Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Keri L Colabroy; Katlyn Mayer

doi:10.3791/58012

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biochimie

Benchtop Metal benzeşme kromatografi, sulandırma immobilize ve bir Polyhistidine tahlil Metalloenzyme Lisans Laboratuvarı etiketli.

Published: August 23, 2018

doi:

10.3791/58012

Keri L Colabroy¹, Katlyn Mayer¹

¹Department of Chemistry,Muhlenberg College

Summary

Burada bir iletişim kuralı için immobilize benchtop metal benzeşme Kromatografi arıtma ve etiketli bir polyhistidine sonraki sulandırma, heme olmayan demir bağlama dioxygenase lisans öğretim laboratuvar için uygun mevcut.

Abstract

İmmobilize Benchtop metal benzeşme Kromatografi (IMAC), öğesini polyhistidine proteinlerin ve lisans öğrencileri tarafından kolayca hakim en çok kullanılan protein saflaştırma yöntemi modern edebiyat haline gelmiştir. Ama benzeşme Kromatografi uygulamaya metal bağlayıcı proteinler, özellikle bu gibi demir, redoks hassas metaller ile sık sık laboratuvarları bir torpido – lisans içinde düzenli olarak kullanılamaz ekipman erişim sınırlıdır Laboratuvar. Bu makalede, biz bizim benchtop yöntemleri için yalıtım, IMAC bir poli-histidin etiketlendi arıtma ve metal iyon sulandırma, redoks aktif, heme olmayan demir bağlama extradiol dioxygenase ve dioxygenase ile çeşitli substrat tahlil göstermektedir konsantrasyonları ve oksijen doyurarak. Bu yöntemler lisans öğrencileri tarafından yürütülen ve erişilebilir ve öncelikle lisans kurumlarında uygun araçları ile lisans öğretim ve araştırma laboratuvarında uygulanan.

Introduction

Özler tarafından immobilize bir metal şelasyon histidin etiketi kullanarak bir ana bilgisayar organizmanın bir öğesini polyhistidine protein saflaştırma ilk raporlarını edebiyat 1988¹^,²‘ girdi. O zamandan beri polyhistidine Etiketler rekombinant proteinler ve onların arıtma immobilize metal benzeşme Kromatografi (IMAC) tarafından ek haline gelmiştir biyokimyasal edebiyat³^,⁴‘^{hemen hemen her yerde karşımıza çıkan,} ⁵. IMAC arıtma yöntemleri otomatik Kromatografi kullanarak benchtop ve spin-sütun biçimlerde uygulanabilir. Benzeşme arıtma yöntemleri, özellikle IMAC, yaygın olarak kullanılan araştırma laboratuvarı, onlar lisans öğretim laboratuvar olarak daha az yaygın vardır. Biyokimya Laboratuvarı için en çok kullanılan laboratuvar ders kitapları düzenli olarak bu yöntemler yerine daha geleneksel iyon değiştirme veya boya-bağlama Kromatografi⁶^,⁷^,⁸ için gözle öğretmek değil ^, ⁹. Örneğin, laktat dehidrogenaz Anderson¹⁰ arıtma benzeşme boya-bağlama tarafından ve sığır süt α-laktalbumin⁷^,¹¹ Boyer tarafından arıtma nikel nitriloacetic kullanır asit matris, ama bunun yerine reçine için protein içsel ilgi güvenerek rekombinant poli-histidin etiketi yok, yani. Bazı modern lisans laboratuvar ders kitapları ve yayınlar immobilize metal benzeşme Kromatografi poli-histidin öğesini protein hedefleri yeşil ya da kırmızı-floresan proteinler¹²^,¹³^{gibi uygulamak,} ¹⁴^,¹⁵, antikorlar¹⁶ve seçili enzimler¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰, hatta bazı bilinmeyen işlev²¹. Tartışılır, çünkü hedef etkinlik için sonraki oturumlarda deneyim “gerçek bilim” öğrenci adına zenginleştirici denetlesinler bir enzim saflaştırılması öğretim laboratuvar tercih edilir; Gerçekten de, bu tür laboratuvar deneyimleri yayınlandı ve¹⁷^,¹⁸^,²⁰^,²¹öğrenci öğrenme üzerinde yararlı sonuçlar bildirdi. Ve henüz, iMac enzim arıtma Biyokimya öğretim laboratuvar seyrek kalır ve yayımlanmış yöntemleri bile erişim genellikle kullanılamaz Kromatografi araçları için tahmin için sınıf laboratuvar uygulamaları ²⁰. Ayrıca IMAC uygulama metalloproteins, özellikle de hangi etkinliği²²‘ ye gerekli olan redoks duyarlı divalent metal bağlamak için sınırlamalar vardır. Sık sık, metal iyon kaybı veya etkin olmayan bir enzim hasta uygun-lisans laboratuvarı verimli arıtma sırasında okside.

Tam üçte enzimlerin bağlamak bir metal iyon²³ve demir hayat²³tüm formları için neredeyse evrensel bir gereklilik rağmen demir tartışmalı Enzimologiya en sorunlu metal iyonları arasında yer alıyor. Sigara-heme Fe^{2 +} bağlama enzimler IMAC sırasında özellikle eğilimli kaybı ve/veya metal oksidasyon; Muhtemelen heme ve hangi Fe ile ayırmak^{2 +} düşük aminoasit ligandlar²⁴kolaylığı gibi adanmış bir organik ligand eksikliği nedeniyle. Ayrıca, Fe^{2 +} Fe^{3 +} oksijen bağımlı oksidasyon nedeniyle olumsuz serbest enerji değişimi ve Fe^{3 +}göreli istikrar sulu çözelti içinde spontan olduğunu. Çoğu zaman, bu zorlukları anaerobik atmosfer ve/veya sigara IMAC kromatografik yöntemler²²kullanımı ile üstesinden vardır. Bu makalede, biz benchtop aktif Fe^{2 +}, sulandırma tarafından takip basit, ucuz Kromatografi malzemeleri kullanarak Fe^{2 +} bağımlı metalloenzyme L-DOPA dioxygenase arındırmak için IMAC kullanımı gösterecektir ve enzimatik tahlil. Bu yöntemler 6-12 öğrenci grupları kendi lisans Biyokimya laboratuarında standart ve enzim araştırmalar lisans düzeyinde repertuarı genişletmek için kullanılabilir.

Protocol

1. arıtma için hazırlık Boş hücre ham hazırlanması ayıklamak Bu bir 50 mL konik tüp polyhistidine öğesini metalloprotein25 overexpressed E. coli (BL21) ~ 9-10 g hücre Pelet edinin. Toplam hacim ~ 45-50 mL için hücre Pelet ~ 9-10 g oda geçici lizis/bağlama arabellek (50 mM fosfat, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8) gram başına 5 mL ekleyin. Düzenli olarak dağılması teşvik etmek için girdap. Pelet donmuştu, ılık su banyosu içinde çözülme. Buz-su banyosu kullanarak, hücre süspansiyon ~ 3 ° c hücre lizis için hazırlık soğuk.Not: Bu noktada, hücre lizis sonication, boncuk freze veya başka bir yöntemi mümkündür. Çünkü bu nispeten ucuz, hızlı ve does değil istemek kulak koruma boncuk freze burada gösterilmiştir. Odası üreticinin talimatlarına göre freze 50 mL boncuk bir araya getirin. Dolgu yarım, tam Boncuk Değirmen Odası-20 ° C’de depolanan 0.1 mm cam boncuk soğutulmuş Odası kalan soğutulmuş hücre süspansiyon ile doldurun ve 4 ° C lizis/bağlama arabellek odası tamamen doldurmak için kullanın. Şaft boncuk değirmen döndürmek ve hücre süspansiyon boncuk ile karıştırmak için küçük bir spatula kullanın. Herhangi bir büyük kabarcıkları ile bir damlalıklı kaldırın ve sonra kapağı üstüne vidala. Herhangi bir sızıntı odasından kapalı kuru. Buz yaklaşık 1 fincan için açık, Plastik ceket ekleyin, dolu 50 mL odası dolu buz ceket ve vida kapalı içine ters çevir. Motor üzerine buz ceketli odası güvenli. Boncuk Değirmen 15 saniye 15,800 devirde motor üzerinde açmak, sonra 45 saniye boyunca dinlenmek için izin. 8 kere tekrar edin. 8 döngüsü tamamlandığında, tüm hücre lizis süspansiyon 50 mL veya daha büyük tüp (25.000 g x veya daha yüksek) yüksek hızlı Santrifüjü için dekor içine dikkatle boşaltmak. 4 ° C hücre artıkları ve cam boncuklar cips 40-45 dakika santrifüj ve 25.000 x g spin dengeli tüpler bir çift koyun.Not: mevcut değildir 50 mL veya daha büyük tüpler için yüksek hızlı Santrifüjü dekor, cam boncuk, centrifuging tarafından kaldırın 1000-2000 g 2-3 dk bir 50 mL konik tüp daha küçük bir güç çıkarmak hücre süspansiyon (~ 25 mL) daha küçük bir hacim verim için x e tüp için yüksek hızlı Santrifüjü dekor. Santrifüjü tamamlandığında, berrak, sarı, boş hücre, ham özleri temiz 50 mL konik tüp içine dikkatle boşaltmak. Herhangi bir hücre artıkları aktarmak için dikkat ediniz. Boş hücre ham özleri arıtma daha sonraki analizler için küçük bir örnek toplamak SDS-sayfa26tarafından. IMAC sütun hazırlanması Reçine parçacıklar, radarı kilit çıkışı ve ayrıca uygun bir radarı kilit içeren bir üst kap korumak için daha düşük bir yatak desteği ile donatılmış bir 1.5 x 20 cm sütun edinin. Radarı-kilit çıkış akışını kontrol etmek için bir stopcock ile uygun. Benchtop çalışma, güvenli bir şekilde sütun bir yüzük stand üzerine monte. Nikel-bağlı nitriloacetic asit (Ni-NTA) reçine 4 ° C’de depolanan % 20 etanol içinde % 50 Bulamaç elde Yavaşça eşit reçine yeniden askıya için şişe girdap. Oda sıcaklığında ve benchtop, reçine polyhistidine 50-60 mg bağlama yeteneğine sahip protein öğesini ve bulamaç sütuna aktarmak 2 mL 1 mL verecektir Bulamaç çekilmeye mezun bir damlalıklı yerleşmiş kullanımı üzerinde çalışıyor. Stopcock açın ve reçine düşük yerçekimi tarafından boşaltmak aşırı depolama çözümü sağlar. Stopcock güvenli șekilde kapatır Pasteur damlalıklı kullanarak dikkatli bir şekilde soğutulmuş lizis/bağlama arabellek (50 mM fosfat, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8) ekleyin ve reçine-en az 30 mL sütunun. Reçine yüzey bozmamaya özen. Arabellek sütun sıçramasına önlemek için duvarları aşağı çalıştırın. Reçine yavaş yavaş toplama kabı içine yerçekimi tarafından sütundan boşaltmak lizis/bağlama arabellek izin vererek equilibrate. Lizis/bağlama arabellek çoğunlukla drene zaman ~ 5 mL lizis arabelleği reçine kaldığında arabellek akışını durdurmak için stopcock kapatın ve dik, devam etmek için hazır kadar veya en fazla 1 hafta monte sütun bırakın. 2. Polyhistidine öğesini hedef tarafından IMAC saflaştırılması Yıkama tampon (50 mM fosfat, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole pH 8) ve elüsyon tampon (50 mM fosfat, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, % 10 gliserol pH 8) hazırlayın. 4 ° C’de soğuk Ni-NTA sütun boş hücre ham özleri eklenmesi için stopcock açarak ve Ni-NTA reçine ile yerçekimi tarafından boşaltmak için lizis/bağlama arabellek kalan izin hazır olun. Tüm arabellek süzülmüş ve reçine yüzey maruz stopcock kapatın. Bir Pasteur damlalıklı, dikkatle damlalıklı kullanarak hücre ücretsiz ham reçine yüzey bozmamaya dikkat çekici, ayıklar. Ham özleri duvarları sıçramasına önlemek için sütun aşağı çalıştırın. Ham özleri uygulanan hacmi ifade polyhistidine öğesini protein düzeyine bağlıdır; ham özleri hacmi 50-60 mg içerir emin olmak veya hedef protein mL Ni-NTA reçine başına daha az (bkz. Adım 1.2.4). Tüm ham özleri sütuna devredilmiştir sütun yerçekimi tarafından drenaj olabilir bu yüzden stopcock açın. Bu akış için reçine-SDS-sayfa tarafından arınma daha sonraki analizler için toplamak 100 μL bağlanamadı proteinler oluşur. 26 Boş hücre ham özleri viskozite yerçekimi akışı sütun önemli ölçüde yavaşlatabilir. Akış oranını artırmak için basit bir “el-pompa” uygulanır: Bir 10 mL radarı-kilit şırınga al ve kap plastik boru ve sütun kap ve şırınga radarı-kilit bağlantı parçaları arasında kısa uzunluğu kullanarak sütun bağlayın. Şırınga pistonu çizin ve sonra sıkı bir şekilde uygun sütun üst sütun kap. Yavaşça şırınga pistonu el ile mezun silindir içine eluent toplayarak akış hızı değerlendirilmesi sırasında sıkıştırmak; 1-2 mL / dakika oranları reçine ve bu kurulum ile uyumludur. Akış hızı yavaşlar gibi yavaşça şırınga pistonu sıkıştırma artırın. Hava giriş reçine içine engellemek için sütun başlığını çıkarın ve menisküs uygulanan sıvı reçine yatağın üzerinde 5-10 mm ulaştığında el pompası bağlı ve yerçekimi tarafından boşaltmak zorunda kalan cilt izin. Hücre ücretsiz ham özleri boşaltma tamamladıktan ve reçine yüzey tekrar maruz Pasteur damlalıklı dikkatle ~ 30 mL soğuk yıkama arabellek sütuna reçine yüzey bozmamaya dikkat çekici – eklemek için kullanın. Arabellek sütun sıçramasına önlemek için duvarları aşağı çalıştırın. Stopcock açmak ve yıkama arabellek sütun ile drenaj izin vermek. Bu işlem zayıf ilişkili proteinler reçine kaldırıyor. Eluent atın. Yıkama arabellek boşaltma iken, on altı yaşında hazırlamak etiketli, 1 mL kesirleri toplamak için microcentrifuge tüpler. Yıkama arabellek süzülmüş ve reçine yüzey tekrar maruz stopcock kapatın. Pasteur damlalıklı dikkatle ~ 30 mL soğuk elüsyon arabelleği reçine yüzey bozmamaya dikkat çekici sütun için – eklemek için kullanın. Arabellek sütun sıçramasına önlemek için duvarları aşağı çalıştırın. Stopcock yavaş yavaş açmak ve elüsyon arabellek sütun öğesini polyhistidine protein elute izin vermek. 1 mL eluent her işaretli microcentrifuge tüpler, 1-16 arası toplamak. Renkölçer protein tahlil Bradford tahlil veya belirli yöntemlerine göre UV-görünür spektroskopisi gibi reaktif ve/veya araç üreticileri27,28tarafından kullanarak protein için kesirler test. Burada gösterildiği gibi Coomassie mavi kullanarak Renkölçer tahlil 100 μL birime her fraksiyonu sadece küçük bir birimden kurban için küçültülür. Her kesir Mix 3 μL 100 µL kolorimetrik bir protein ile reaktif tahlil ve el ile protein fraksiyonu varlığını göstermek için herhangi bir renk oluşumu gözlemlemek; algılama bir Spektrometre ile gerekli değildir. Protein fraksiyonu 16 bulunursa, eluted kesirler artık önemli miktarda protein içeren kadar 1 mL kesirler ve tahlil protein için düzenli olarak eluting devam edin. Protein içeren kesirleri temiz konik tüp içine birleştirmek ve daha sonraki analizler için 100 μL örnek SDS-sayfa26tarafından tutar. Metal iyon kofaktör sulandırma ile devam etmek ya da protein 3 mL aliquots-80 ° C’de dondurmak O % 10 gliserol dahil olduğundan emin olun elüsyon arabellek saf protein donma sırasında dengelemek için bir cryoprotectant olduğunu. Ni-NTA sütunun elüsyon tamamlandığında, tüm protein sütundur ve kesirler toplanan, elüsyon arabelleği sütun aracılığıyla başka bir 25 mL geçmek ve sütun 4 ° c ~ 5 mL elüsyon arabelleği için kısa süreli depolama depolamak , veya daha uzun vadeli depolama için % 20 etanol ile lizis/bağlama arabellek. 3. hedef Protein ile Fe2 + sulandırma Fe2 + ekNot: Bu örnekte L-DOPA dioxygenase gibi enzim bağlama heme olmayan demir (II) etkinliği için bir Fe2 + iyon gerektirir; Ancak, demir (II) etkin olan demir (III), kolayca oksitlenir ve protein bir kısmını herhangi bir demir hiç arındırır. Metal sulandırma başlamak için 3 mL saf enzim elüsyon arabellekte askıya alın. Dondurulmuş, hızla ılık su banyosu kullanarak çözme ve bir kez çözdürülen, protein buza koy. Protein hacmi tüp kullanarak, sodyum askorbat (198.1 g/mol) son konsantrasyonu 12,5 mM örnek yapmak için gerekli miktarı hesaplamak. De, dithiothreitol (DTT, 154.25 g/mol) son konsantrasyonu 12,5 mM örnek olması için gereken miktarını hesaplar. Katı sodyum askorbat ve DTT ve tamamen erimesi için yumuşak, ama iyice karıştırın. Protein yağış aşırı saldırgan karıştırma ile neden olmaması için dikkat ediniz. Demir (II) sülfat heptahydrate (MW 278.01 g/mol) az miktarda protein örnek ekleyin. Demir tuz, dokunun yeterince küçük bir miktar birkaç 1 elde etmek için mm granül FeSO4•7H2O dışarı sağlam bir parça kağıt tartmak, granül üzerinde kağıt katlama ve metal bir spatula düz tarafıyla ezersin. Bir tanesini elde edilen toz protein tüp için ekleyin. Girdap karışımı ve pembe pembe renk tüp içinde görünür. Pembe çözüm protein, şapkalı, 10-30 dakika buz üzerinde kuluçkaya. Pembe renk yavaş yavaş zaman içinde kaybolacak. Jel filtrasyon Küresel polyacrylamide jel 10 mL bir molekül ağırlığı dışlama sınırı yaklaşık 6000 ve 90-180 µm de bir 10 mL rezervuar ile donatılmış bir 1.5 x 12 cm sütundaki sulu parçacık boyutu aralığı dolu bir jel filtrasyon sütun kullanın. Sütun alt ile donatılmıştır ve reçine sütun korumak ve reçine yatak kuru çalışmasını engellemek için 30 um gözenekli polietilen disk şeklinde üst yatak desteklediğinden olun. Jel filtrasyon sütun bir yüzük stand mount. Önceden paketlenmiş jel filtrasyon sütun kullanılıyorsa, kapağını çıkarın ve aşırı arabellek üst yatak destek yukarıda kapalı dökün. Sütun equilibrate için arabellek sonraki tahlil ve Muhafazası, örneğin, 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, % 10 gliserol pH 8.0 uyumlu ile havzanın doldurarak başlayın. Önceden paketlenmiş jel filtrasyon sütun kullanılıyorsa, arabellek akışını başlatmak ve radarı kayma uygun maruz jel filtrasyon sütun alt ucu çekin. Bir stopcock sonuna radarı kayma sütun uygun ama açık bırakın ve yerçekimi tarafından damla sütun izin. Arabellek sütun süzülmüş ve üst yatak destek maruz stopcock kapatın ve çözüm maruz üst yatak desteği üzerine pipetting Fe (II) yeniden metalloenzyme ~ 3 mL sütuna ekleyin. Stopcock açmak ve tüm 3,0 mL örnek sütun yerçekimi tarafından girmek izin vermek. Eluent bu ilk 3 mL atmak. Çözüm taşıma sırasında formları herhangi bir pembe renk sütunun üst kısmına sıkışmış. Sütun damlama durdurdu ve üst yatak destek maruz, 4 mL jel-filtrasyon arabelleği (Örneğin, 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, % 10 gliserol pH 8.0) için sütun ekleyin. Stopcock açın ve eluent microcentrifuge tüpler içine sekiz 0.5 mL kesirleri toplamak. Renkölçer protein tahlil veya UV-VIS27,28 daha önce açıklandığı gibi kullanarak protein için kesirler test. Protein içeren kesirleri birleştirin. Bir örnek SDS-sayfa analizi26için geri alıyorum. Tahlil veya bir örnek ile devam edin.

Representative Results

Bu protokol iki ders laboratuvar dönemlerinde BCM 341 idam gibi temsilcisi bu sonuçlar lisans öğrencileri tarafından toplanmıştır: deneysel Biyokimya Muhlenberg Koleji’nde. Bir 20 kDa poli-histidin arıtma sonuçlarını metalloenzyme, L-DOPA dioxygenase, bir 4 saatlik sınıf laboratuvar dönemde iki lisans öğrencileri tarafından gerçekleştirilen olarak etiketlenen ve SDS-PAGE tarafından aynı tarafından analiz Şekil 1 gösterir Öğrenciler bir sonraki laboratuvar dönemde. Etkili bir şekilde poli-histidin öğesini proteindir saflaştırılmış (Şekil 1, lane 2). Poli-histidin öğesini hedef protein az miktarda akışı aracılığıyla içinde (veri) gösterilmez, kayıp bir immunoblot poli-histidin etiketi karşı antikor kullanarak jel gösterir büyük olasılıkla çünkü hedef protein miktarı 100 mg büyüktür bağlama kapasitesi reçine lysate aştı. Şekil 2 etkinlik öğrenci toplanan veri poli-histidin etiketli metalloenzyme hedef L-DOPA dioxygenase, enzimatik reaksiyon sonra demir (II) ve sonraki jel-filtrasyon protokolü tarafından tanımlandığı gibi sulandırma üzerinde gösterir burada. Beş ölü-zaman veri toplanan başlar bu tekniği ilk kez yürütme öğrencilerin tipik ikincisidir. Metalloenzyme sağlam etkinliği yayımlanmış bir tahlil kullanarak ve kararlı durum kinetik parametrelerin yayımlanan sonuçları29ile tutarlı sunmuştu algılandı. Kararlı durum kinetik parametrelerin Şekil 2′ de gösterilen ilerleme eğrileri30 yaklaştırarak belirlenmiştir; Ancak, doğrusal olmayan en küçük kareler uygun substrat konsantrasyonu bir dizi toplanan ilk oranları eşit olası31′ dir. Şekil 1. SDS-sayfa26 Analizi poli-histidin protein öncesinde, sırasında ve sonra arıtma etiketledi. Yolları 1 – moleküler ağırlık işaretleri, 2 saf protein (20 kDa) post Ni-NTA, ile 4 – hücre ücretsiz ham özleri önce arıtma, 5 – hücre artıkları Pelet yazı lizis 3-Ni-NTA akışı. Örnekleri 5 x örnek/yükleme arabellek kullanılarak hazırlanan ve önceden döküm 4- polyacrylamide bir jel elektroforez sistemi kullanarak jeller üzerinde ayrılmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 2. Kararlı duruma tahlil demir (II) metalloenzyme (Yani, L-DOPA dioxygenase, 10µM) substrat (L-DOPA-5 µM (kırmızı), 25 µM (yeşil), 50 µM (mavi)) arabelleği (50 mM fosfat, 200 mM NaCl, pH 8) ile birlikte yeniden düzenlendi. İzleri tasvir ürün oluşumu, 414nm. Absorbans veri sürekli 1 mL metakrilat cuvettes bir split-ışın tarama UV-görünür Spektrometre29kullanarak elde. Ham veri, Michaelis-Menten kararlı durum yaklaşım (KM 30,8 µM ± 14,4, kkedibelirgin 2.3 s-1 ± 0,05)30bir modeli uygun olan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Polyhistidine Etiketler rekombinant proteinler ve onların arıtma IMAC tarafından eklenmesi biyokimyasal edebiyat³^,⁴^,⁵, IMAC uygulamaları enzim arıtma için hemen hemen her yerde olmuştur iken Biyokimya Laboratuvarı öğretim kalır seyrek ve yayımlanmış yöntemleri her zaman öğretim kaynak sınırlamaları düşünmüyoruz laboratuvar²⁰. Ayrıca, IMAC öğretim laboratuvar etkinliği ve saflık, IMAC arıtma bir enzim ideal öğretim etkinlik yapma değerlendirmek deneyler birleştiğinde en etkili kullanmaktır. Enzimler, metaloenzimlerde, öğretim laboratuvar dahil arıtma IMAC uygulamaya uzatmak için güvenilir ve ucuz Yöntemler gereklidir. Bu protokol için biz benchtop IMAC göstermek hazır ve ucuz Laboratuvar malzemeleri, ayrıca sınırlamalar IMAC uygulama metalloproteins²², iron(II) bağımlı başlamaktan tarafından hitap ederken kullanarak metalloenzyme, L-DOPA dioxygenase, arıtma sonrası. Reaktifler ve açıklanan malzemeleri kullanarak, sekiz öğrenci grupları için sarf malzemeleri arasında $500-600 resim 1 resim 2aldatmacalarını analysis adımlar da dahil olmak üzere bu iletişim kuralını çalıştırmak için dönem başına maliyetidir tahmin ediyoruz.

Hangi ile Fe^{2 +} amino asit ligandlar²⁴ ve facile oksidasyonunu Fe^{2 +} O₂ tarafından Fe^{3 +}için sigara-heme, sulandırma ayırmak kolaylığı nedeniyle rekombinant metalloenzyme içine amino asit Şelatatlı iron(II) olduğunu enzim arıtma tipik bir bileşenidir. Klasik Kromatografi kullanıldığında, bazı durumlarda³²demir toplam kayıplarını önlemek mümkündür, ancak demir (II) geri azaltılması ajanlar³³^,³⁴^,³⁵huzurunda^, daha sık eklenir ³⁶ kez altında bir anaerobik atomosphere³⁷^,³⁸^,³⁹ve bazı durumlarda demir fazlalığı değil kaldırıldı³³^,³⁴^,³⁶, komplike Sonraki herhangi bir tahlil. Klasik Kromatografi ve anaerobik bir atmosfer ardışık adımlar bu protokolü gelişimi isteyen Lisans Laboratuvarı için gerçekçi değildir.

Ni-NTA sütun el ile hazırlanması ve örnekleri yerçekimi tarafından büyük ölçüde işleme ek zaman ve önceden paketlenmiş sütunları karşılaştırılır ve Kromatografi araçları otomatik zaman çaba sürer iken, el ile gerçekleştirilecek adımlar için yakışıklı-üstünde izin artan işlem arkasında bilim anlayışı sonucunda öğrenci tarafından öğrenme. Burada özetlenen koşullar altında bir demir (II) tuzu aşırı dithiothreitol için özellikle hassas bir ektir. Bir öğrenci, yanlışlıkla dithiothreitol aşırı ekler, yağış olay olasıdır. Bu laboratuvarda, tezgah laboratuvar zaman en etkin şekilde kullanılacak şekilde gelmeden önce reaktif miktarlar hesaplamalar öğrenciler gerektirecek şekilde yararlı bulduk. Tüm benchtop IMAC arıtma – cep-lysis protein elüsyon için-gelen bir 4 saatlik laboratuvar periyotta ardından sulandırma ve tahlil bir sonraki laboratuvar döneminde yapılır.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu yayın Grant No altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen çalışma üzerine kuruludur CHE 1708237.

Materials

consumables
BeadBeater 0.1mm glass beads	BioSpec Products	11079101	1 pound each
50mL Conical Tubes with Screw Caps, sterile	VWR	21008-178
Sodium chloride	Fisher Bioreagents	BP358-1
Potassium phosphate, monobasic	Acros (Fisher)	AC42420-5000
Sodium Ascorbate	Acros (Fisher)	AC35268-1000
DTT (Dithiothreitol)	Lab Scientific	D-115
Iron(II) sulfate heptahydrate	Sigmaaldrich	310077
HisPur NiNTA Resin	Fisher (pierce)	PI88221
Econo-Column Chromatography Columns – 1.5 x 20cm	Bio-Rad	737-1522	1.5 x 20 cm, 35 ml, 2ea,
Stopcock Valve, one way, female to male luer	Kimble	420163-0000	pack of 50
BD 10mL luer-loc syringe (non-sterile, without needle)	VWR	301029
Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Female Luer	Biorad	7318222
Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Male Luer	Biorad	7318225
Silicon Tubing (1.6 mm ID/0.8 mm wall, for 0.2-5 ml/min on Peristaltic Pump)	Bio-Rad	7318211	Pkg of 1, 1.6 mm ID/0.8 mm wall, 10 m, low-pressure tubing for liquid handling
Glycerol	Fisher (Pierce)	17904
Coomassie Plus (Bradford) Protein Assay	Thermo Scientitic	23236
Microcentrifuge Tubes, snap cap, 1.5mL	VWR	89000-028
Fisherbrand polystyrene disposable serological pipets	Fisher	13-676-10F
Fiserbrand universal pipet pump	Fisher	14-955-110
Fisherbrand Transfer Pipets	Fisher	13-711-9AM
Econo-Pac 10DG desalting columns	Bio-Rad	732-2010	box of 30
ExpressPlus PAGE 5x sample buffer	Genscript	MB01015	5mL (Dilute 1:5 with sample)
ExpressPlus PAGE Gel, 4-20%, 12 wells	Genscript	M42012	20 gels
Fisherbrand Disposable Cuvettes, Methyacrylate	Fisher	14-955-128	case of 500
Cuvette Caps Square Disposable	Fisher	14-385-999
L-DOPA (3,4-dihydroxyphenylalanine)	Acros	D9628-5G
Permanent Equipment:
BeadBeater 50mL chamber	BioSpec Products	110803-50SS	1 chamber
BeadBeater	BioSpec Products	1107900-101	350 ml polycarbonate chamber, rotor assembly, motor base, ice-water cooling jacket and one pound of glass beads.
Centrifuge tubes, High-Speed PPCO, 50mL	Fisher	3119-0050PK
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel	Bio-Rad	1658004	4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	1645052	100–120/220–240 V, power supply for high-current applications, includes power cord
UV-1800 with UV-Probe Software	Shimadzu	UV-1800
Kintek Global Kinetic Explorer	Kintek Corp	version 6	https://www.kintekexplorer.com/downloads/

References

Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli, H., Gentz, R., Stüber, D. Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent. Nature Biotechnology. 6 (11), 1321 (1988).
Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins. Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).
Block, H., et al. Chapter 27 Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review. Methods in Enzymology. , 439-473 (2009).
Derewenda, Z. S. The use of recombinant methods and molecular engineering in protein crystallization. Methods. 34 (3), 354-363 (2004).
Gräslund, S., et al. Protein production and purification. Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
Switzer, R. L., Garrity, L. F. . Experimental Biochemistry. , (1999).
Boyer, R. . Modern Experimental Biochemistry, 3rd Edition. , (2001).
le Maire, M., Chabaud, R., Hervé, G. . Laboratory Guide to Biochemistry, Enzymology, and Protein Physical Chemistry: A Study of Aspartate Transcarbamylase. , (2012).
Bettelheim, F. A., Landesburg, J. M. . Laboratory Experiments for General, Organic, and Biochemistry. , (2013).
Anderson, A. J. Affinity chromatography of lactate dehydrogenase: An experiment for the undergraduate biochemistry laboratory. Journal of Chemical Education. 65 (10), 901 (1988).
Boyer, R. F. Purification of milk whey α-lactalbumin by immobilized metal-ion affinity chromatography. Journal of Chemical Education. 68 (5), 430 (1991).
Moffet, D. A. From gene mutation to protein characterization. Biochemistry and Molecular Biology Education. 37 (2), 110-115 (2009).
Sommer, C. A., Silva, F. H., Novo, M. T. M. Teaching molecular biology to undergraduate biology students: An illustration of protein expression and purification*. Biochemistry and Molecular Biology Education. 32 (1), 7-10 (2004).
Wu, Y., Zhou, Y., Song, J., Hu, X., Ding, Y., Zhang, Z. Using green and red fluorescent proteins to teach protein expression, purification, and crystallization. Biochemistry and Molecular Biology Education. 36 (1), 43-54 (2008).
Ward, W. W., Swiatek, G. C., Gonzalez, D. G. Green fluorescent protein in biotechnology education. Methods in enzymology. 305, 672-680 (2000).
Kay, B. K., Winter, J., McCafferty, J. . Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual. , (1996).
Arkus, K. A. J., Jez, J. M. An integrated protein chemistry laboratory. Biochemistry and Molecular Biology Education. 36 (2), 125-128 (2008).
Crowley, T. E. Expression, purification, and characterization of a recombinant flavin reductase from the luminescent marine bacterium Photobacterium leiognathi. Biochemistry and Molecular Biology Education. 38 (3), 151-160 (2010).
Colabroy, K. L. A writing-intensive, methods-based laboratory course for undergraduates. Biochemistry and Molecular Biology Education: A Bimonthly Publication of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology. 39 (3), 196-203 (2011).
Kreiling, J. L., Brader, K., Kolar, C., Borgstahl, G. E. A real-time and hands-on research course in protein purification and characterization: Purification and crystal growth of human inosine triphosphate pyrophosphatase. Biochemistry and Molecular Biology Education. 39 (1), 28-37 (2011).
Gray, C., et al. Known structure, unknown function: An inquiry-based undergraduate biochemistry laboratory course. Biochemistry and Molecular Biology Education. 43 (4), 245-262 (2015).
Kocabas, E., Hernick, M. Metalloenzymes: Use of Recombinant Protein Expression and Affinity Tags to Aid Identification of Native Metal Ion Cofactors. Biochemistry & Analytical Biochemistry. 2 (2), 1-3 (2013).
Ellis, W. R. Metalloenzymes. Reviews in Cell Biology and Molecular Medicine. , (2006).
Williams, R. J. P., Begley, T. P. Metallo-Enzymes and Metallo-Proteins, Chemistry of. Wiley Encyclopedia of Chemical Biology. , (2007).
Mierendorf, R. C., Morris, B. B., Hammer, B., Novy, R. E. Expression and Purification of Recombinant Proteins Using the pET System. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , 257-292 (1998).
He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
He, F. Bradford Protein Assay. BIO-PROTOCOL. 1 (6), (2011).
Johnson, M. Protein Quantitation. Materials and Methods. , (2017).
Colabroy, K. L., Hackett, W. T., Markham, A. J., Rosenberg, J., Cohen, D. E., Jacobson, A. Biochemical characterization of L-DOPA 2,3-dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from lincomycin biosynthesis. Arch Biochem Biophys. 479 (2), 131-138 (2008).
Johnson, K. A. Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer. Methods in Enzymology. , 601-626 (2009).
Kemmer, G., Keller, S. Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets. Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).
Wang, Y. Z., Lipscomb, J. D. Cloning, overexpression, and mutagenesis of the gene for homoprotocatechuate 2,3-dioxygenase from Brevibacterium fuscum. Protein Expr Purif. 10 (1), 1-9 (1997).
Amaya, A. A., Brzezinski, K. T., Farrington, N., Moran, G. R. Kinetic analysis of human homogentisate 1,2-dioxygenase. Archives of Biochemistry and Biophysics. 421 (1), 135-142 (2004).
Johnson-Winters, K., Purpero, V. M., Kavana, M., Nelson, T., Moran, G. R. 4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase from Streptomyces avermitilis: The Basis for Ordered Substrate Addition. Biochimie. 42 (7), 2072-2080 (2003).
Bugg, T. D. H. Overproduction, purification and properties of 2,3-dihydroxyphenylpropionate 1,2-dioxygenase from Escherichiacoli. Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Protein Structure and Molecular Enzymology. 1202 (2), 258-264 (1993).
Mendel, S., Arndt, A., Bugg, T. D. H. Acid-Base Catalysis in the Extradiol Catechol Dioxygenase Reaction Mechanism Site-Directed Mutagenesis of His-115 and His-179 in Escherichia coli 2,3-Dihydroxyphenylpropionate 1,2-Dioxygenase (MhpB). Biochimie. 43 (42), 13390-13396 (2004).
Viggiani, A., Siani, L., Notomista, E., Birolo, L., Pucci, P., Di Donato, A. The Role of the Conserved Residues His-246, His-199, and Tyr-255 in the Catalysis of Catechol 2,3-Dioxygenase from Pseudomonas stutzeri OX1. Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48630-48639 (2004).
Uragami, Y., et al. Crystal structures of substrate free and complex forms of reactivated BphC, an extradiol type ring-cleavage dioxygenase. Journal of Inorganic Biochemistry. 83 (4), 269-279 (2001).
Veldhuizen, E. J. A., et al. Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase. Biochemical Journal. 386 (Pt 2), 305-314 (2005).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citer Cet Article

Colabroy, K. L., Mayer, K. Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory. J. Vis. Exp. (138), e58012, doi:10.3791/58012 (2018).