High-Performance Liquid Chromatography-Messung von Kynurenin und Kynurenic Säure: Biochemie zur Kognition und Schlaf bei Ratten
Summary
Änderungen in den Kynurenin Weg (KP) neuroaktive Metaboliten sind in psychiatrischer Erkrankungen verwickelt. Untersuchung der funktionellen Ergebnisse einer veränderten Kynurenin Weg Stoffwechsel in Vivo bei Nagern kann helfen, neue therapeutische Ansätze zu erläutern. Das aktuelle Protokoll verbindet biochemischen und Verhaltensstörungen Ansätze zur Untersuchung der Auswirkungen einer akuten Kynurenin Herausforderung bei Ratten.
Abstract
Kynurenin Weg (KP) der Abbau von Tryptophan hat bei psychiatrischen Erkrankungen verwickelt. Insbesondere die Astrozyten abgeleitet Metabolit Kynurenic Säure (KYNA), ein Antagonist an beide N-Methyl-d-Aspartat-(NMDA) und α7 Nikotinsäure Acetylcholin (α7nACh)-Rezeptoren, hat in kognitiven Prozessen in Gesundheit und Krankheit in Verbindung gebracht. Wie KYNA Ebenen in den Gehirnen von Patienten mit Schizophrenie erhöht sind, ist eine Störung an der glutamatergen und cholinergen Rezeptoren angenommen, kausal, Kognitive Dysfunktion, eine zentrale Domäne der Psychopathologie der Krankheit bezogen werden. KYNA kann bei Personen mit Schizophrenie eine Pathophysiologisch wichtige Rolle spielen. Es ist möglich, endogene KYNA im Nagetier Gehirn zu erhöhen, durch Behandlung von Tieren mit der direkten Bioprecursor Kynurenin und präklinische Studien an Ratten haben gezeigt, dass akute Erhebungen KYNA ihre lernen und Gedächtnis Prozesse auswirken können. Das aktuelle Protokoll beschreibt dieser experimentellen Ansatz im Detail und kombiniert (a) eine biochemische Analyse der Kynurenin-Spiegel im Blut und Gehirn KYNA Bildung (mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie), (b) Verhaltens Tests, um die Sonde die hippocampal-abhängige kontextuellen Speicher (passive Vermeidung Paradigma) und c) eine Bewertung der Schlaf-Wach-Verhalten [telemetrischen Aufnahmen kombinieren Elektroenzephalogramm (EEG) und Elektromyogramm (EMG) Signale] bei Ratten. Zusammen genommen, eine Beziehung zwischen erhöhten KYNA, Schlaf und Kognition untersucht wird, und dieses Protokoll beschreibt im Detail einen experimentellen Ansatz zum Verständnis der Funktion Ergebnisse der Kynurenin Höhe und KYNA Bildung in Vivo an Ratten. Ergebnisse, die durch Variationen dieses Protokolls werden die Hypothese zu testen, dass die KP und KYNA entscheidende Rolle in der Modulation, Schlaf und Kognition in Gesundheit und Krankheit Staaten dienen.
Introduction
Der KP ist verantwortlich für fast 95 % der essentiellen Aminosäure Tryptophan1entwürdigend. In das Gehirn von Säugetieren ist in erster Linie durch das Enzym Kynurenin Aminotransferase (KAT) II2Kynurenin Astrozyten berücksichtigt in neuroaktive niedermolekularer KYNA metabolisiert. KYNA wirkt als Antagonist an NMDA und α7nACh Rezeptoren im Gehirn2,3,4, und auch Ziele Signalisierung Rezeptoren einschließlich der Aryl-Hydrocarbon-Rezeptor (AHR) und dem G-Protein gekoppelten Rezeptor 35 (GPR35)5 ,6. Bei Versuchstieren Erhebungen im Gehirn KYNA nachweislich beeinträchtigen ihre kognitive Leistungsfähigkeit in einem Array von Verhaltensstörungen Assays2,7,8,9,10 . Eine neue Hypothese besagt, dass KYNA so weitere Unterstützung die Rolle der Astrozyten abgeleitete Moleküle Modulation der Neurobiologie des Schlafes eine wesentliche Rolle spielt bei der Modulation der kognitiver Funktionen durch Auswirkungen auf Schlaf-Wach-Verhalten-11, und Kognition-12.
Klinisch wurden Erhebungen KYNA im Liquor cerebrospinalis und Post-Mortem Hirngewebe von Patienten mit Schizophrenie13,14,15,16, eine lähmende psychiatrische Erkrankung gefunden gekennzeichnet durch kognitive Beeinträchtigungen. Patienten mit Schizophrenie sind oft auch von Schlafstörungen geplagt, die die Krankheit17verschlimmern können. Verständnis der Rolle der KP-Stoffwechsel und KYNA Modulation eine Beziehung zwischen Schlaf und Kognition, insbesondere zwischen Lernen und Gedächtnis, führen zu der Entwicklung neuartiger Therapien für die Behandlung von diese schlechte Ergebnisse bei Schizophrenie und anderen psychiatrischen Erkrankungen.
Eine zuverlässige und konsistente Methode zur Messung der KP Metaboliten ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Forschung aus verschiedenen Institutionen in das wissenschaftliche Verständnis der KP Biologie integriert werden kann. Heute beschreiben wir die Methodik zur Messung der Kynurenin im Ratte Plasma und KYNA im rattengehirn durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC). Das vorliegende Protokoll, das macht eine fluorimetrischen Erkennung im Beisein von Zn2 +nutzen, wurde zuerst von Shibata18 und mehr vor kurzem angepasst und optimiert, um mit 500 mM Zinkacetat als Post-Spalte-Reagenz, zulassend derivatize entwickelt die Erkennung von endogenen, nanomolaren Mengen von KYNA in der Gehirn-11.
Um die de Novo endogenen KYNA Produktion anregen wie in diesem Protokoll beschrieben, ist die direkte Bioprecursor Kynurenin intraperitoneal injiziert (i.p.) bei Ratten. In Kombination mit biochemischen Tests zu prüfen, inwieweit KYNA Produktion die Auswirkungen einer Kynurenin Herausforderung auf dem Hippokampus-abhängige Speicher (passive Vermeidung Paradigma) und ist auch der Schlaf-Wach-Architektur (EEG und EMG-Signale) untersuchten11. Eine Kombination dieser Techniken ermöglicht die Studie über die biochemische und funktionelle Auswirkungen eines Kynurenin Herausforderung in Vivo an Ratten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Für eine zuverlässige Bewertung von KYNA im Gehirn nach einer peripheren Kynurenin-Verwaltung ist es wichtig, zu kombinieren und biochemische und funktionelle Experimente zu interpretieren. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll, das neue Benutzer wirksame Methoden zur Messung der Plasma-Kynurenin und Gehirn von Ratten KYNA herstellen lässt. Die Messung von Kynurenin im Plasma bestätigt die korrekte Injektion und die Messung des Metaboliten KYNA bestätigt die de-Novo -Synthese im Gehirn. E…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die vorliegende Studie wurde teilweise durch die National Institutes of Health (R01 NS102209) und eine Spende von Clare E. Forbes Trust finanziert.
Materials
| Wistar rats | Charles River Laboratories | adult male, 250-350 g | |
| L-kynurenine sulfate | Sai Advantium | ||
| ReproSil-Pur C18 column (4 x 150 mm) | Dr. Maisch GmbH | ||
| EZ Clips | Stoelting Co. | 59022 | |
| Mounting materials screws | PlasticsOne | 00-96 X 1/16 | |
| Nonabsorbable Sutures | MedRep Express | 699B | CP Medical Monomid Black Nylon Sutures, 4-0, P-3, 18", BOX of 12 |
| Absorbable Sutures | Ethicon | J310H | 4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1 |
| Dental Cement | Stoelting Co. | 51458 | |
| Drill Bit | Stoelting Co. | 514551 | 0.45 mm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alliance HPLC system | |||
| E2695 separation module | Waters | 176269503 | |
| 2475 fluorescence detector | Waters | 186247500 | |
| post-column reagent manager | Waters | 725000556 | |
| Lenovo computer | Waters | 668000249 | |
| Empower software | Waters | 176706100 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Passive avoidance box for rat | |||
| Extra tall MDF sound attenuating cubicle | MedAssociates | ENV-018MD | Interior: 22"W x 22"H x 16"D |
| Center channel modulator shuttle box chamber | MedAssociates | ENV-010MC | |
| Stainless steel grid floor for rat | MedAssociates | ENV-010MB-GF | |
| Auto guillotine door | MedAssociates | ENV-010B-S | |
| Quick disconnect shuttle grid floor harness for rat | MedAssociates | ENV-010MB-QD | |
| Stimulus light, 1" white lens, mounted on modular panel | MedAssociates | ENV-221M | |
| Sonalert module with volume control for rat chamber | MedAssociates | ENV-223AM | |
| SmartCtrl 8 input/16 output package | MedAssociates | DIG-716P2 | |
| 8 Channel IR control for shuttle boxes | MedAssociates | ENV-253C | |
| Infrared source and dectector array strips | MedAssociates | ENV-256 | |
| Tabletop interface cabinet, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080C | |
| Dual range constant current aversive stimulation module | MedAssociates | ENV-410B | |
| Solid state grid floor scrambler module | MedAssociates | ENV-412 | |
| Dual A/B shock control module | MedAssociates | ENV-415 | |
| 2' 3-Pin mini-molex extension | MedAssociates | SG-216A-2 | |
| 10' Shock output cable, DB-9 M/F | MedAssociates | SG-219G-10 | |
| Shuttle shock control cable 15', 6 | MedAssociates | SG-219SA | |
| Small tabletop cabinet and power supply, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080D | |
| PCI interface package | MedAssociates | DIG-700P2-R2 | |
| Shuttle box avoidance utility package | MedAssociates | SOF-700RA-7 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sleep-Wake Monitoring Equipment | |||
| Ponehmah software | Data Sciences International (DSI) | PNP-P3P-610 | |
| MX2 8 Source Acquisition interface | Data Sciences International (DSI) | PNM-P3P-MX204 | |
| Dell computer, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bit | Data Sciences International (DSI) | 271-0112-013 | |
| Dell 19" computer monitor | Data Sciences International (DSI) | 271-0113-001 | |
| Receivers for plastic cages, 8x | Data Sciences International (DSI) | 272-6001-001 | |
| Cisco RV130 VPN router | Data Sciences International (DSI) | RV130 | |
| Matrix 2.0 | Data Sciences International (DSI) | 271-0119-001 | |
| Network switch | Data Sciences International (DSI) | SG200-08P | |
| Neuroscore software | Data Sciences International (DSI) | 271-0171-CFG | |
| Two biopotential channels transmitter, model TL11M2-F40-EET | Data Sciences International (DSI) | 270-0134-001 |
References
- Leklem, J. E. Quantitative aspects of tryptophan metabolism in humans and other species: a review. The American Journal of Clinical Nutrition. 24 (6), 659-672 (1971).
- Pocivavsek, A., Notarangelo, F. M., Wu, H. Q., Bruno, J. P., Schwarcz, R., Pletnikov, M. V., Waddington, J. L. Astrocytes as Pharmacological Targets in the Treatment of Schizophrenia: Focus on Kynurenic Acid. Modeling the Psychophathological Dimensions of Schizophrenia – From Molecules to Behavior. , 423-443 (2016).
- Hilmas, C., et al. The brain metabolite kynurenic acid inhibits alpha7 nicotinic receptor activity and increases non-alpha7 nicotinic receptor expression: physiopathological implications. Journal of Neuroscience. 21 (19), 7463-7473 (2001).
- Perkins, M. N., Stone, T. W. An iontophoretic investigation of the actions of convulsant kynurenines and their interaction with the endogenous excitant quinolinic acid. Brain Research. 247 (1), 184-187 (1982).
- DiNatale, B. C., et al. Kynurenic acid is a potent endogenous aryl hydrocarbon receptor ligand that synergistically induces interleukin-6 in the presence of inflammatory signaling. Toxicological Sciences. 115 (1), 89-97 (2010).
- Wang, J., et al. Kynurenic acid as a ligand for orphan G protein-coupled receptor GPR35. The Journal of Biological Chemistry. 281 (31), 22021-22028 (2006).
- Alexander, K. S., Wu, H. Q., Schwarcz, R., Bruno, J. P. Acute elevations of brain kynurenic acid impair cognitive flexibility: normalization by the alpha7 positive modulator galantamine. Psychopharmacology (Berlin). 220 (3), 627-637 (2012).
- Chess, A. C., Landers, A. M., Bucci, D. J. L-kynurenine treatment alters contextual fear conditioning and context discrimination but not cue-specific fear conditioning. Behavioural Brain Research. 201 (2), 325-331 (2009).
- Chess, A. C., Simoni, M. K., Alling, T. E., Bucci, D. J. Elevations of endogenous kynurenic acid produce spatial working memory deficits. Schizophrenia Bulletin. 33 (3), 797-804 (2007).
- Pocivavsek, A., et al. Fluctuations in endogenous kynurenic acid control hippocampal glutamate and memory. Neuropsychopharmacology. 36 (11), 2357-2367 (2011).
- Pocivavsek, A., Baratta, A. M., Mong, J. A., Viechweg, S. S. Acute Kynurenine Challenge Disrupts Sleep-Wake Architecture and Impairs Contextual Memory in Adult Rats. Sleep. 40 (11), (2017).
- Halassa, M. M., et al. Astrocytic modulation of sleep homeostasis and cognitive consequences of sleep loss. Neuron. 61 (2), 213-219 (2009).
- Erhardt, S., et al. Kynurenic acid levels are elevated in the cerebrospinal fluid of patients with schizophrenia. Neuroscience Letters. 313 (1-2), 96-98 (2001).
- Linderholm, K. R., et al. Increased levels of kynurenine and kynurenic acid in the CSF of patients with schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 38 (3), 426-432 (2012).
- Sathyasaikumar, K. V., et al. Impaired kynurenine pathway metabolism in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 37 (6), 1147-1156 (2011).
- Schwarcz, R., et al. Increased cortical kynurenate content in schizophrenia. Biological Psychiatry. 50 (7), 521-530 (2001).
- Pocivavsek, A., Rowland, L. M. Basic Neuroscience Illuminates Causal Relationship Between Sleep and Memory: Translating to Schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 44 (1), 7-14 (2018).
- Shibata, K. Fluorimetric micro-determination of kynurenic acid, an endogenous blocker of neurotoxicity, by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography. 430 (2), 376-380 (1988).
- Buzsaki, G. Memory consolidation during sleep: a neurophysiological perspective. Journal of Sleep Research. 7, 17-23 (1998).
- Graves, L. A., Heller, E. A., Pack, A. I., Abel, T. Sleep deprivation selectively impairs memory consolidation for contextual fear conditioning. Learning & Memory. 10 (3), 168-176 (2003).
- Yamashita, M., Yamamoto, T. Tryptophan circuit in fatigue: From blood to brain and cognition. Brain Research. 1675, 116-126 (2017).
