벤치탑 움직일 금속 친화성 크로마토그래피, 재구성 및 학부 실험실의 분석 결과 Polyhistidine의 태그 Metalloenzyme

1입니다. 정화에 대 한 준비 셀 무료 원유 추출의 준비 대장균 (BL21) overexpressed 태그 polyhistidine metalloprotein25 50 mL 원뿔 튜브에 그의 9 ~ 10 g 셀 펠 렛을 얻습니다. 셀 펠 릿 총 볼륨 ~ 45-50 ml의 9 ~ 10 g을 방 임시 세포/바인딩 버퍼 (50 m m 인산 염, 300 m m NaCl, pH 8에서 10 mM 이미)의 그램 당 5 mL를 추가 합니다. 해산을 장려 하기 위해 주기적으로 소용돌이입니다. 펠 릿, 냉동 면 미지근한 물 욕조에 녹여. 얼음 물 목욕을 사용 하 여, 진정 세포 세포의 용 해에 대 한 준비에 ~ 3 ° C에 세포 현 탁 액.참고:이 시점에서 세포 세포의 용 해 쥡니다, 비드 밀링 또는 다른 방법에 의해 가능 하다. 비드 밀링 때문에 급속 한, 상대적으로 저렴 한, 그리고 귀 보호를 필요 하지 않습니다 여기 증명 됩니다. 제조업체의 지침에 따라 챔버 밀링 50ml 비드 조립. 채우기의 전체 절반 비드 밀 챔버 냉장-20 ° c.에 저장 된 0.1 m m 유리 구슬 냉장된 셀 서 스 펜 션 챔버의 나머지와 4 ° C 세포/바인딩 버퍼를 사용 하 여 챔버를 완전히 채우기. 비드 밀의 샤프트를 회전 하는 구슬 세포 현 탁 액을 혼합 작은 주걱을 사용 합니다. 피펫으로와 모든 큰 거품을 제거 하 고에 뚜껑을 나사. 어떤 누설에서 챔버 드라이. 명확 하 고, 플라스틱 자 켓에 얼음의 약 1 컵, 얼음 가득 재킷과 나사 폐쇄로 채워진된 50 mL 챔버를 반전. 모터에 얼음 외피 챔버를 보호 합니다. 비드 밀 15,800 rpm에서 15 초 동안에 모터 설정 후 45 초 동안 휴식을 허용. 8 회 반복 한다. 8 주기 완료 되 면 50 mL 또는 더 큰 튜브 고속 원심 분리 (25000 g x 이상)에 대 한 평가로 전체 세포 세포 현 탁 액을 가만히 따르다. 작은 세포 파편과 유리 구슬에 4 ° C에서 40 ~ 45 분 스핀 25000 x g에서 원심 분리기에 균형된 관의 쌍을 놓습니다.참고: 50 mL 또는 고속 원심 분리에 대 한 평가 큰 튜브 사용할 수 없는 경우에서 centrifuging 여 유리 구슬 제거 작은 양의 세포 현 탁 액 (25 mL) 작은 volum에 decanted 수 있는 수익률 50 mL 원뿔 튜브에 2-3 분 동안 g x 1000-2000 e 튜브 고속 원심 분리에 대 한 평가. 원심 분리가 완료 되 면 가만히 따르다, 노란색 셀 무료, 원유 추출 물 깨끗 한 50 mL 원뿔 튜브로. 알아서 하지 어떤 세포 파편을 전송. SDS 페이지26에 의해 정화의 나중에 분석 셀 무료 원유 추출의 작은 샘플을 수집 합니다. 아이맥 칼럼의 준비 수 지 입자, Luer 잠금 콘센트 및 Luer 잠금 피팅을 포함 하는 상위 모자를 유지 하기 위해 낮은 침대 지원을 갖춘 1.5 x 20 cm 열을 가져옵니다. 흐름을 제어 하는 자 지와 Luer 잠금 콘센트에 맞게. 안전 하 게 벤치탑에서 working, 링 스탠드에는 열을 탑재 합니다. 4 ° c.에 저장 된 20% 에탄올에 니켈 바인딩된 nitriloacetic 산 (Ni-NTA) 수 지의 50% 슬러리를 얻기 부드럽게 균등 하 게 다시 중단 수 지 병을 소용돌이 친다. 실내 온도에 및 벤치탑, 사용의 1 mL을 보장할 슬러리의 2 개 mL를 철회 졸업된 피펫으로 정착 수 지 바인딩 polyhistidine의 50-60 밀리 그램의 단백질, 태그와 열에 슬러리 전송에 작업. 자 지를 열고 수 지에서 중력에 의해 배수 하는 과잉 스토리지 솔루션을 허용 합니다. 자 지를 안전 하 게 닫으십시오 파스퇴르 피펫으로 사용 하 여 신중 하 게 냉장된 세포/바인딩 버퍼 (50 m m 인산 염, 300 m m NaCl, pH 8에서 10 mM 이미) 추가 수 지-적어도 30 mL의 열. 알아서 하지 방해 수 지 표면. 튀는 것을 방지 하려면 열 벽 아래로 버퍼를 실행 합니다. 세포/바인딩 버퍼 컬렉션 비 커에 중력에 의해 열에서 천천히 배출 함으로써 수 지 equilibrate. 세포/바인딩 버퍼는 대부분 물기를 때 세포의 용 해 버퍼의 ~ 5 mL 수 지 위에 때 버퍼의 흐름을 중지 하려면 자 지 닫고 열, 직 립, 진행 준비가 될 때까지 또는 최대 1 주에 대 한 탑재를 두고. 2. 정화 태그 Polyhistidine 아이맥으로 대상의 워시 버퍼 (50 m m 인산 염, 300 mM NaCl, 20mm 이미 pH 8) 및 차입 버퍼 (인산 염, 300 mM NaCl, 250 m m 이미 10% 글리세롤 pH 8 m 50 m)를 준비 합니다. 4 ° c.에 진정 자 지를 열고 남은 세포/바인딩 버퍼 Ni NTA 수 지를 통해 중력에 의해 배수를 허용 하 여 Ni NTA 열 셀 무료 원유 추출의 추가 대 한 준비. 모든 버퍼는 물기와 수 지 표면 노출는 자 지를 닫습니다. 파스퇴르 피펫으로, 신중 하 게 피펫으로 사용 하 여 셀 무료 원유 표면을 방해 하지 않도록 주의 복용 수 지에 추출 합니다. 원유 추출 물 튀는 것을 방지 하려면 열 벽을 아래로 실행 합니다. 원유 추출 물 적용의 볼륨은 polyhistidine 태그 단백질;의 표현 수준에 따라 원유 추출의 총 볼륨 포함 50-60 밀리 그램 이하의 Ni NTA 수 지의 mL 당 대상 단백질의 (1.2.4 단계 참조). 때 모든 원유 추출의 열으로 전송 되었습니다, 그래서 열이 중력에 의해 배수 할 수 있다는 자 지를 엽니다. 이 흐름을 통해 수 지-SDS 페이지에 의해 정화의 향후 분석을 위해 수집 100 μ에 바인딩되지 않은 단백질으로 구성 된다. 26 셀 무료 원유 추출의 점성 열의 중력 흐름을 상당히 느려질 수 있습니다. 흐름의 속도 높이려면 간단한 “손 펌프”를 적용: 10 mL Luer 잠금 주사기를가지고 하 고 플라스틱 튜브 및 열 모자와 주사기 Luer 잠금 피팅 사이 짧은 길이 사용 하 여 열의의 모자를 연결 합니다. 주사기 플런저 밖으로 그리고 단단히 적합 열 상단 열 모자. 부드럽게 수동으로 졸업된 실린더;에 eluent 수집 하 여 흐름 속도 평가 하는 동안 주사기의 플런저를 압축 분 당 1-2 mL의 수 지 및이 설치와 호환 됩니다. 부드럽게 유량으로 주사기 플런저의 압축을 증가. 수 지에 공기의 도입을 방지 하려면 열 뚜껑을 제거 적용된 액체의 초승달 모양에 도달 하면 수 지 침대 위에 5-10 m m 손 펌프를 연결 및 중력에 의해 배수 하는 나머지 볼륨을 허용. 셀 무료 원유 추출 물 배출 완료 하 고 수 지 표면에 다시 노출, 파스퇴르 피펫으로 사용 하 여 신중 하 게 열-수 지의 표면을 방해 하지 않도록 주의 복용에 냉장된 워시 버퍼의 ~ 30 mL를 추가. 튀는 것을 방지 하려면 열 벽 아래로 버퍼를 실행 합니다. 자 지를 열고 워시 버퍼 열을 통해 배수를 허용 합니다. 이 프로세스는 수 지에서 약하게 바인딩된 단백질을 제거 합니다. Eluent는 삭제 합니다. 워시 버퍼를 배출 하는 동안 준비 16, 표시, 1 mL 분수를 수집 하기 위해 microcentrifuge 튜브. 워시 버퍼는 물기, 수 지 표면에 다시 노출 되는 자 지를 닫습니다. 파스퇴르 피펫으로 사용 하 여 신중 하 게 열-수 지의 표면을 방해 하지 않도록 주의 복용에 냉장된 차입 버퍼의 ~ 30 mL를 추가. 튀는 것을 방지 하려면 열 벽 아래로 버퍼를 실행 합니다. 자 지를 천천히 열고 열에서 태그 polyhistidine 단백질을 elute 차입 버퍼를 허용 합니다. 각 표시 된 microcentrifuge 튜브, 1 16-eluent의 1 mL를 수집 합니다. 단백질 시 약 또는 악기 제조 업체27,28여 Bradford 분석 실험 또는 특정 방법에 따라 UV 보이는 분광학 등 색도계 단백질 분석 결과 사용 하 여 분수를 테스트 합니다. 같이, 색도계 분석 결과 Coomassie blue를 사용 하 여이를 축소 100 μ 볼륨 각 분수에서만 작은 볼륨을 희생 하기 위하여. 색도계의 100 µ L 각 분수의 혼합 3 μ 시 약을 시험 하 고 수동으로 분수; 단백질의 존재를 나타내기 위해 어떤 색깔 든 지의 형성 탐지는 분석기와 필요 하지 않습니다. 단백질 분수 16에에서 있으면 1 mL 분수와 단백질에 대 한 분석 결과 정기적으로, 방출까지 계속 eluted 분수 이상 단백질의 상당한 금액을 포함. 깨끗 한 원뿔 관으로 포함 하는 단백질 분수를 결합 하 고 나중에 분석 100 μ 샘플 SDS 페이지26에 의해 철회. 금속 이온 공동 인자의 재구성으로 진행 하거나 3 mL aliquots-80 ° c.에 있는 단백질을 고정 그 10% 글리세롤 포함 한지는 차입에 버퍼가 cryoprotectant 동결 동안 순수 단백질을 안정. Ni NTA 열의 차입 완료 되 면, 즉, 모든 단백질은 열에서 고 분수에서 수집, 전달 열을 통해 차입 버퍼의 또 다른 25 mL 단기 저장을 위해 차입 버퍼의 ~ 5 mL에 4 ° C에 열을 저장 또는 장기 저장을 위한 20% 에탄올과 세포/바인딩 버퍼. 3. Fe2 + 대상 단백질의 재구성 Fe2 + 의 추가참고:이 예제에서 아미노산의 일종 dioxygenase 같은 효소 바인딩 비 heme 철 (II) 필요는 Fe2 + 이온 활동; 그러나, 철 (II)는, 철 (III), 쉽게 산화 하 고 전혀 어떤 철 없이 정화 단백질의 일부분. 금속의 재구성을 시작 하려면 차입 버퍼에 순화 된 효소의 3 mL을 구하십시오. 냉동, 미지근한 물 목욕을 사용 하 여 빠르게 해 동 하 고 한 번 해 동, 얼음에 단백질을 넣어. 튜브에 단백질의 볼륨을 사용 하 여, 나트륨 하는데 (198.1 g/mol) 샘플에서 최종 농도 12.5 m m를 만들기 위해 필요한 금액을 계산 합니다. 또한, dithiothreitol (DTT, 154.25 g/mol) 샘플에서 최종 농도 12.5 m m를 만들기 위해 필요한 금액을 계산 합니다. 단단한 나트륨 하는데 및 DTT 추가 하 고 부드럽게, 그러나 철저 하 게, 완전히 분해를 혼합. 알아서 하지 지나치게 공격적 혼합 단백질 강 수 발생할. 단백질 견본을 철 (II) 황산 염 heptahydrate (MW 278.01 g/mol)의 작은 금액을 추가 합니다. 몇 가지 1 철 소금, 수돗물의 충분히 작은 수량을 얻기 위하여 mm FeSO4•7H2O 밖으로 단단한 조각에의 립 종이 무게과 립, 종이 접고 고 금속 주걱의 편평한 측으로 그것을 분쇄. 단백질의 튜브를 결과 분말의 입자를 추가 합니다. 혼합 하는 소용돌이 장미빛 핑크 색 튜브에 표시 됩니다. 단백질, 얼음에 10-30 분 출장의 분홍색 솔루션을 품 어. 핑크 색상 천천히 시간이 지남에 사라질 것 이다. 젤 여과 약 6, 000의 분자량 제외 제한와 10 mL 저수지도 갖춘 1.5 x 12 cm 열 µ m 90-180의 수 화 입자 크기 범위 구형 polyacrylamide 젤 10 mL 포장 젤 여과 열을 사용 합니다. 열은 낮은 갖추고 상단 침대 지원 열에 수 지를 유지 하 고 수 지 침대 건조 실행에서 방지 30 um 다공성 폴 리 에틸렌 디스크의 형태로 확인 합니다. 젤 여과 열 링 스탠드를 탑재 합니다. 사전 패키지 된 젤 여과 열을 사용 하는 경우 뚜껑을 제거 하 고 상단 침대 지원 위에 초과 버퍼에서 부 어. 열, equilibrate에 버퍼 후속 분석 결과 및 저장, 예를 들어 50mm NaH2포4, 200 m m NaCl, pH 8.0에서 10% 글리세롤과 호환 되는 저수지를 작성 하 여 시작 합니다. 사전 패키지 된 젤 여과 열을 사용 하는 경우 버퍼의 흐름을 시작 하 여 노출 Luer 슬립 피팅 젤 여과 열의 아래쪽 끝에서 스냅. 열, Luer 슬립 끝에 자 지를 맞게 하지만 고 열 중력 드립에 허용. 버퍼 열에서 뽑아가 고 상단 침대 지원 노출, 자 지, 닫고 노출된 상단 침대 지원에 솔루션 pipetting으로 열에 Fe (II) 재구성 metalloenzyme ~ 3 mL를 추가 합니다. 자 지를 열고 전체 3.0 mL 샘플 중력에 의해 열을 입력을 허용 합니다. Eluent의이 첫 3 mL을 삭제 합니다. 솔루션을 처리 하는 동안 형성 된 핑크 색상 열의 상단에 갇혀 있을 것입니다. 열 물이 뚝뚝 떨어지는 중지 하 고 상단 침대 지원 노출, 열에 젤 여과 버퍼 (예를 들어, 50mm NaH2포4, 200 m m NaCl, pH 8.0에서 10% 글리세롤)의 4 개 mL를 추가 합니다. 자 지를 열고 microcentrifuge 튜브 8 0.5 mL 분수는 eluent 수집 합니다. 앞에서 설명한 대로 색도계 단백질 분석 결과 또는 UV 마주27,28 를 사용 하 여 단백질에 대 한 분수를 테스트 합니다. 결합 단백질이 포함 된 분수. SDS 페이지 분석26에 대 한 샘플을 철회 한다. 분석 결과 또는 샘플의 스토리지와 함께 진행 합니다.