Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Keri L Colabroy; Katlyn Mayer

doi:10.3791/58012

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biochimie

Benchtop. מרותק למיטה כרומטוגרפיית זיקה מתכת, שיחזור ותייגת וזמינותו של Polyhistidine Metalloenzyme עבור המעבדה לתואר ראשון

Published: August 23, 2018

doi:

10.3791/58012

Keri L Colabroy¹, Katlyn Mayer¹

¹Department of Chemistry,Muhlenberg College

Summary

כאן נציג של פרוטוקול benchtop ותשמרו זיקה מתכת כרומטוגרפיה לטיהור ודה למפת עוקבות polyhistidine מתויג, ברזל heme שאינו מחייב dioxygenase מתאים המעבדה הוראה לתואר ראשון.

Abstract

Benchtop ותשמרו מתכת כרומטוגרפיית זיקה (IMAC), של חלבונים polyhistidine מתויג הוא לשלוט בקלות על ידי סטודנטים לתואר ראשון, הפך בשיטת טיהור חלבון הנפוצה ביותר בספרות המודרנית. אבל, היישום של כרומטוגרפיית זיקה המתכת מחייב חלבונים, במיוחד אלה עם חמצון-חיזור מתכות רגישים כגון ברזל, לעיתים קרובות מוגבל מעבדות עם גישה לתיבת הכפפות – ציוד שאינו זמין באופן שגרתי לתואר ראשון מעבדה. במאמר זה נדגים את השיטות שלנו benchtop בידוד, שיחזור יון מתכת וטיהור של פולי-היסטידין מתויג IMAC, חמצון-חיזור-פעיל, הלא-heme ברזל מחייב extradiol dioxygenase, וזמינותו של dioxygenase עם סובסטרט מגוונת ריכוזי, קולח חמצן. שיטות אלה הוצאו להורג על ידי סטודנטים לתואר ראשון, מיושמת במעבדות מחקר והוראה לתואר ראשון עם מכשור זה נגיש ובמחיר בעיקר לתואר ראשון במוסדות.

Introduction

דיווחים ראשונים על הטיהור של חלבון polyhistidine מתויג של תמציות של אורגניזם מארח באמצעות קלאציה של התג היסטידין מתכת קיבוע נכנסו לספרות בשנת 1988¹^,². מאז, התוספת של תגים polyhistidine חומרים וטיהור שלהם על ידי קיבוע המתכת (IMAC) כרומטוגרפיית הפכו כמעט בכל מקום ספרות הביוכימי³^,⁴^, ⁵. ניתן ליישם שיטות לטיהור IMAC על benchtop, באמצעות בדיקות אוטומטיות, בתבניות ספין-טור. בעוד שיטות לטיהור זיקה, במיוחד IMAC, נמצאים בשימוש נרחב במעבדות מחקר, הם פחות נפוצים במעבדה הוראה לתואר ראשון. ספרי הלימוד של המעבדה הנפוצה ביותר עבור המעבדה לביוכימיה לא שגרתי ללמד בשיטות אלה, במקום בחירה של יונים מסורתיים יותר או לצבוע מחייב כרומטוגרפיה⁶^,⁷^,⁸ ^, ⁹. לדוגמה, הטיהור של לקטט דהידרוגנאז אנדרסון¹⁰ משתמש באהדה על-ידי צבע-איגוד, ומשתמש הטיהור של פרה חלב α-לקטלבומין⁷^,¹¹ על ידי בויאר ניקל-nitriloacetic מטריקס חומצה, אך אין תוית פוליפוני רקומביננטי-היסטידין, במקום להסתמך על זיקה חזקה מהותי של החלבון השרף. כמה ספרי לימוד לתואר ראשון המעבדה המודרניים, פרסומים ליישם קיבוע כרומטוגרפיית מתכת על פולי-היסטידין מתויג מטרות חלבון כגון חלבונים ירוק או אדום-פלורסנט¹²^,¹³^, ¹⁴^,¹⁵נוגדנים¹⁶, אנזימים שנבחר¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰, אפילו בחלק פונקציה לא מוכרות²¹. ניתן לטעון, הטיהור של אנזים עדיפה במעבדה ההוראה, כי המטרה יכול להיות לבדיקה לפעילות בהפעלות עוקבות, מעשיר את החוויה של “מדע אמיתי” אצל התלמיד; אכן, אלו סוגים של חוויות מעבדה פורסמו ודיווח תוצאות מועילות על התלמיד לומד¹⁷^,¹⁸^,²⁰^,²¹. ובכל זאת, יישומים של ה-IMAC אנזים טיהור בביוכימיה מלמד מעבדה דלילים ו השיטות שפורסמו עשוי אפילו מניח גישה מכשור כרומטוגרפיה שאינה זמינה בדרך כלל עבור משתמשים במעבדה בכיתה ²⁰. ישנן גם מגבלות ביישום של ה-IMAC ועד metalloproteins, במיוחד אלה אשר מאגד מתכות כלט חמצון-חיזור רגיש החיוניים פעילות²². לעתים קרובות, יון מתכת אבד או מחומצן במהלך טיהור מניב אנזים לא פעיל נועד למעבדה לתואר ראשון.

מלא שליש אנזימים לאגד של יון מתכת²³, למרות דרישה כמעט אוניברסליים עבור ברזל בכל צורות החיים²³, ברזל ניתן לטעון בין היונים מתכת הבעייתי ביותר ב אנזימולוגיה. Non-heme Fe^{2 +} איגוד אנזימים הם מועדים במיוחד אובדן ו/או חמצון של המתכת במהלך IMAC; ככל הנראה עקב חוסר ליגנד אורגני ייעודי כמו heme וקלות עם אילו Fe^{2 +} יכול מביצועם של חומצת אמינו ליגנדים²⁴. יתר על כן, חמצון תלויים חמצן של Fe^{2 +} ל Fe^{3 +} היא ספונטנית ב תמיסה מימית, בשל השינוי השלילי אנרגיה חופשית ואת היציבות היחסית של Fe^{3 +}. לעתים קרובות, האתגרים הללו הם להתגבר על ידי השימוש אנאירובית אווירה ו/או אי-IMAC שיטות כרומטוגרפיות²². במאמר זה נדגים את השימוש benchtop IMAC לטהר את Fe^{2 +} metalloenzyme תלויה בסדר גמור dioxygenase באמצעות ציוד כרומטוגרפיה פשוטה, זולה, ואחריו את בנייתו מחדש של האתר הפעיל Fe^{2 +}, ו assay אנזימטי. שיטות אלה הם הסטנדרט שלנו מעבדה ביוכימיה לתואר ראשון של 6-12 קבוצות סטודנטים והוא יכול לשמש כדי להרחיב את הרפרטואר של אנזים חקירות ברמת לתואר ראשון.

Protocol

1. הכנה טיהור הכנת תמצית ללא תא גולמי להשיג גלולה תא ~ 9-10 גרם של e. coli (BL21) זה overexpressed מטאלופרוטאין polyhistidine מתויג25 צינור חרוטי 50 מ. הוסף 5 מ לגרם חדר temp פירוק/איגוד מאגר (50 מ”מ פוספט, 300 מ”מ NaCl, imidazole 10 מ מ ב- pH 8) ~ 9-10 גרם של התא גלולה עבור הנפח הכולל ~ 45-50 מ”ל. מעת לעת מערבולת לעודד פירוק. אם בגדר היה קפוא, להפשיר באמבט מים פושרים. באמצעות קרח-תנורים, מקררים התליה תא ~ 3 מעלות לקראת פירוק התא.הערה: בשלב זה, פירוק התא על ידי sonication, חרוז הטחינה או שיטה אחרת הוא אפשרי. חרוז הטחינה הוא הפגין כאן כי זה מהיר, זול יחסית, והוא אינו דורש קסוות נגד רעש. להרכיב חרוז 50 מ ל כרסום קאמרית על פי הוראות היצרן. מילוי תא מיל חרוז חצי מלא מקורר חרוזי זכוכית 0.1 מ מ אשר אוחסנו ב-20 ° C. למלא את שאר התא התליה תא צוננת ולהשתמש מאגר פירוק/איגוד 4 ° C כדי למלא את החדר לגמרי. השתמש במרית קטן כדי לסובב את ציר המטחנה חרוז ומערבבים התליה תא עם החרוזים. להסיר את כל הבועות גדולות עם pipet ולאחר מכן לזיין את המכסה על. יבש את החדר של דליפה כלשהי. להוסיף כ- 1 כוס קרח הז’קט ברור, פלסטיק, להפוך את התא מלא 50 מ לתוך קרח מילא את הז’קט, בורג סגור. אבטח את התא קליבר קרח על גבי המנוע. הפעלת הטחנה חרוז מוטוריים על 15 שניות בכל סל ד 15,800 ולאחר מכן לאפשר מנוחה במשך 45 שניות. חזור על 8 פעמים. לאחר שתשלים מחזורי 8, decant את המתלים פירוק התא כולו 50 מ ל או צינור גדול מדורג על מהירות גבוהה צנטריפוגה (25,000 x גרם ומעלה). מקום זוג צינורות מאוזנת צנטריפוגה ומסתובב ב 25,000 x g במשך 40-45 דקות ב 4° C כדי הצניפה תא פסולת וזכוכית חרוזים.הערה: אם 50 מ ל או צינורות גדולים מדורג על מהירות גבוהה צנטריפוגה אינם זמינים, להסיר את חרוזי זכוכית על-ידי צריך שתוציאו ב 1000-2000 x g למשך 2-3 דקות 50 מ ל צינור חרוטי להניב אמצעי אחסון קטן יותר של התא השעיה (~ 25 מ ל) זה יכול להיות יצק לתוך volum קטן יותר צינור אלקטרוני מדורג עבור מהירות גבוהה צנטריפוגה. עם השלמת צנטריפוגה, decant תמציות ברורה, צהוב, ללא תאים, גולמי לתוך צינור חרוטי נקי 50 מ. לטפל לא כדי להעביר את כל שאריות תאים. לאסוף מדגם קטן של תמציות ללא תא גולמי לניתוח בשלב מאוחר יותר של הטיהור מרחביות-עמוד26. הכנה של העמודה IMAC להשיג עמודה 1.5 x 20 ס מ מצויד עם תמיכה המיטה התחתונה כדי לשמור על שרף חלקיקים, פורקן נעל זכוכית, על הכובע העליון המכיל גם למדוד נעל זכוכית. מתאים לשקע נעל-סכינים סטריליים-עם צימוד כדי לשלוט בזרימת. בעבודה benchtop, בצורה מאובטחת הר העמודה על דוכן טבעת. להשיג של slurry 50% של חומצה nitriloacetic ניקל מכורך שרף (Ni-נ) 20% אתנול שאוחסן ב 4 º C. מערבולת בעדינות את הבקבוק להשעות באופן שווה מחדש השרף. העובדים בטמפרטורת החדר, ועל benchtop, שימוש pipet בוגר לסגת 2 מ”ל של slurry, אשר תניב 1 מ”ל של התיישבו שרף מסוגל איגוד 50-60 מ”ג של polyhistidine מתויג חלבון, ולהעביר את slurry לעמודה. לפתוח את צימוד ולאפשר את פתרון אחסון עודף ניקוז על ידי הכבידה של השרף. לסגור את צימוד בצורה מאובטחת באמצעות pipet של פסטר, בזהירות להוסיף מאגר פירוק צוננות/bind (50 מ”מ פוספט, 300 מ”מ NaCl, imidazole 10 מ מ ב- pH 8) ו לעמודה של שרף – לפחות 30 מ ל. . שמור על עצמך שלא להפריע את פני השטח של שרף. הפעל את המאגר במורד הקירות של העמודה כדי למנוע מתיז. Equilibrate השרף על-ידי מתן המאגר פירוק/bind לנקז לאט מן העמודה על-ידי כוח המשיכה לתוך גביע אוסף. כאשר המאגר פירוק/איגוד יש בעיקר רוקן, לסגור את צימוד לעצור את הזרימה של מאגר כאשר ~ 5 מ של פירוק מאגר נשאר למעלה השרף ולהשאיר את העמודה, רכוב זקוף, עד מוכן להמשיך או עד 1 לשבוע. 2. טיהור של יעד מתויג Polyhistidine על ידי ה-IMAC להכין מאגר לשטוף (50 מ”מ פוספט, 300 מ”מ NaCl, 20 מ מ imidazole pH 8) • תנאי מאגר (50 מ מ פוספט, 300 מ”מ NaCl, imidazole 250 מ מ, 10% גליצרול pH 8). . תירגע ב 4 º C. להכין את העמודה Ni-נ התוספת של תמציות גולמי ללא תא על-ידי פתיחה של צימוד ומאפשר שנותרו פירוק/איגוד מאגר לנקז המשיכה דרך השרף Ni-נ. ת. כאשר כל המאגר יש רוקן, השטח שרף חשוף, סגור את צימוד. שימוש pipet פסטר, בזהירות pipet גולמי חינם התא תמציות אל השרף, דואגת שלא להפריע את פני השטח. הפעל את תמציות גולמי במורד הקירות של העמודה כדי למנוע מתיז. הנפח של תמציות גולמי חלה תלויה רמת הביטוי של החלבון מתויג polyhistidine; להבטיח הנפח הכולל של תמציות גולמי מכיל 50-60 מ ג או פחות של החלבון היעד לכל מיליליטר Ni-נ שרף (ראה שלב 1.2.4). כאשר כל תמציות גולמי הועברו אל העמודה, לפתוח את צימוד כך העמודה יכולה לרוקן על ידי הכבידה. זרם זה דרך מורכב של חלבונים לא היה מאוגד שרף – לאסוף 100 μL לניתוח בשלב מאוחר יותר של הטיהור מאת מרחביות-דף. 26 צמיגות של תמציות ללא תא גולמי עשוי להאט את זרימת הכבידה של העמודה במידה ניכרת. כדי להגביר את קצב הזרימה, החל פשוטה “משאבת-יד”: לקחת מזרק 10 מ ל זכוכית-lock וחבר אותו כובע של העמודה באמצעות באורך קצר של צינורות פלסטיק, ריהוט זכוכית-lock בין הכיפה העמודה ואת המזרק. למשוך את הבוכנה מזרק ולאחר מכן מתאימים בחוזקה את הכובע עמודה בראש העמודה. בעדינות לדחוס את הבוכנה של המזרק תוך ידנית הערכת קצב הזרימה על ידי איסוף את eluent לתוך משורה; המחירים של 1-2 מ ל לדקה תואמים השרף, תוכנית התקנה זו. העלייה דחיסה של מזרק הבוכנה בעדינות כמו מאט את קצב הזרימה. כדי למנוע כניסת אוויר לתוך השרף, הסירי את הפקק עמודה מחוברת משאבת יד במניסקוס הנוזל יישומית מגיע ל 5-10 מ מ מעל המיטה שרף, ומאפשרים האחסון הנותרת לנקז על ידי הכבידה. כאשר התא תמציות גולמי חינם סיימו את ניקוז השטח שרף נחשף שוב, השתמש pipet של פסטר בזהירות להוסיף ~ 30 מ של מאגר שטיפת צונן העמודה – מטפל שלא להפריע את פני השטח של השרף. הפעל את המאגר במורד הקירות של העמודה כדי למנוע מתיז. לפתוח את צימוד ולאפשר המאגר לשטוף לנקז באמצעות המדור. תהליך זה הוא הסרת חלבונים בחולשה מאוגד השרף. למחוק את eluent. בעוד המאגר שטיפת מרוקן, הכנת בת שש עשרה, עם תוויות, microcentrifuge צינורות איסוף השברים 1 מ”ל. כאשר המאגר שטיפת יש רוקן, השטח שרף נחשף שוב, סגור את צימוד. השתמש pipet של פסטר בזהירות להוסיף ~ 30 מ”ל • תנאי צוננת מאגר העמודה – מטפל שלא להפריע את פני השטח של השרף. הפעל את המאגר במורד הקירות של העמודה כדי למנוע מתיז. פתח את צימוד לאט ולאפשר המאגר • תנאי elute החלבון polyhistidine מתויג מן העמודה. לאסוף 1 מ”ל של eluent בכל אחד הצינורות המסומנים microcentrifuge, 1 עד 16. מבחן השברים על חלבון באמצעות שיטת של ערכי צבע מוחלטים כמו assay ברדפורד או ספקטרוסקופיה UV-גלוי על פי שיטות ספציפיות ריאגנט ו/או מכשיר יצרני27,28. כפי שמוצג להלן, וזמינותו ערכי צבע מוחלטים באמצעות Coomassie כחול מוקטן לאמצעי μL 100 על מנת להקריב רק אמצעי אחסון קטן של כל שבר. לערבב 3 μL של כל שבר עם 100 µL של חלבון ערכי צבע מוחלטים assay ריאגנט ולבחון באופן ידני היווצרות של כל צבע כדי לציין הנוכחות של חלבון השבר; זיהוי עם ספקטרומטר אינה הכרחית. אם החלבון מצוי שבר 16, המשך eluting שברים 1 מ”ל ואת וזמינותו החלבונים מעת לעת, עד שברים eluted עוד להכיל כמות משמעותית של חלבון. לשלב חלבונים המכילים שברים לתוך צינור נקי חרוט, ולסגת מדגם 100 μL לניתוח בשלב מאוחר יותר על ידי מרחביות-עמוד26. להמשיך למפת קופקטור יון מתכת או להקפיא את החלבון של 3 מ ל aliquots ב-80 מעלות צלזיוס. להבטיח גליצרול 10% זה ייכלל ב • תנאי המאגר הוא cryoprotectant כדי לייצב את חלבון טהור בתקופת ההקפאה. עם השלמת • תנאי של העמודה Ni-נ, כל החלבונים כבוי העמודה, שנאספו שברים, עוברים עוד 25 מ”ל • תנאי המאגר באמצעות המדור, לאחסן בה את עמודת ב 4 ° C ~ 5 מ”ל • תנאי מאגר עבור אחסון לטווח קצר , או פירוק/איגוד המאגר עם 20% אתנול עבור אחסון ארוך טווח. 3. שיחזור של חלבון המטרה עם Fe2 + תוספת של Fe2 +הערה: ברזל heme שאינם (II) מחייב האנזים, כגון dioxygenase בסדר גמור בדוגמה זו, דורש Fe2 + יון לפעילות; עם זאת, הברזל (II) מתחמצן בקלות ברזל (III), אשר אינה פעילה, ומטהר שבריר של החלבון ללא ברזל כלשהו בכלל. כדי להתחיל את בנייתו מחדש של המתכת, להשיג 3 מ”ל של האנזים מטוהרים מושעה במאגר • תנאי. אם קפוא, להפשיר במהירות תוך שימוש באמבט מים פושרים, ולא פעם הקרת, לשים את החלבון על קרח. שימוש באמצעי האחסון של חלבון בצינור, לחשב את כמות הנתרן ascorbate (198.1 g/mol) הדרושים כדי להפוך את הריכוז הסופי 12.5 מ מ במדגם. כמו כן, לחשב את כמות dithiothreitol (DTT, 154.25 g/mol) הדרושים כדי להפוך את הריכוז הסופי 12.5 מ מ במדגם. הוסף את מוצק סודיום אסקורבט DTT ומערבבים בעדינות, אך ביסודיות, להתמוסס לחלוטין. לטפל לא כדי לגרום למשקעים חלבון עם ערבוב אגרסיבית מדי. להוסיף כמות קטנה של ברזל (II) heptahydrate סולפט (MW 278.01 g/mol) הדגימה חלבון. על מנת לקבל כמות קטנה מספיק של הברז, מלח ברזל מספר 1 מ”מ בגרגרים של מכל4•7H2O מוצק החוצה על פיסת שוקל נייר, מקפלים את הנייר מעל גרגר, ולרסק אותו עם הצד השטוח של מרית מתכת. להוסיף גרגר האבקה המתקבלת הצינור של חלבון. מערבולת לערבב צבע ורוד ורוד יופיעו בצינור. דגירה הפתרון ורוד של חלבון, כתרים, 10-30 דקות על קרח. צבע ורוד תימוג באיטיות לאורך זמן. ג’ל סינון להשתמש בעמודה סינון ג’ל ארוז עם 10 מ”ל של כדוריות ג’ל לזיהוי עם מגבלה אי-הכללה של משקל מולקולרי של 6000 ומגוון hydrated חלקיקים בגודל של 90-180 מיקרומטר בעמודה 1.5 x 12 ס מ, אשר מצויד גם עם מאגר 10 מ”ל. ודא העמודה מצויד עם התחתונה, המיטה העליונה תומך בצורה של 30 דיסקים פוליאתילן נקבובי um כדי לשמר את השרף בעמודה ולמנוע את המיטה שרף יבש. הר שעמודת סינון ג’ל עמדה טבעת. אם משתמש בעמודה סינון ג’ל ארוזים מראש, הסירי את הפקק, יוצקים את המאגר עודף מעל התמיכה המיטה העליונה. כדי equilibrate את העמודה, התחל על-ידי מילוי המאגר באמצעות מאגר תואם assay עוקבות ואחסון, לדוגמה, 50 מ”מ NaH2PO4, 200 מ”מ NaCl, גליצרול 10% ב- pH 8.0. אם משתמש בעמודה סינון ג’ל ארוזים מראש, הצמד את הקצה התחתון של ג’ל עמודה סינון להתחיל את הזרימה של מאגר ולחשוף ההתאמה slip סכינים סטריליים. מתאים של צימוד עד הסוף slip סכינים סטריליים של העמודה, אבל להשאיר את זה פתוח ולאפשר את העמודה לטפטף על ידי הכבידה. כאשר המאגר יש גמע מן העמודה התמיכה מיטה העליון חשוף, סגור את צימוד ולאחר להוסיף mL ~ 3 של metalloenzyme Fe (II) מחדש העמודה על-ידי pipetting הפתרון על התמיכה חשוף המיטה העליונה. לפתוח את צימוד ולאפשר המדגם כולו מ 3.0 ל להזין את העמודה על-ידי כוח הכבידה. להתעלם אלה 3 מ ל הראשון של eluent. כל צבע ורוד המהווה לטיפול הפתרון ילכדו בחלק העליון של העמודה. כאשר העמודה הפסיקו לטפטף התמיכה המיטה העליונה חשוף, להוסיף העמודה 4 מ”ל של המאגר ג’ל-סינון (למשל, 50 מ מ NaH2PO4, 200 מ”מ NaCl, גליצרול 10% ב- pH 8.0). פתח את צימוד ולאסוף את eluent לתוך צינורות microcentrifuge מעל שמונה שברים 0.5 mL. מבחן השברים על חלבון באמצעות שיטת ערכי צבע מוחלטים או UV מול27,28 כמתואר קודם לכן. לשלב חלבונים המכילים שברים. תיסוג מדגם עבור ניתוח מרחביות-עמוד26. להמשיך עם assay או אחסון של המדגם.

Representative Results

תוצאות נציג אלו נאספו על ידי סטודנטים לתואר ראשון כפי הם להורג פרוטוקול זה בתקופות מעבדה קורס שני של BCM 341: ביוכימיה ניסיוני במכללת Muhlenberg. איור 1 מדגים התוצאות של הטיהור של פולי-היסטידין 20 kDa מתויג metalloenzyme, dioxygenase בסדר גמור, כפי שבוצע על ידי שני סטודנטים לתואר ראשון במהלך תקופה מעבדה 4 שעות בכיתה וניתח מאת מרחביות-דף ע י אותו תלמידים במהלך תקופה מעבדה עוקבות. החלבון פולי-היסטידין מתויג הוא יעיל מטוהרים (איור 1, ליין 2). Immunoblot של הג’ל באמצעות נוגדן כנגד פולי-היסטידין התג מציין כי כמות קטנה של חלבון המטרה פולי-היסטידין מתויג הולך לאיבוד של הזרימה דרך (נתונים לא מוצג), סביר כי יותר מ- 100 מ ג כמות חלבון המטרה lysate חריגה הקיבולת איגוד של השרף. איור 2 מדגים פעילות התלמיד-אסף נתונים על התגובה אנזימטי של המטרה מתויגות metalloenzyme פולי-היסטידין, dioxygenase בסדר גמור, לאחר שיחזור עם ברזל (II), ג’ל-סינון הבאים כפי שמתואר על-ידי הפרוטוקול במסמך זה. השני חמש מתים-זמן לפני נתונים שנאספו מתחיל הוא טיפוסי של סטודנטים ביצוע טכניקה זו בפעם הראשונה. פעילות חזקה metalloenzyme זוהה שימוש assay שפורסמו ולאחר הניב בקנה אחד עם התוצאות שפורסמו29פרמטרים קינטי מצב יציב. מצב יציב פרמטרים קינטי נקבעו על ידי התאמת עקומות התקדמות30 שמוצג באיור 2; שיטת הריבועים הפחותים ליניארי ההתאמה של ראשוני המחירים שנגבו לאורך סדרה של ריכוז המצע זאת, באותה מידה אפשרית31. איור 1. ניתוח26 עמודים מרחביות של פולי-היסטידין מתויגות חלבון לפני, במהלך ואחרי טיהור. מסלולים 1 – משקל מולקולרי סמנים, חלבון מטוהרים-2 (20 kDa) פוסט Ni-נ. ת. 3-Ni-נ הזרימה, פירוק פוסט צניפה שאריות תאים – תא חינם גולמי תמציות לפני טיהור, 5 – 4. דגימות היו מוכנים באמצעות 5 x מדגם/טעינת מאגר ומופרדות על ג’לים לזיהוי טרומי 4-20% באמצעות מערכת ג’ל אלקטרופורזה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. באיור 2. מצב יציב וזמינותו של ברזל (II) מחדש metalloenzyme (קרי, בסדר גמור dioxygenase, 10µM) עם סובסטרט (בסדר גמור-5 מיקרומטר (אדום), 25 מיקרומטר (ירוק), 50 מיקרומטר (כחול)) במאגר (50 מ מ פוספט, 200 מ”מ NaCl, pH 8). עקבות מתארים את המוצר היווצרות ב 414nm. ספיגת נתונים נרכשו באופן רציף באמצעות וואקום methacrylate 1 מ”ל פיצול-קרן סריקה UV-גלוי ספקטרומטר29. הנתונים הגולמיים מתאים למודל של קירוב מצב יציב (KM מיקרומטר 30.8 ± 14.4, kהחתוללכאורה 2.3 s-1 ± 0.05) מיכאליס-מנטן30. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

בעוד התוספת של תגים polyhistidine חומרים וטיהור שלהם על ידי ה-IMAC הפך כמעט בכל מקום ספרות הביוכימי³^,⁴^,⁵, יישומים של ה-IMAC אנזים טיהור בביוכימיה מלמד מעבדה נותרו דליל, שיטות שפורסם לא תמיד לקחת בחשבון את מגבלות המשאבים ההוראה מעבדה²⁰. יתר על כן, השימוש של ה-IMAC במעבדה הוראה הוא היעיל ביותר כאשר מצמידים ניסויים זה להעריך את פעילות וטוהר, ביצוע טיהור IMAC של אנזים פעילות ההדרכה אידיאלי. על מנת להרחיב את היישום של ה-IMAC הטיהור של אנזימים, כולל metalloenzymes, במעבדה הוראה, שיטות אמינה וזולה נחוצים. ב פרוטוקול זה, נדגים benchtop IMAC בעזרת ציוד מעבדה זמינה וזולה, תוך התייחסות גם את המגבלות ביישום של ה-IMAC ועד metalloproteins²², על-ידי לשחזר את iron(II) תלויים metalloenzyme, dioxygenase בסדר גמור, פוסט טיהור. באמצעות נוגדנים וחומרים תיאר, אנו מעריכים שהעלות של חומרים מתכלים עבור קבוצות סטודנטים שמונה הוא בין 500-600 דולר בכל סמסטר להפעיל פרוטוקול זה, לרבות ניתוח השלבים המתוארים באיור 1 ו- 2 איור.

בשל הקלות שבה Fe^{2 +} יכול מביצועם של חומצת אמינו ליגנדים²⁴ ו חמצון נתיישב של Fe^{2 +} על ידי O₂ ל Fe^{3 +}, בנייתו מחדש של הלא-heme, הוא iron(II) chelated-חומצת אמינו לתוך metalloenzyme רקומביננטי רכיב אופייני של הטיהור אנזים. כאשר כרומטוגרפיה קלאסית, זה אפשרי למנוע אובדן מוחלט של ברזל כמה מקרים³², אך לעתים קרובות יותר, הברזל (II) מתווסף בחזרה בנוכחות צמצום סוכנים³³^,³⁴^,³⁵^, ³⁶ לעתים קרובות תחת³⁸^,³⁷^,atomosphere אנאירובית³⁹, ובחלק מן המקרים עודפי ברזל אינו מוסר³³^,³⁴^,³⁶, לסבך כל assay עוקבות. שלבים רצופים של כרומטוגרפיה קלאסיות ואווירה אנאירובית אינם מציאותיים עבור המעבדה לתואר ראשון, הנחיה הפיתוח של פרוטוקול זה.

בזמן הכנת ידנית של העמודה Ni-נ, העיבוד של דגימות במידה רבה על ידי הכבידה לקחת תוספת זמן ומאמץ לעומת עמודות ארוזים מראש ולא אוטומטית כרומטוגרפיה מכשור, השלבים הידניים מובאים לאפשר על הידיים לימוד על-ידי התלמיד כי התוצאה הבנה מוגברת של המדע מאחורי התהליך. התוספת של מלח ברזל (II) בכפוף לתנאים המפורטים כאן הוא רגישות גבוהה במיוחד dithiothreitol עודף. אם תלמיד מוסיף בטעות עודף של dithiothreitol, אירוע משקעים סביר. אנחנו גילינו את זה מועיל לדרוש התלמידים לבצע חישובים של ריאגנט כמויות לפני הגעתכם במעבדה, כך זמן המעבדה יכול לשמש באופן היעיל ביותר על הספסל. הטיהור IMAC benchtop כולה – מן התא-פירוק כדי • תנאי חלבון – ניתן להשיג בתקופה 4 שעות מעבדה אחד, ואחריו שיחזור ואת וזמינותו תקופתי המעבדה עוקבות.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

פרסום זה מבוסס על עבודה הנתמכים על ידי הקרן הלאומית למדע תחת גרנט מס צ’ה 1708237.

Materials

consumables
BeadBeater 0.1mm glass beads	BioSpec Products	11079101	1 pound each
50mL Conical Tubes with Screw Caps, sterile	VWR	21008-178
Sodium chloride	Fisher Bioreagents	BP358-1
Potassium phosphate, monobasic	Acros (Fisher)	AC42420-5000
Sodium Ascorbate	Acros (Fisher)	AC35268-1000
DTT (Dithiothreitol)	Lab Scientific	D-115
Iron(II) sulfate heptahydrate	Sigmaaldrich	310077
HisPur NiNTA Resin	Fisher (pierce)	PI88221
Econo-Column Chromatography Columns – 1.5 x 20cm	Bio-Rad	737-1522	1.5 x 20 cm, 35 ml, 2ea,
Stopcock Valve, one way, female to male luer	Kimble	420163-0000	pack of 50
BD 10mL luer-loc syringe (non-sterile, without needle)	VWR	301029
Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Female Luer	Biorad	7318222
Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Male Luer	Biorad	7318225
Silicon Tubing (1.6 mm ID/0.8 mm wall, for 0.2-5 ml/min on Peristaltic Pump)	Bio-Rad	7318211	Pkg of 1, 1.6 mm ID/0.8 mm wall, 10 m, low-pressure tubing for liquid handling
Glycerol	Fisher (Pierce)	17904
Coomassie Plus (Bradford) Protein Assay	Thermo Scientitic	23236
Microcentrifuge Tubes, snap cap, 1.5mL	VWR	89000-028
Fisherbrand polystyrene disposable serological pipets	Fisher	13-676-10F
Fiserbrand universal pipet pump	Fisher	14-955-110
Fisherbrand Transfer Pipets	Fisher	13-711-9AM
Econo-Pac 10DG desalting columns	Bio-Rad	732-2010	box of 30
ExpressPlus PAGE 5x sample buffer	Genscript	MB01015	5mL (Dilute 1:5 with sample)
ExpressPlus PAGE Gel, 4-20%, 12 wells	Genscript	M42012	20 gels
Fisherbrand Disposable Cuvettes, Methyacrylate	Fisher	14-955-128	case of 500
Cuvette Caps Square Disposable	Fisher	14-385-999
L-DOPA (3,4-dihydroxyphenylalanine)	Acros	D9628-5G
Permanent Equipment:
BeadBeater 50mL chamber	BioSpec Products	110803-50SS	1 chamber
BeadBeater	BioSpec Products	1107900-101	350 ml polycarbonate chamber, rotor assembly, motor base, ice-water cooling jacket and one pound of glass beads.
Centrifuge tubes, High-Speed PPCO, 50mL	Fisher	3119-0050PK
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel	Bio-Rad	1658004	4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	1645052	100–120/220–240 V, power supply for high-current applications, includes power cord
UV-1800 with UV-Probe Software	Shimadzu	UV-1800
Kintek Global Kinetic Explorer	Kintek Corp	version 6	https://www.kintekexplorer.com/downloads/

References

Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli, H., Gentz, R., Stüber, D. Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent. Nature Biotechnology. 6 (11), 1321 (1988).
Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins. Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).
Block, H., et al. Chapter 27 Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review. Methods in Enzymology. , 439-473 (2009).
Derewenda, Z. S. The use of recombinant methods and molecular engineering in protein crystallization. Methods. 34 (3), 354-363 (2004).
Gräslund, S., et al. Protein production and purification. Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
Switzer, R. L., Garrity, L. F. . Experimental Biochemistry. , (1999).
Boyer, R. . Modern Experimental Biochemistry, 3rd Edition. , (2001).
le Maire, M., Chabaud, R., Hervé, G. . Laboratory Guide to Biochemistry, Enzymology, and Protein Physical Chemistry: A Study of Aspartate Transcarbamylase. , (2012).
Bettelheim, F. A., Landesburg, J. M. . Laboratory Experiments for General, Organic, and Biochemistry. , (2013).
Anderson, A. J. Affinity chromatography of lactate dehydrogenase: An experiment for the undergraduate biochemistry laboratory. Journal of Chemical Education. 65 (10), 901 (1988).
Boyer, R. F. Purification of milk whey α-lactalbumin by immobilized metal-ion affinity chromatography. Journal of Chemical Education. 68 (5), 430 (1991).
Moffet, D. A. From gene mutation to protein characterization. Biochemistry and Molecular Biology Education. 37 (2), 110-115 (2009).
Sommer, C. A., Silva, F. H., Novo, M. T. M. Teaching molecular biology to undergraduate biology students: An illustration of protein expression and purification*. Biochemistry and Molecular Biology Education. 32 (1), 7-10 (2004).
Wu, Y., Zhou, Y., Song, J., Hu, X., Ding, Y., Zhang, Z. Using green and red fluorescent proteins to teach protein expression, purification, and crystallization. Biochemistry and Molecular Biology Education. 36 (1), 43-54 (2008).
Ward, W. W., Swiatek, G. C., Gonzalez, D. G. Green fluorescent protein in biotechnology education. Methods in enzymology. 305, 672-680 (2000).
Kay, B. K., Winter, J., McCafferty, J. . Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual. , (1996).
Arkus, K. A. J., Jez, J. M. An integrated protein chemistry laboratory. Biochemistry and Molecular Biology Education. 36 (2), 125-128 (2008).
Crowley, T. E. Expression, purification, and characterization of a recombinant flavin reductase from the luminescent marine bacterium Photobacterium leiognathi. Biochemistry and Molecular Biology Education. 38 (3), 151-160 (2010).
Colabroy, K. L. A writing-intensive, methods-based laboratory course for undergraduates. Biochemistry and Molecular Biology Education: A Bimonthly Publication of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology. 39 (3), 196-203 (2011).
Kreiling, J. L., Brader, K., Kolar, C., Borgstahl, G. E. A real-time and hands-on research course in protein purification and characterization: Purification and crystal growth of human inosine triphosphate pyrophosphatase. Biochemistry and Molecular Biology Education. 39 (1), 28-37 (2011).
Gray, C., et al. Known structure, unknown function: An inquiry-based undergraduate biochemistry laboratory course. Biochemistry and Molecular Biology Education. 43 (4), 245-262 (2015).
Kocabas, E., Hernick, M. Metalloenzymes: Use of Recombinant Protein Expression and Affinity Tags to Aid Identification of Native Metal Ion Cofactors. Biochemistry & Analytical Biochemistry. 2 (2), 1-3 (2013).
Ellis, W. R. Metalloenzymes. Reviews in Cell Biology and Molecular Medicine. , (2006).
Williams, R. J. P., Begley, T. P. Metallo-Enzymes and Metallo-Proteins, Chemistry of. Wiley Encyclopedia of Chemical Biology. , (2007).
Mierendorf, R. C., Morris, B. B., Hammer, B., Novy, R. E. Expression and Purification of Recombinant Proteins Using the pET System. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , 257-292 (1998).
He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
He, F. Bradford Protein Assay. BIO-PROTOCOL. 1 (6), (2011).
Johnson, M. Protein Quantitation. Materials and Methods. , (2017).
Colabroy, K. L., Hackett, W. T., Markham, A. J., Rosenberg, J., Cohen, D. E., Jacobson, A. Biochemical characterization of L-DOPA 2,3-dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from lincomycin biosynthesis. Arch Biochem Biophys. 479 (2), 131-138 (2008).
Johnson, K. A. Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer. Methods in Enzymology. , 601-626 (2009).
Kemmer, G., Keller, S. Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets. Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).
Wang, Y. Z., Lipscomb, J. D. Cloning, overexpression, and mutagenesis of the gene for homoprotocatechuate 2,3-dioxygenase from Brevibacterium fuscum. Protein Expr Purif. 10 (1), 1-9 (1997).
Amaya, A. A., Brzezinski, K. T., Farrington, N., Moran, G. R. Kinetic analysis of human homogentisate 1,2-dioxygenase. Archives of Biochemistry and Biophysics. 421 (1), 135-142 (2004).
Johnson-Winters, K., Purpero, V. M., Kavana, M., Nelson, T., Moran, G. R. 4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase from Streptomyces avermitilis: The Basis for Ordered Substrate Addition. Biochimie. 42 (7), 2072-2080 (2003).
Bugg, T. D. H. Overproduction, purification and properties of 2,3-dihydroxyphenylpropionate 1,2-dioxygenase from Escherichiacoli. Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Protein Structure and Molecular Enzymology. 1202 (2), 258-264 (1993).
Mendel, S., Arndt, A., Bugg, T. D. H. Acid-Base Catalysis in the Extradiol Catechol Dioxygenase Reaction Mechanism Site-Directed Mutagenesis of His-115 and His-179 in Escherichia coli 2,3-Dihydroxyphenylpropionate 1,2-Dioxygenase (MhpB). Biochimie. 43 (42), 13390-13396 (2004).
Viggiani, A., Siani, L., Notomista, E., Birolo, L., Pucci, P., Di Donato, A. The Role of the Conserved Residues His-246, His-199, and Tyr-255 in the Catalysis of Catechol 2,3-Dioxygenase from Pseudomonas stutzeri OX1. Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48630-48639 (2004).
Uragami, Y., et al. Crystal structures of substrate free and complex forms of reactivated BphC, an extradiol type ring-cleavage dioxygenase. Journal of Inorganic Biochemistry. 83 (4), 269-279 (2001).
Veldhuizen, E. J. A., et al. Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase. Biochemical Journal. 386 (Pt 2), 305-314 (2005).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citer Cet Article

Colabroy, K. L., Mayer, K. Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory. J. Vis. Exp. (138), e58012, doi:10.3791/58012 (2018).