台式固定化金属亲和层析、Polyhistidine 标记金属酶的重组与检测

1. 净化准备 无细胞粗萃取物的制备 获得一个9-10 克的大肠杆菌(BL21) 细胞颗粒, 抗原 polyhistidine 标记金属蛋白质25在50毫升锥管。 添加5毫升每克室温裂解/捆绑缓冲 (50 毫米磷酸盐, 300 毫米氯化钠, 10 毫米咪唑在 pH 8) 到 ~ 9-10 g 的细胞丸为总容积 ~ 45-50 毫升。周期性涡刺激溶解。如果颗粒被冻结, 在温水浴中解冻。 使用冰水浴, 使细胞悬浮液冷却至3摄氏度, 以制备细胞裂解。注: 在这一点上, 细胞裂解的超声波, 珠铣或其他方法是可能的。珠铣是在这里展示, 因为它是快速, 相对便宜, 不需要耳保护。 根据制造商的指示, 装配一个50毫升的珠铣削室。 填充的珠磨室半满冷0.1 毫米玻璃珠, 已储存在-20 °c。 用冷冻细胞悬浮液填满房间的其余部分, 并使用4°c 溶解/束缚缓冲器完全填满房间。 用小刮刀旋转珠磨的轴, 并将电池悬浮与珠子混合。 用吸管去掉任何大气泡, 然后拧紧盖子。 从任何渗漏中把房间晾干。 添加约1杯冰, 以清楚, 塑料夹克, 倒置填充50毫升室进入冰填充夹克, 和螺丝关闭。 把冰套室固定在马达上。 将珠磨马达打开15秒, 在 15800 rpm, 然后允许休息45秒。重复8次。 当8循环完成, 醒酒整个细胞裂解悬浮成50毫升或更大的管额定高速离心 (2.5万 x 克或更高)。在离心机上放置一对平衡管, 在 4°c 2.5万 x g 处旋转40-45 分钟, 以颗粒细胞碎片和玻璃珠为单位。注: 如果额定为高速离心的50毫升或更大的管子不可用, 则在50毫升圆锥管中, 用离心在 1000-2000 x g 处去除玻璃珠, 以产生体积较小的细胞悬浮液 (~ 25 毫升), 可排水成较小的体积e 管额定高速离心。 当离心完成后, 醒酒清除, 黄色, 无细胞, 粗萃取物成一个干净的50毫升圆锥管。注意不要转移任何细胞碎片。 收集一个小样本的无细胞的粗提取物, 以供以后分析的纯化由 SDS26页。 IMAC 柱的制备 获得一个 1.5 x 20 厘米列配备了较低的床支持, 以保留树脂颗粒, 鲁尔锁出口和上限, 也包含鲁尔锁配件。将鲁尔锁插座与旋塞阀配合使用以控制流量。 在台式工作, 安全地将柱子放在环架上。 在20% 乙醇中获得50% 的镍-nitriloacetic 酸 (镍-NTA) 树脂浆料, 其储存在4摄氏度。 轻轻地旋转瓶子, 均匀地重新悬浮树脂。 工作在室温和台式, 使用一个毕业的吸管提取2毫升的泥浆, 这将产生1毫升的固定树脂能够结合50-60 毫克的 polyhistidine 标签蛋白, 并将浆料转移到柱上。 打开旋塞阀, 允许过剩的存储解决方案从树脂中排出重力。 安全关闭旋塞阀 使用巴斯德吸管, 小心地加入冷冻裂解/捆绑缓冲 (50 毫米磷酸盐, 300 毫米氯化钠, 10 毫米咪唑在 pH 8) 和到树脂柱-至少30毫升。注意不要扰乱树脂表面。在列的墙壁下运行缓冲区, 以防止飞溅。 平衡树脂通过允许溶解/束缚缓冲慢慢地从专栏被重力排泄入收集烧杯。 当裂解/捆绑缓冲液大部分耗尽时, 关闭旋塞阀以停止缓冲液的流动, 当5毫升的溶解缓冲液保持在树脂之上, 并离开柱, 直立, 直到准备进行或长达1周。 2. IMAC 对 Polyhistidine 标记目标的纯化 准备洗涤缓冲器 (50 毫米磷酸盐, 300 毫米氯化钠, 20 毫米咪唑 pH 8) 和洗脱缓冲器 (50 毫米磷酸盐, 300 毫米氯化钠, 250 毫米咪唑, 10% 甘油 pH 值 8)。凉在4°c。 通过打开旋塞阀, 并允许剩余的裂解/粘结缓冲液通过镍 NTA 树脂 NTA, 制备出无细胞粗萃取物的镍———-。当所有的缓冲液耗尽, 树脂表面暴露后, 关闭旋塞阀。 使用巴斯德吸管, 小心地将无细胞的粗萃取物吸管到树脂上, 注意不要扰乱表面。在柱子的墙上运行粗糙的萃取物以防止溅水。所应用的粗提取物量取决于 polyhistidine 标记蛋白的表达水平;确保粗提取物的总体积包含50-60 毫克或更少的目标蛋白质每毫升镍 NTA 树脂 (见步骤 1.2.4)。 当所有的粗萃取物都被转移到柱子上时, 打开旋塞阀, 这样柱子就会被重力排出。这种流动是由没有绑定到树脂的蛋白质组成的-收集 100 ul, 以供以后的分析纯化的 SDS 页。26 无细胞粗萃取物的粘度可以大大减慢柱体的重力流。要提高流量, 应用简单的 “手泵”: 采取一个10毫升鲁尔锁注射器, 并连接到柱帽上使用短长度的塑料油管和鲁尔锁配件之间的柱帽和注射器。拔下注射器柱塞, 然后将柱帽紧配合在柱子顶部。 轻轻地压缩注射器的柱塞, 同时通过将淋洗收集到一个毕业的气缸来手动评估流速;每分钟1-2 毫升的速率与树脂和此设置兼容。当流速减慢时, 轻轻地增加注射器柱塞的压缩。 为防止将空气引入树脂, 当应用液体的半月板达到5-10 毫米以上的树脂床, 并允许剩余的体积被重力排出时, 取下柱帽和附着的手泵。 当无细胞的粗萃取物已完成排泄和树脂表面再次暴露, 使用巴斯德吸管小心地添加〜30毫升的冷冻洗涤缓冲柱-注意不要扰乱树脂表面。在列的墙壁下运行缓冲区, 以防止飞溅。 打开旋塞阀, 并允许洗涤缓冲区在列中流失。这个过程是从树脂中去除弱束缚蛋白。丢弃淋洗。 当洗涤缓冲器正在排水时, 准备十六, 标记, 离心管收集1毫升的分数。 当洗涤缓冲液耗尽, 树脂表面再次暴露后, 关闭旋塞阀。使用巴斯德吸管小心地将30毫升的冷却洗脱缓冲液添加到柱上-注意不要扰乱树脂表面。在列的墙壁下运行缓冲区, 以防止飞溅。 慢慢打开旋塞阀, 并允许洗脱缓冲洗脱 polyhistidine 标记的蛋白质从专栏。收集1毫升的淋洗在每个标记的离心管, 1 到16。 根据试剂和/或仪器制造商27,28的具体方法, 测试蛋白质的分数, 如布拉德福德化验或紫外可见光光谱学。如图所示, 使用考马斯蓝的比色法可以缩小到 100 ul 体积, 以牺牲每一个分数的小体积。 混合 3 ul 的每一个分数与100µL 的比色蛋白检测试剂, 并手动观察任何颜色的形成, 以表明存在蛋白质的分数;不需要用光谱仪进行检测。 如果蛋白质在分数16中发现, 继续洗脱1毫升的分数, 并定期化验蛋白质, 直到洗脱分数不再含有大量的蛋白质。 将含蛋白质的分数组合成一个干净的锥形管, 并提取 100 ul 样品, 供后期分析用 SDS26页。 进行金属离子余子的重构, 或在整除数的3毫升内冷冻蛋白质。确保洗脱缓冲液中含有10% 甘油是一种在冷冻过程中稳定纯蛋白的 cryoprotectant。 当 NTA 柱的洗脱是完整的, 即所有的蛋白质是从列和收集的分数, 传递另一个25毫升的洗脱缓冲通过该专栏, 并存储在4°c 5 毫升的洗脱缓冲, 以短期存储的列, 或裂解/捆绑缓冲器与20% 乙醇的长期储存。 3. 用 Fe2 +重组靶蛋白 添加 Fe2 +注: 非血红素铁 (II) 结合酶, 如 l-多巴酶在本例中, 需要一个 Fe2 +离子的活动;但是, 铁 (II) 容易氧化成铁 (III), 这是不活跃的, 和蛋白质的一部分, 没有任何铁净化。 要开始重建金属, 获得3毫升的纯化酶悬浮在洗脱缓冲。如果结冰, 用温水浴迅速解冻, 一旦解冻, 将蛋白质放在冰上。 利用试管中的蛋白质体积, 计算出所需的抗坏血酸钠 (198.1 克/摩尔), 使样品中的最终浓度为12.5 毫米。此外, 计算 dithiothreitol (154.25 克/摩尔) 所需的量, 使最终浓度12.5 毫米的样品。 加入固体抗坏血酸钠, 并轻轻, 但彻底, 混合完全溶解。注意不要导致蛋白质沉淀过度积极的混合。添加少量的铁 (II) 硫酸水合物 (兆瓦278.01 克/摩尔) 的蛋白质样品。 为了获得足够小的铁盐的数量, 轻拍1毫米颗粒的 FeSO4· 7H2O 固体在一张重纸上, 折叠纸在颗粒上, 并且粉碎它与金属铲的平的边。 将产生的粉末添加到蛋白质管中。 漩涡混合和玫瑰色粉红色的颜色将出现在管。 在冰上孵化出蛋白质的粉红色溶液, 盖上10-30 分钟。粉红色的颜色会随着时间慢慢褪色。 凝胶过滤 使用10毫升球形聚丙烯酰胺凝胶填充的凝胶过滤柱, 其分子量排除限约为 6000, 在 1.5 x 12 厘米柱上90–180µm 的水合粒径范围, 该塔还配有10毫升储层。确保柱上有下部和上床支承, 其形式为30微米多孔聚乙烯圆盘, 保留树脂在柱上, 防止树脂床运行干燥。将凝胶过滤柱安装到环形支架上。 如果使用预包装的凝胶过滤柱, 取下瓶盖, 并将多余的缓冲液倒在上床支架上方。 要平衡柱, 首先用缓冲液与随后的化验和贮存相兼容的储层, 例如, 50 毫米 NaH2PO4, 200 毫米氯化钠, 10% 甘油在 pH 值8.0。 如果使用预包装的凝胶过滤柱, 切断凝胶过滤塔的底部, 启动缓冲流, 并暴露鲁尔滑移管接头。将旋塞阀与列的鲁尔滑动端相匹配, 但保持打开状态, 并允许该列通过重力进行滴水。 当缓冲区从柱体中排出, 上层支撑被暴露后, 关闭旋塞阀, 并将该溶液吹打到所暴露的上床支架上, 将金属酶重组后的 Fe (II) 的 ~ 3 毫升添加到柱上。 打开旋塞阀, 允许整个3.0 毫升的样品通过重力进入柱。丢弃这些前3毫升的淋洗。在处理解决方案时形成的任何粉红色颜色都将被困在列的顶部。 当柱停止滴水和上床支撑暴露, 添加4毫升的凝胶过滤缓冲 (例如, 50 毫米 NaH2PO4, 200 毫米氯化钠, 10% 甘油在 pH 8.0) 到专栏。打开旋塞阀, 并收集淋洗到离心管超过八0.5 毫升分数。 用比前述的比色蛋白测定或紫外-27,28测定蛋白质的分数。 结合含蛋白质的分数。 提取26的 SDS 页分析样本。 进行样品的化验或贮存。