न्यूनतम इनवेसिव भ्रूण हस्तांतरण और खरगोश मॉडल में इष्टतम भ्रूण के चरण में भ्रूण काचन
Summary
सहायक प्रजनन तकनीकों (आर्ट्स) परिणामों में सुधार और संबद्ध जोखिमों को कम करने के लिए लगातार मूल्यांकन में हैं । इस पांडुलिपि एक ंयूनतम इनवेसिव भ्रूण स्थानांतरण प्रक्रिया एक कुशल cryopreservation प्रोटोकॉल है कि मानव प्रजनन के एक आदर्श पशु मॉडल के रूप में खरगोशों के उपयोग की अनुमति देता है के साथ वर्णन करता है ।
Abstract
असिस्टेड प्रजनन तकनीक (आर्ट्स), जैसे कि इन विट्रो भ्रूण संस्कृति या भ्रूण cryopreservation, प्रसवकालीन और प्रसवोत्तर परिणामों के साथ प्राकृतिक विकास पैटर्न को प्रभावित करती है । कला अनुप्रयोगों के अहानिकर सुनिश्चित करने के लिए, पशु मॉडल में अध्ययन आवश्यक हैं । इसके अलावा, एक अंतिम कदम के रूप में, भ्रूण विकास अध्ययन उनकी क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए पूर्ण अवधि के स्वस्थ वंश का विकास करने की आवश्यकता है । यहां किसी भी कला संबंधी प्रयोग को करने के लिए गर्भाशय में भ्रूण का स्थानांतरण अपरिहार्य है ।
खरगोश एक सदी से अधिक के लिए स्तनधारी प्रजनन अध्ययन करने के लिए एक मॉडल जीव के रूप में इस्तेमाल किया गया है । मानव प्रजातियों और इसके छोटे आकार और कम रखरखाव लागत के लिए अपने जातिवृत् तीय निकटता के अलावा, यह प्रेरित ovulation के रूप में महत्वपूर्ण प्रजनन विशेषताओं, प्रारंभिक भ्रूण के विकास के एक कालक्रम मनुष्यों के समान है और एक छोटी गर्भावधि है कि हमें कला आवेदन के परिणामों को आसानी से अध्ययन करने की अनुमति देते हैं । इसके अलावा, कला (जैसे कम शुक्राणु इंजेक्शन, भ्रूण संस्कृति, या cryopreservation) के रूप में इस प्रजाति में उपयुक्त दक्षता के साथ लागू कर रहे हैं ।
इस अनुच्छेद में प्रस्तुत लेप्रोस्कोपिक भ्रूण स्थानांतरण तकनीक और cryopreservation प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम वर्णन 1) कैसे एक आसान, ंयूनतम इनवेसिव तकनीक के माध्यम से भ्रूण हस्तांतरण करने के लिए और 2) एक प्रभावी दीर्घकालिक भंडारण के लिए प्रोटोकॉल खरगोश की भ्रूण को समय लचीला साजो क्षमताओं और नमूना परिवहन करने की क्षमता प्रदान करने के लिए । विभिंन विकासात्मक चरणों में खरगोश के भ्रूण के स्थानांतरण के बाद प्राप्त परिणामों से पता चलता है कि मोरूला खरगोश भ्रूण वसूली और हस्तांतरण के लिए आदर्श चरण है । इस प्रकार, एक अंडवाहिनी भ्रूण हस्तांतरण की आवश्यकता है, शल्य चिकित्सा प्रक्रिया को उचित ठहराते । इसके अलावा, खरगोश morulae सफलतापूर्वक काचित और laparoscopically स्थानांतरित कर रहे हैं, वर्णित तकनीकों की प्रभावशीलता साबित ।
Introduction
मानव बांझपन को दरकिनार या उच्च आनुवंशिक मूल्य के पशुधन के प्रसार में सुधार लाने और पशु आनुवंशिक संसाधनों के संरक्षण के उद्देश्य के साथ, तकनीकों का एक सेट सामूहिक रूप से सहायता प्रदान की प्रजनन प्रौद्योगिकियों, जैसे superovulation, में कहा विट्रो निषेचन, भ्रूण संस्कृति, या cryopreservation,1,2विकसित किए गए । वर्तमान में, हार्मोनल उपचार अंडाशय को उत्तेजित करने के लिए दिया जाता है और कोटरीय डिम्बग्रंथि के रोम की एक बड़ी संख्या का उत्पादन1। इन रोम से एकत्र oocytes परिपक्व हो सकता है, निषेचित, और विट्रो में विकसित जब तक वे या तो cryopreserved या सरोगेट माताओं3को हस्तांतरित कर रहे हैं । हालांकि, इन उपचारों के दौरान युग्मकों और युग्मज गैर-शरीरक्रियात्मक प्रक्रियाओं की एक शृंखला के संपर्क में आ जाते हैं जिससे इन स्थितियों में जीवित रहने के लिए भ्रूण अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है4,5. इस अनुकूलन जल्दी भ्रूण plasticity है, जो जीन अभिव्यक्ति और विकासात्मक प्रोग्रामिंग6में भ्रूण परिवर्तन की अनुमति देता है के कारण संभव है । हालांकि, इन संशोधनों वयस्कता जब तक भ्रूण के विकास के बाद के चरणों को प्रभावित कर सकते हैं, और अब यह व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते है कि तरीकों, समय, cryopreservation प्रक्रिया या संस्कृति की स्थिति भ्रूण7 भाग्य पर विभिंन परिणाम दिखाने , 8. इसलिए, कला के विशिष्ट प्रभाव को स्पष्ट करने के लिए, अच्छी तरह से विशेषता पशु मॉडल का उपयोग अपरिहार्य है ।
१८९०9में स्तनधारी भ्रूण के हस्तांतरण के परिणामस्वरूप पहले प्रलेखित जीवित जंम लिया । आज, एक किराए की महिला को भ्रूण हस्तांतरण (एट) के बाद भ्रूण विकास10चरणों पर preimplantation के दौरान कला प्रेरित प्रभाव का अध्ययन करने में एक महत्वपूर्ण कदम है । ET तकनीक प्रत्येक जानवर के आकार और संरचनात्मक संरचना पर निर्भर करते हैं । बड़े आकार के पशु मॉडलों के मामले में, यह ट्रांसर्विकल nonsurgical ET तकनीकों द्वारा एट प्रदर्शन करने के लिए संभव हो गया है, लेकिन छोटी-सी प्रजातियों में गर्भाशय ग्रीवा कैथेटेराइजेशन अधिक जटिल है और शल्य चिकित्सा तकनीकों अक्सर11इस्तेमाल कर रहे हैं । हालांकि, सर्जिकल एट खून बह रहा है कि प्रत्यारोपण और भ्रूण के विकास को ख़राब कर सकता है, के रूप में रक्त गर्भाशय लुमेन आक्रमण कर सकते हैं, भ्रूण मौत10के कारण कर सकते हैं । ट्रांसेविकल nonsurgical ET तकनीक अभी भी मनुष्यों में लागू कर रहे हैं, baboons, गोजातीय, सूअर और चूहों12,13,14,15,16,17, लेकिन सर्जिकल ईटीएस अभी भी बकरियों, भेड़ या अंय जानवरों के रूप में प्रजातियों में इस्तेमाल किया जा रहा है जो अतिरिक्त कठिनाइयों वर्तमान जैसे खरगोश के रूप में10,18,19,20,21, (दो स्वतंत्र सेवाओं) या चूहों (छोटे आकार) । फिर भी, शल्य चिकित्सा हस्तांतरण के तरीकों को धीरे से कम आक्रामक तरीकों से प्रतिस्थापित किया गया है करते हैं । एंडोस्कोपी भ्रूण हस्तांतरण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, उदाहरण के लिए, खरगोशों में, सूअर और छोटे जुगाली करने वाले18,19,20। इन ंयूनतम इनवेसिव एंडोस्कोपी तरीकों के लिए किया जा सकता है भ्रूण स्थानांतरण के माध्यम से तुंबिका में infundibulum, जो खरगोशों में आवश्यक है और कुछ प्रजातियों में लाभप्रद प्रभाव का प्रदर्शन20। यह अंडवाहिनी में आरंभिक भ्रूण की अवस्था के दौरान भ्रूण और माता के बीच सही संवाद के महत्व पर आधारित है । जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, भ्रूण remodeling है कि खरगोशों में अंडवाहिनी के माध्यम से भ्रूण प्रवास के दौरान जगह लेता है22,23प्रत्यारोपण करने में सक्षम भ्रूण को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है ।
ऐसे गोजातीय के रूप में बड़े आकार के पशु मॉडल, दिलचस्प है क्योंकि जैव रासायनिक और preimplantation सुविधाओं के मानव प्रजातियों में उन लोगों के समान है24। हालांकि, बड़े जानवर भी प्रारंभिक परीक्षणों में उपयोग करने के लिए महंगा कर रहे हैं, और कृंतकों एक आदर्श मॉडल माना जाता है (७६% मॉडल जीवों कृंतकों हैं) प्रयोगशाला अनुसंधान के लिए25. फिर भी, खरगोश मॉडल प्रजनन अध्ययन में कृंतकों पर कुछ लाभ प्रदान करता है, के रूप में कुछ प्रजनन जैविक मानव द्वारा प्रदर्शित प्रक्रियाओं चूहों में उन लोगों की तुलना में खरगोश में अधिक समान हैं । मानव और खरगोश एक समान कालानुक्रमिक भ्रूणीय जीनोम सक्रियण, कंदुकन और hemochorial अपरा संरचना प्रस्तुत करते हैं । इसके अलावा, खरगोशों का उपयोग करना यह उनके प्रेरित ovulation25के कारण निषेचन और गर्भावस्था के चरणों के सही समय पता करने के लिए संभव है । खरगोश जीवन चक्र कम कर रहे हैं, 31 दिनों में गर्भावधि को पूरा करने और के बारे में 4-5 महीने में यौवन तक पहुँचने; पशु अपने विनंर और गैर आक्रामक व्यवहार के कारण संभाल करने के लिए आसान है, और उसके रखरखाव बड़ा जानवरों की कीमत की तुलना में बहुत किफायती है । इसके अलावा, यह उल्लेख है कि खरगोशों दो स्वतंत्र cervixes11,25के साथ एक डुप्लेक्स गर्भाशय है महत्वपूर्ण है । यह एक तरजीही स्थिति में खरगोश स्थानों, विभिंन प्रयोगात्मक समूहों से भ्रूण के रूप में एक ही जानवर में स्थानांतरित किया जा सकता है, लेकिन एक अलग गर्भाशय सींग में । यह हमें दोनों प्रयोगात्मक प्रभाव की तुलना करने की अनुमति देता है, परिणाम से मातृ कारक को कम करने.
आज, nonsurgical ET तरीकों खरगोश में उपयोग में नहीं हैं । कुछ अध्ययनों से देर से 90 के दशक में बाहर किया एक ट्रांसेवियरल की तकनीक का उपयोग कर कम प्रसव ५.५% से २०.०%11,26 बनाम 50-65% के लिए शल्य चिकित्सा पद्धतियों द्वारा की दर के परिणामस्वरूप, उन के बीच में लेप्रोस्कोपी प्रक्रिया द्वारा वर्णित Besenfelder और Brem18। खरगोशों में इन nonsurgical ET तरीकों की कम सफलता दरों अंडवाहिनी में आवश्यक भ्रूण remodeling की कमी के साथ मेल खाती है, जो ट्रांसेविएट में बचा है । यहाँ, हम एक आदर्श जीव के रूप में खरगोशों का उपयोग कर एक प्रभावी ंयूनतम इनवेसिव लेप्रोस्कोपिक प्रक्रिया का वर्णन । इस तकनीक के बड़े जानवरों और मनुष्यों में आगे प्रजनन अनुसंधान के लिए एक मॉडल प्रदान करता है ।
क्योंकि खरगोश भ्रूण रोपण के लिए एक विशेष रूप से संकीर्ण समय खिड़की है, इस प्रजाति में एट एट में भ्रूण के विकास के चरण और प्राप्तकर्ता27के शारीरिक स्थिति के बीच synchrony के एक उच्च डिग्री की आवश्यकता है । कुछ मामलों में, एक प्रजनन उपचार है कि भ्रूण के विकास को धीमा कर देती है (जैसे कि विट्रो संस्कृति में ) या एंडोमेट्रियल ग्रहणशीलता (जैसे superovulation उपचार के रूप में) बदल, भ्रूण और मातृ गर्भाशय के बीच कोई synchrony है । इन स्थितियों नकारात्मक परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं । इन संदर्भों में प्रतिक्रिया करने के लिए, हम एक प्रभावी खरगोश मोरेला काचन प्रोटोकॉल का वर्णन है कि हमें थामने के लिए, संगठित करने और प्रयोगों को फिर से शुरू करने की अनुमति देता है । इस प्रक्रिया को प्रजनन अध्ययन के लिए logistically वांछनीय है और हमें भ्रूण के दीर्घकालिक भंडारण के लिए क्षमता देता है, उनके परिवहन की अनुमति । लेप्रोस्कोपिक प्रक्रिया और cryopreservation रणनीतियों कम जानवरों के साथ अध्ययन की बेहतर योजना की अनुमति देते हैं । इस प्रकार, हमारी कार्यप्रणाली स्वास्थ्यकर और आर्थिक लाभ प्रदान करती है और प्रायोगिक पशुओं के मानव उपचार में सुधार के कथित लक्ष्य के साथ पशु अनुसंधान के 3Rs (प्रतिस्थापन, कमी और परिष्करण) की अवधारणा के अनुरूप है । इस प्रकार, इन तरीकों के साथ, खरगोश के लिए एक आदर्श मॉडल जीव का गठन vivo में प्रजनन assays हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हस्तांतरित भ्रूण9से पहले प्रलेखित जीवित जंम के मामले के बाद से, इस तकनीक और खरगोश प्रजातियों प्रजनन अध्ययन में महत्वपूर्ण बन गए हैं । इसके अलावा, हेरफेर, उत्पादन, cryopreservation, आदि शामिल भ्रूण अनुसंध?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम अर्थव्यवस्था और स्पेन की प्रतिस्पर्धा (AGL2017-85162-C2-1-R) और Generalitat Valenciana अनुसंधान कार्यक्रम (PrometeoII 2014/036) के मंत्रालय से धन द्वारा समर्थित किया गया था. अंग्रेजी पाठ N. Macowan अंग्रेजी भाषा सेवा द्वारा संशोधित संस्करण
Materials
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 332 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Alvet Escartí | 626 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Buserelin Acetate | Sigma Aldrich | B3303 | |
| Clorhexidine digluconate soap | Alvet Escartí | 0265DCCJ500B | |
| Clorhexidine digluconate solution | Alvet Escartí | 0265DCCA500B | |
| CO2 | Air Liquide | 99921 | CO2 N48. |
| CO2 Incubator | Fisher scientific | 15385194 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | W387509 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D5773 | Without calcium chloride. |
| Electric razor | Oster Golden A5 | 078005-140-002 | |
| Endoscope camera | Optomic Spain S.A | OP-714 | |
| Endoscope trocar with silicone leaflet valve | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | 30114GK | Lightweight trocar model. |
| Enrofloxacin | Alvet Escartí | 9993046 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Epicraneal needle 23G | Alvet Escartí | 514056353 | Smaller needles can be also used. |
| Epidural catheter | Vygon corporate | 187.10 | |
| Epidural needle | Vygon corporate | 187.10 | |
| Ethylene Glycol | Sigma Aldrich | 102466-M | |
| Eye ointment | Alvet Escartí | 5273 | |
| Ketamine hydrochloride | Alvet Escartí | 184 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Laparoscopy equipment | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | 26003 AA | Hopkins® Laparoscope, 0º-mm straight-viewing laparoscope, 30-cm length, 5-mm working channel. |
| Light source | Optomic Spain S.A | Fibrolux 250 | |
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | P1505XXX | |
| Mechanical CO2 insufflator | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | Endoflator® | |
| Meloxicam | Alvet Escartí | 9993501 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Petri dishes, 35-mm | Sigma Aldrich | CLS430165-500EA | |
| Plastic dressing (Nobecutan) | IBOR medica | 7140028 | |
| Plastic Straw 0.25 mL | IMV – technologies | 6431 | |
| Povidone iodide solution | Alvet Escartí | 02656DPYS500S | |
| Scissors | ROBOZ | RS-5880 | Any regular surgical grade steel small straight scissors will work. |
| Silicone tube for insufflator | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | 20400040 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16F | There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. |
| Sterile Gloves | Alvet Escartí | 087GL010075 | |
| Sterile gown | Alvet Escartí | 12261501 | |
| Sterile mask | Alvet Escartí | 058B15924B | |
| Straw Plug | IMV – technologies | 6431 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Syringe, 1-mL | Fisher scientific | 11750425 | |
| Syringe, 5-mL | Fisher scientific | 11773313 | |
| Urinary catheter | IMV – technologies | 17722 | |
| Waterbath | RAYPA | BAE-4 | |
| Xylazine | Alvet Escartí | 525225 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Rabbits | Universitat Politècnica de València | Line A | Other maternal lines, such as Line V or Line HP can be used. |
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