Een High-throughput Cre-Lox geactiveerd virale membraan Fusion Assay ter identificatie van de Inhibitors van HIV-1 virale membraan Fusion

De behoefte aan nieuwe antiretrovirale therapieën heeft geleid tot de ontwikkeling van high-throughput schermen voor remmers van HIV-1 entry. De bepaling van de verslaggever Gag-iCre is ontwikkeld om het identificeren van remmers van het virale vermelding bij de fusie stap in een cel-naar-cel infectie systeem door het specifiek meten van virale membraan fusion met de host celmembraan¹. Een test werd ontwikkeld aan het scherm voor roman remmers die specifiek in de vroege stadia van HIV-1 infectie tot aan het punt van virale membraan fusie gehandeld. Een uitdaging tot het meten van cel infectie is dat het eerste entmateriaal geïnfecteerde donor cellen en ininfected doelcellen, bevat dus nieuwe infectie meten moeilijk is te onderscheiden van de invoercellen. Het ideale systeem zou leiden tot een heteroloog gen-markering die kan worden opgewekt door de opening van een target cel infectie en is niet aanwezig in de cel van de donor. Een populaire virale inhoud mengen assay gebaseerd op een virale eiwitten-enzym fusion, BlaM-Vpr, kunnen effectief zijn, maar heeft ook beperkingen voor hoge doorvoer, cel-cel screening². Deze bepaling impliceert een beta-lactamase (BlaM) verslaggever gen dat is gesmolten tot HIV-1 Vpr, verpakt in virionen en geleverd in de doelcellen op virale membraan fusion. Het substraat CCF2-AM is geladen in het cytoplasma van doelcellen en ondergaat een verschuiving van de fluorescentie op decollete. De CCF2-AM substraat is duur en onbetaalbaar voor high-throughput schermen kan worden. Om te onderscheiden van donor- en het doeldomein cellen, is het nodig om kleurstof-label de doelpopulaties. Tot slot, het protocol vereist verschillende incubatie en wassen stappen die belastend en duur zijn kan bij het testen van grote aantallen van verbindingen.

De bepaling van de Gag-iCre werd ontwikkeld als een oplossing voor deze problemen, om een high-throughput screening voor remmers van fusie in cel-naar-cel transmissie. Dit systeem vereist geen substraat worden geladen in cellen. De bepaling kan ook worden gebruikt voor cel-vrije studies en is aan te passen aan andere studies van de virale fusie met pseudo-getypte HIV-1 Gag-iCre virusdeeltjes. HIV Env gemedieerde cel fusion testen kunnen meten virus Env eiwit-gemedieerde celfusie, maar dit gebruik geen werkelijke virusdeeltjes evenals de bepaling van de HIV-1 Gag-iCre^3,4,5. Deze bepaling kan worden gelezen met stroom cytometry of fluorescentie microscopie. Het is met succes gebruikt om het scherm van de FDA-bibliotheek, alsmede een kleine bibliotheek met purinergic remmers^1,6. Andere onderzoekers hebben ook vastgesteld purinergic remmers in HIV-1 fusie met behulp van een aangepast en geoptimaliseerd high-throughput fusion-bepaling die de overdracht van bèta-lactamase virus-ingekapseld in het cytoplasma^7,8 rapporteert .

De Gag-iCre virus is ontworpen met een vergelijkbare benadering van de Gag-iGFP virus, invoegen van Cre recombinase tussen matrix en Eiwitmantel, geflankeerd door HIV-1 protease sites⁹. Het enzym Cre is gemaakt als een voorloper binnen de Gag polyprotein die rijpt wanneer HIV-1 protease wordt geactiveerd binnen het ontluikende virus deeltje ingevoegd. De levering van Cre is dus afhankelijk van de levering van de inhoud van een HIV-1 protease-geactiveerde deeltje in een target cel via een virale membraan fusion proces. Twee versies van het protocol vindt u hier. De eerste maakt gebruik van een HIV-1 besmette bevolking te infecteren van doelcellen, om te bestuderen van rechtstreekse toezending van cel naar cel van HIV. De tweede versie maakt gebruik van een cel-vrij virus te bestuderen van een cel-gratis virale infectie. De cel-naar-cel transmissie test duurt 7 dagen om te voltooien vanaf de dag dat de cellen worden ontdooid, of 5 dagen als de cellen zijn al ontdooid en gepasseerd. De bepaling van de cel-vrije infectie kan worden uitgevoerd in 5 dagen als de cellen moeten worden ontdooid en 3 dagen, als de cellen worden ontdooid en gepasseerd. Instructies krijgen ook voor het genereren van een cellijn van RG (rood-met-groen) doel in de gewenste celtype (indien een bestaande RG doel cellenvariëteit niet gebruikt wordt) met behulp van een plasmide gemaakt door de Clevers Lab¹⁰. Het wordt aanbevolen dat passende bioveiligheid voorzorgsmaatregelen worden genomen met het virus en het uiten van virus cellen in deze test. Wij voeren het besmettelijke gedeelte van deze test in een BSL2 + weefselkweek faciliteit. Nadat de cellen zijn verholpen, kunnen zij worden geanalyseerd in standaard stroom cytometry en microscopie faciliteiten.

Hier beschrijven we de toepassing van deze bepaling op scherm over roman die verbindingen remmen van HIV-1 virale membraan fusion (Figuur 1). Purinergic-receptoren zijn pro-inflammatoire mediatoren. Ons laboratorium heeft aangetoond dat de niet-selectieve remmers van purinergic receptoren als remmers van HIV-1 virale membraan fusion^{6 fungeren}. Wij melden dat het gebruik van deze test in hoge-doorvoer roman HIV-1 virale membraan fusion-remmers kan identificeren. We laten zien dat een inhibitor van de omwenteling van de purinergic klasse van receptoren een nieuwe klasse van HIV-1 virale membraan fusion remmers vertegenwoordigt.