In Vivo Mikrodialyse-Methode, um große extrazellulären Proteine Sammeln von Gehirn interstitielle Flüssigkeit mit hochmolekularen Gewicht Cut-Off-Sonden
Summary
In Vivo Mikrodialyse ermöglichte Ansammlung von Molekülen im Gehirn interstitielle Flüssigkeit (ISF) von wach, frei Verhalten Tieren vorhanden. Um relativ große Moleküle in ISF zu analysieren, der aktuelle Artikel konzentriert sich speziell auf der Mikrodialyse-Protokoll mit Sonden mit hohem Molekulargewicht Membranen abgeschnitten.
Abstract
In Vivo Mikrodialyse ist eine leistungsstarke Technik, ISF von wach, frei Verhalten Tieren basiert auf einem Prinzip der Dialyse zu sammeln. Während Mikrodialyse eine etablierte Methode, die relativ kleine Moleküle wie Aminosäuren oder Neurotransmitter misst ist, wurde es vor kurzem zur Dynamik von größeren Molekülen in ISF mit Sonden mit hohem Molekulargewicht abgeschnitten bewerten Membranen. Bei Verwendung solcher Sonden, muss Mikrodialyse in einem Push-Pull-Modus zu Druck im Inneren der Sonden angesammelt ausgeführt werden. Dieser Artikel enthält detaillierte Protokolle einschließlich stereotaktischen Chirurgie und Mikrodialyse Linien einrichten, um Proteine von ISF zu sammeln. Während Mikrodialyse können Medikamente systemisch oder durch direkte Infusion in ISF verabreicht werden. Umgekehrte Mikrodialyse ist eine Technik, um direkt Verbindungen in ISF einfließen. Aufnahme von Medikamenten in der Mikrodialyse Perfusion Puffer ermöglicht es ihnen, durch die Sonden in ISF diffundieren, während gleichzeitig die ISF zu sammeln. Durch die Messung von Tau-Protein als Beispiel, zeigt der Autor, wie die Ebenen auf anregende neuronaler Aktivität durch umgekehrte Mikrodialyse Picrotoxin verändert werden. Vorteile und Grenzen der Mikrodialyse werden zusammen mit dem erweiterten Programm beschrieben, durch die Kombination von anderen in-Vivo -Methoden.
Introduction
ISF umfasst 15-20 % der gesamten Hirnvolumen und bietet eine Mikroumgebung für Signaltransduktion, substrattransport und Abfälle Clearance1von entscheidender Bedeutung. Daher wird die Möglichkeit des Sammelns ISF von lebenden Tieren größere Auswirkungen für verschiedene biologische Prozesse sowie Krankheitsmechanismus bieten. In Vivo Mikrodialyse ist eine der wenigen Methoden, die Probe und extrazelluläre Moleküle von ISF von Wachen, frei beweglichen Tieren zu quantifizieren und dient damit als ein nützliches Werkzeug in der neurowissenschaftlichen Forschung Feld2,3. Bei dieser Methode werden Mikrodialyse Sonden mit halbdurchlässigen Membranen im Gehirn und mit Perfusion Puffer auf die relativ langsame Fließgeschwindigkeit durchströmt (0,1-5 µL/min). Während dieser Perfusion extrazelluläre Moleküle im ISF passiv in die Sonde nach dem Konzentrationsgefälle diffundieren und sammeln Sie wie ein Dialysat. Obwohl dieser Artikel konzentriert sich auf die Methode zum Beispiel ISF im Gehirn, können das Prinzip und die Methode auf andere Organe durch entsprechende Modifikation bei Bedarf angewendet werden.
Mikrodialyse arbeitete zuerst in den frühen 1960er Jahren, und seit dann es ausgiebig verwendet wurde, um kleine Moleküle wie Aminosäuren oder Neurotransmitter im Gehirn zu sammeln. Aktuelle kommerzielle Verfügbarkeit der Mikrodialyse Sonden mit hochmolekularen Gewicht Membranen (100 kDa-3 MDa) abgeschnitten hat jedoch seine Anwendung auf relativ größere Proteine in ISF sowie4,5,6 erweitert. ,7. Die Studien mit diesen Sonden führte zu der Feststellung, dass Proteine wie Tau oder α-Synuclein, die lange werden exklusive zytoplasmatischen sind auch physiologisch in ISF4,5,8.
Eines der Probleme mit Mikrodialyse Sonden mit großen Cut-off-Membranen (in der Regel mehr als 1.000 kDa) ist, dass sie anfälliger für Ultrafiltration Flüssigkeitsverlust durch den inneren Druck in den Sonden angesammelt. Mikrodialyse Sonden verwendet hier haben eine einzigartige Struktur, um dieses Problem zu vermeiden. Der Druck wird nicht durch diese Struktur aufgebaut werden, so sollten Mikrodialyse mit diesen Sonden betrieben werden, in eine “Push-Pull”-Modus über eine Spritzenpumpe zum durchspülen von Sonden (= Push) und eine Walze/Peristaltikpumpe, das Dialysat kommen aus der Sonde Steckdose zu sammeln (= ziehen) 9 (obwohl es sowohl Push-als auch Pumpen, durch Druck abbrechen Luftlöcher vorhanden in den Sonden braucht der technisch nur Antrieb erfolgt durch die Pull-Pumpe). Dieser Artikel beginnt mit der stereotaktischen Operation ein Leitfaden Kanüle Implantation und beschreibt, wie Mikrodialyse Zeilen einrichten, um ISF durch Mikrodialyse Sonden mit 1.000 kDa Cutoff Membranen zu sammeln.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikrodialyse mit hohem Molekulargewicht Membranen abgeschnitten hat von einem Push-Pull-Modus betrieben werden, so ist es wichtig, dass die Durchflussmenge genau und konstant sind. Die Ungenauigkeit in der Durchflussmengen kann die Ursache der Luftblase Generation und Inkonsistenz in der probenkonzentration sein. Wenn der Fluss inkonsistent ist, prüfen Sie alle Anschlüsse auf Dichtheit. Wenn das Problem weiterhin besteht, kann es mit neuen Sonden und Schläuche Neustart erforderlich.
Microdi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt von ” Beihilfe für die wissenschaftliche Forschung an innovativen Bereichen (Gehirn Protein Altern und Demenz Control)(15H01552) aus MEXT und Beihilfe für junge Wissenschaftler (B) (16K 20969). Der Autor dankt Dr. David M. Holtzman und Dr. John R. Cirrito für die technische Beratung bei der Entwicklung dieser Methode.
Materials
| The Univentor 820 Microsampler | Univentor | 8303002 | Refrigerated fraction collector |
| Syringe pump | KD scientific | KDS-101 | |
| Roller pump | Eicom microdialysis | ERP-10 | |
| Raturn Stand-Alone System | BASi | MD-1409 | Free-moving system |
| Dual species cage kit | BASi | CX-1600 | |
| AtmosLM Microdialysis probe (shaft length 8 mm, membrane length 2 mm) | Eicom microdialysis | PEP-8-02 | Shaft length for a probe, a guide, a dumy probe and a stereotaxic adaptor should be identical. |
| Microdialysis guide (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PEG-8 | |
| Microdialysis dummy probe (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PED-8 | |
| Bone screw | BASi | MD-1310 | |
| Super bond C&B set | Sunmedical | Dental cement | |
| Small animal Stereotaxic Instrument with digital display console | Kopf | Model 940 | Stereotaxic apparatus |
| Mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting | 51648 | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A7284-50ML | 30% BSA solution |
| FEP tubing (70 cm) | Eicom microdialysis | JF-10-70 | Internal volume = 0.5 µL/cm |
| Teflon tubing (50 cm) | Eicom microdialysis | JT-10-50 | Internal volume = 0.08 µL/cm |
| Byton tube | Eicom microdialysis | JB-30 | |
| Intramedic luer stab adaptor 23G | BD | 427565 | Blunt end needle |
| Roller tube | Eicom microdialysis | RT-5S | Internal volume = 4 µL |
| Cap nut | Eicom microdialysis | AC-5 | |
| 0.25 mL microcentrifuge tube with cap | QSP | 503-Q | Tubes for fraction collector |
| Sterotaxic adaptor (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PESG-8 | |
| Connection needle | Eicom microdialysis | RTJ | |
| Mouse animal collar | BASi | MD-1365 | |
| High Speed Rotary Micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Drill |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| Screw driver for bone screws | |||
| Scalpel | |||
| Cotton swab | |||
| Surgical clipper |
References
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