Transferência de embriões minimamente invasivos e vitrificação embrionária na fase de embrião ideal em modelo de coelho

Com os objetivos de contornar a infertilidade humana ou melhorar a disseminação de gado de alto valor genético e preservar os recursos genéticos animais, um conjunto de técnicas denominadas coletivamente tecnologias de reprodução assistida, como a superovulação, em fertilização in vitro , cultura embrionária ou criopreservação, foram desenvolvidas^1,2. Atualmente, tratamentos hormonais são administrados para estimular os ovários e produzir um grande número de folículos ovarianos antrais¹. Os oócitos coletados desses folículos podem ser amadurecidos, fertilizados e desenvolvidos in vitro até serem criospreservados ou transferidos para mães substitutas³. Entretanto, durante esses tratamentos, os gâmetas e os zigitos são expostos a uma série de processos não fisiológicos que podem requerer a adaptação embrionária para sobreviver nessas condições^4,5. Esta adaptação é possível devido à plasticidade embrionária precoce, que permite alterações embrionária na expressão gênica e programação do desenvolvimento⁶. No entanto, essas modificações podem influenciar os estágios subsequentes do desenvolvimento embrionário até a idade adulta, e agora é amplamente aceito que métodos, cronometragem, procedimento de criopreservação ou condições de cultura mostram resultados diferentes sobre o destino do embrião^{7 , 8}. Conseqüentemente, para elucidar os efeitos induzidos específicos das artes, o uso de modelos animais well-caracterizados é inevitável.

O primeiro nascimento vivo documentado resultante da transferência de embriões mamíferos ocorreu em 1890⁹. Hoje, a transferência de embriões (ET) para uma fêmea substituta é um passo crucial no estudo dos efeitos induzidos pela arte durante o pré-implante em estágios subsequentes de desenvolvimento embrionário¹⁰. As técnicas de ET dependem do tamanho e da estrutura anatômica de cada animal. No caso de modelos animais de grande porte, foi possível realizar ET por técnicas de ET não-cirúrgicas transcervicais, mas no cateterismo de espécies de menor porte do colo do útero é mais complexa e as técnicas cirúrgicas são freqüentemente utilizadas¹¹. No entanto, o ET cirúrgico pode causar hemorragia que pode prejudicar a implantação e o desenvolvimento embrionário, pois o sangue pode invadir o lúmen uterino, causando morte embrionária¹⁰. Técnicas transcervicais e não cirúrgicas ainda são aplicadas em humanos, babuínos, bovinos, suínos e camundongos^{12,13,14,15,16,17}, mas cirúrgicas Os ETs ainda estão sendo usados em espécies como caprinos, ovinos ou outros animais que apresentam dificuldades adicionais^10,18,19,^20,21, como coelhos (dois independentes) ou camundongos (tamanho pequeno). No entanto, os métodos de transferência cirúrgica tendem a ter sido gradualmente substituídos por métodos menos invasivos. A endoscopia foi utilizada para transferir embriões, por exemplo, em coelhos, suínos e pequenos ruminantes^18,19,20. Estes métodos de endoscopia minimamente invasivos podem ser utilizados para transferir embriões para a ampola através do infundíbulo, que é essencial em coelhos e demonstrou efeitos benéficos em algumas espécies²⁰. Isto é baseado na importância do diálogo correto entre o embrião e a mãe durante estágios adiantados do embrião no oviduct. Como mencionado acima, o remodelamento embrionário que ocorre em coelhos durante a migração embrionária através do oviduto é essencial para a obtenção de embriões capazes de implantar^22,23.

Modelos animais de maior tamanho, como bovinos, são interessantes porque as características bioquímicas e pré-implante são semelhantes às da espécie humana²⁴. No entanto, grandes animais são muito caros para uso em ensaios preliminares, e roedores são considerados um modelo ideal (76% organismos modelo são roedores) para pesquisa laboratorial²⁵. No entanto, o modelo do coelho fornece algumas vantagens sobre roedores em estudos reprodutivos, como alguns processos biológicos reprodutivos expostos por seres humanos são mais semelhantes em coelhos do que aqueles em camundongos. Humanos e coelhos apresentam uma ativação do genoma embrionário cronológico semelhante, gastrulação e estrutura da placenta hemocorial. Além disso, usando coelhos é possível saber o momento exato da fertilização e estágios de gravidez devido à sua ovulação induzida²⁵. Os ciclos de vida do coelho são curtos, completando a gestação em 31 dias e atingindo a puberdade em cerca de 4-5 meses; o animal é fácil de manusear devido ao seu comportamento dócil e não agressivo, e sua manutenção é muito econômica em comparação com a despesa de animais maiores. Além disso, é crucial mencionar que os coelhos têm um útero duplex com dois Cervixes independentes^11,12. Isso coloca o coelho em uma posição preferencial, como os embriões dos diferentes grupos experimentais podem ser transferidos para o mesmo animal, mas em um chifre uterino diferente. Isso nos permite comparar ambos os efeitos experimentais, reduzindo o fator materno dos resultados.

Hoje, os métodos de ET não cirúrgicos não estão em uso no coelho. Alguns estudos realizados no final dos anos 90 utilizando uma técnica de et transcervical resultaram em baixas taxas de entrega variando de 5,5% a 20,0%^11,12 versus 50-65% por métodos cirúrgicos, entre eles o procedimento de laparoscopia descrito por Besenfelder e Brem¹⁸. As baixas taxas de sucesso desses métodos de ET não cirúrgicos em coelhos coincidem com a falta de remodelação embrionária necessária no oviduto, o que é evitado em ET transcervical. Aqui, nós descrevemos um procedimento Laparoscopic minimamente invasor eficaz do ET usando coelhos como um organismo modelo. Esta técnica fornece um modelo para a pesquisa reprodutiva mais adicional em animais e em seres humanos grandes.

Como os coelhos têm uma janela de tempo particularmente estreita para a implantação de embriões, a ET nesta espécie requer um alto grau de sincronia entre o estágio de desenvolvimento do embrião no ET e o estado fisiológico do receptor²⁷. Em alguns casos, após um tratamento reprodutivo que retarda o desenvolvimento embrionário (como a cultura in vitro ) ou altera a receptividade endometrial (como os tratamentos de superovulação), não há sincronia entre o embrião e o útero materno. Essas situações podem afetar negativamente o desfecho. Para responder nesses contextos, descrevemos um protocolo de vitrificação de mórula de coelho eficaz que nos permite pausar, organizar e retomar os experimentos. Este processo é logisticamente desejável para estudos reprodutivos e nos dá a capacidade de armazenamento a longo prazo de embriões, permitindo o seu transporte. O procedimento laparoscópico e as estratégias de criopreservação permitem melhor planejamento de estudos com menos animais. Assim, nossa metodologia oferece vantagens higiênicas e econômicas e está em conformidade com o conceito de 3Rs (substituição, redução e refinamento) da pesquisa animal com o objetivo declarado de melhorar o tratamento humano de animais experimentais. Assim, com estes métodos, os coelhos constituem um organismo modelo ideal para ensaios in vivo reprodutivos.