Um elevado-throughput Cre-Lox ativado ensaio de fusão da membrana Viral para identificar inibidores de fusão da membrana Viral do HIV-1

A necessidade de terapias anti-retrovirais romance tem solicitado o desenvolvimento de telas de alta produtividade para inibidores de entrada HIV-1. O ensaio da repórter Gag-iCre é desenvolvido para identificar inibidores de entrada viral na etapa de fusão em um sistema de infecção de célula para célula medindo especificamente a fusão da membrana viral com a membrana celular de anfitrião¹. Um ensaio foi desenvolvido para triagem de novos inibidores que agiu especificamente nas fases iniciais da infecção do HIV-1 até o ponto de fusão da membrana viral. Um desafio para a infecção de célula-célula de medição é que o inóculo inicial contém células de doadores infectados e nas células-alvo ininfected, por medição nova infecção é difícil discriminar a partir das células de entrada. O sistema ideal envolveria um gene heterólogo marcador que pode ser induzido pelo início de uma infecção de célula de destino e não estiver presente na célula doadora. Um conteúdo viral popular mistura ensaio baseado em uma fusão de proteína-enzima viral, BlaM-Vpr, pode ser eficaz, mas tem limitações para a alta taxa de transferência, a célula-célula de triagem². Este teste envolve um gene repórter de beta-lactamase (BlaM) que é fundido ao HIV-1 Vpr, empacotado em virions e entregue nas células de destino após a fusão da membrana viral. O substrato CCF2-AM é carregado no citoplasma das células-alvo e sofre uma mudança de fluorescência após clivagem. O substrato CCF2-AM é caro e pode ser proibitivo para telas de alta produtividade. Para distinguir células do doador e de destino, é necessário a tintura-etiqueta as populações-alvo. Finalmente, o protocolo exige várias etapas de lavagem e incubação, que podem ser pesada e onerosa ao testar um grande número de compostos.

O ensaio de Gag-iCre foi desenvolvido como uma solução para estes problemas, para desenvolver um elevado-throughput screening para inibidores de fusão em transmissão de célula para célula. Este sistema não requer substrato para ser carregado em células. O ensaio também pode ser usado para estudos de célula-free e é adaptável a outros estudos de fusão viral usando partículas de vírus HIV-1 Gag-iCre pseudo digitadas. Ensaios de fusão do HIV Env mediada celular podem medir fusão de celular mediada por proteínas do vírus Env, no entanto, estas não usar partículas de vírus real, como o teste de HIV-1 Gag-iCre faz^3,4,5. Este ensaio pode ser lido com microscopia de fluxo cytometry ou fluorescência. Foi utilizado com sucesso para a tela da biblioteca do FDA, bem como uma pequena biblioteca de purinérgicos inibidores^1,6. Outros pesquisadores também identificaram purinérgicos inibidores de fusão do HIV-1 usando um ensaio de fusão de alta produtividade adaptado e otimizado que relata a transferência de beta-lactamase encapsulado vírus para o citoplasma^7,8 .

O vírus de Gag-iCre foi projetado com uma abordagem semelhante ao vírus da mordaça-iGFP, inserindo Cre recombinase entre matriz e capsídeo, ladeado por HIV-1 protease sites⁹. A enzima de Cre é feita como um precursor inserido dentro a poliproteína de mordaça que amadurece quando a protease do HIV-1 é ativado dentro da partícula do vírus nascente. A entrega de Cre depende, assim, a entrega do conteúdo de uma partícula de HIV-1 protease-ativado em um alvo celular através de um processo de fusão da membrana viral. Duas versões do protocolo são fornecidas aqui. O primeiro usa uma população de HIV-1 infectado para infectar células-alvo, para estudar a transmissão directa de célula para célula do HIV. A segunda versão utiliza um vírus sem célula para estudar uma infecção sem célula viral. O ensaio de transmissão de celular para celular leva 7 dias para concluir a partir do dia em que as células são descongeladas, ou 5 dias, se as células são já descongeladas e passadas. O ensaio de infecção sem célula pode ser executado em 5 dias, se as células precisam ser descongelados e 3 dias, se as células são descongeladas e passadas. Também são dadas instruções para gerar uma linha de células alvo (vermelho-verde) RG no tipo celular desejado (se uma linhagem de células de destino preexistente do RG não estiver sendo usada) utilizando um plasmídeo criado pelo laboratório Clevers¹⁰. É recomendável que sejam tomadas precauções de biossegurança adequadas com o vírus e as células do vírus-expressando neste ensaio. Realizamos a parte infecciosa deste ensaio em uma instalação de cultura de tecidos BSL2 +. Depois que as células são fixos, eles podem ser analisados nas instalações de microscopia e citometria de fluxo padrão.

Aqui descrevemos a aplicação deste teste a tela para romance compostos que inibem a fusão da membrana viral de HIV-1 (Figura 1). Receptores purinérgicos são mediadores pró-inflamatórios. Nosso laboratório tem demonstrado que os inibidores não-seletivo dos receptores purinérgicos agem como inibidores de fusão de membrana viral HIV-1⁶. Informamos que a utilização deste teste em alta taxa de transferência pode identificar novos inibidores de fusão de membrana viral de HIV-1. Podemos demonstrar que um inibidor da classe dos receptores purinérgicos representa uma nova classe de inibidores de fusão da membrana viral HIV-1.