In Vivo Sondes de la microdialyse méthode pour recueillir les grosses protéines extracellulaires de cerveau liquide interstitiel avec seuil de poids moléculaire élevé
Summary
In vivo la microdialyse a permis la collecte des molécules présentes dans le liquide interstitiel de cerveau (ISF) des animaux éveillés, agir librement. Afin d’analyser les molécules relativement importantes dans l’ISF, l’article actuel se concentre spécifiquement sur le protocole de la microdialyse utilisant des sondes à haut poids moléculaire, couper des membranes.
Abstract
In vivo la microdialyse est une technique puissante pour recueillir l’ISF des animaux éveillés, agir librement basés sur un principe de la dialyse. Microdialyse est une méthode établie qui mesure relativement petites molécules, y compris les acides aminés ou neurotransmetteurs, il a été récemment utilisé pour évaluer aussi dynamique de molécules plus grosses dans l’ISF à l’aide de sondes à haut poids moléculaire coupé membranes. Lors de l’utilisation de ces sondes, microdialyse doit être exécuté en mode push pull pour éviter la pression accumulée à l’intérieur les sondes. Cet article fournit des protocoles étape par étape, y compris la chirurgie stéréotaxique et comment configurer les lignes microdialyse pour collecter les protéines de l’ISF. Au cours de la microdialyse, médicaments peuvent être administrés soit systématiquement, soit par injection directe dans ISF. Microdialyse inverse est une technique d’infuser directement composés en ISF. Inclusion des médicaments dans le tampon de perfusion microdialyse leur permet de diffuser dans l’ISF à travers les sondes alors qu’elles ramassaient simultanément ISF. En mesurant la protéine tau à titre d’exemple, l’auteur montre comment ses niveaux sont altérées lors de stimulation de l’activité neuronale par microdialyse inverse de la picrotoxine. Avantages et limites de la microdialyse sont décrits ainsi que l’application étendue en associant d’autres méthodes in vivo .
Introduction
ISF est composé de 15 à 20 % du volume total cérébral et offre un micro-environnement critique pour la transduction du signal, transport du substrat et dégagement des déchets1. Donc, la capacité de collecte ISF auprès des animaux vivants offrira une plus grande implications pour les différents processus biologiques ainsi que le mécanisme de la maladie. In vivo la microdialyse est l’une des rares méthodes cet échantillon et quantifier les molécules extracellulaires d’ISF d’éveillé, se déplaçant librement les animaux et ce qui constitue un outil utile en neurosciences recherche champ2,3. Dans cette méthode, microdialyse sondes avec les membranes semi-perméables sont insérés dans le cerveau et perfusés avec du tampon de perfusion au débit relativement lente (0,1 à 5 µL/min). Au cours de cette perfusion, molécules extracellulaires dans ISF passivement diffusent dans la sonde selon le gradient de concentration et de recueillent un dialysat. Bien que cet article se concentre sur la méthode d’échantillonnage ISF dans le cerveau, tant le principe que la méthode peuvent être appliquées à d’autres organes par des modifications appropriées si nécessaire.
Microdialyse fut d’abord employé dans les années 1960 et depuis, puis il a été largement utilisé pour recueillir les petites molécules, y compris les acides aminés ou des neurotransmetteurs dans le cerveau. Cependant, la récente disponibilité commerciale de microdialyse sondes à poids moléculaire élevé, coupée de membranes (100 kDa-3 MDa) a élargi son application aux protéines relativement plus importantes dans l’ISF ainsi que4,5,6 ,7. Les études à l’aide de ces sondes a conduit à la conclusion que les protéines telles que tau ou α-synucléine qui ont été longtemps considérés comme exclusive cytoplasmique sont physiologiquement présents dans ISF4,5,8.
Une des difficultés à l’aide de sondes microdialyse avec grande coupure de membranes (en général plus 1 000 kDa) est qu’ils sont plus sensibles aux pertes de fluides ultrafiltration en raison de la pression intérieure accumulée dans les sondes. Microdialyse sondes utilisées ici ont une structure unique pour éviter ce problème. La pression ne sera pas construite vers le haut en raison de cette structure, ainsi la microdialyse avec ces sondes peuvent être exploitées dans un mode « Push-Pull » à l’aide d’un pousse-seringue à perfuse les sondes (= push) et une pompe péristaltique/rouleau pour recueillir le dialysat venant de la prise de la sonde (= tirer) 9 (même si elle a besoin de pompes de pousser et de tirer, en raison de la pression annulant les orifices de ventilation dans les sondes, le système est techniquement seulement piloté par la pompe d’extraction). Cet article commence par la chirurgie stéréotaxique d’une implantation de canule guide et décrit comment configurer la microdialyse lignes afin de recueillir l’ISF par microdialyse sondes avec des membranes de coupure 1 000 kDa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microdialyse à haut poids moléculaire, couper des membranes doit être exploité par un mode push pull, donc il est essentiel que le débit soit fidèle et constante. L’inexactitude dans les débits peut être la cause de la génération de bulles d’air et l’incohérence de la concentration de l’échantillon. Si le flux est incohérent, vérifiez toutes les connexions des fuites. Si le problème persiste, il peut être nécessaire de re-commencer avec tubes et nouvelles sondes.
Micro…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par ” subvention pour la recherche scientifique sur des domaines novateurs (protéine de Brain Aging et démence Control)(15H01552) du MEXT et subventions pour jeunes chercheurs (B) (16K 20969). L’auteur remercie le Dr. David M. Holtzman et Dr. John R. Cirrito pour les conseils techniques au cours du développement de cette méthode.
Materials
| The Univentor 820 Microsampler | Univentor | 8303002 | Refrigerated fraction collector |
| Syringe pump | KD scientific | KDS-101 | |
| Roller pump | Eicom microdialysis | ERP-10 | |
| Raturn Stand-Alone System | BASi | MD-1409 | Free-moving system |
| Dual species cage kit | BASi | CX-1600 | |
| AtmosLM Microdialysis probe (shaft length 8 mm, membrane length 2 mm) | Eicom microdialysis | PEP-8-02 | Shaft length for a probe, a guide, a dumy probe and a stereotaxic adaptor should be identical. |
| Microdialysis guide (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PEG-8 | |
| Microdialysis dummy probe (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PED-8 | |
| Bone screw | BASi | MD-1310 | |
| Super bond C&B set | Sunmedical | Dental cement | |
| Small animal Stereotaxic Instrument with digital display console | Kopf | Model 940 | Stereotaxic apparatus |
| Mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting | 51648 | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A7284-50ML | 30% BSA solution |
| FEP tubing (70 cm) | Eicom microdialysis | JF-10-70 | Internal volume = 0.5 µL/cm |
| Teflon tubing (50 cm) | Eicom microdialysis | JT-10-50 | Internal volume = 0.08 µL/cm |
| Byton tube | Eicom microdialysis | JB-30 | |
| Intramedic luer stab adaptor 23G | BD | 427565 | Blunt end needle |
| Roller tube | Eicom microdialysis | RT-5S | Internal volume = 4 µL |
| Cap nut | Eicom microdialysis | AC-5 | |
| 0.25 mL microcentrifuge tube with cap | QSP | 503-Q | Tubes for fraction collector |
| Sterotaxic adaptor (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PESG-8 | |
| Connection needle | Eicom microdialysis | RTJ | |
| Mouse animal collar | BASi | MD-1365 | |
| High Speed Rotary Micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Drill |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| Screw driver for bone screws | |||
| Scalpel | |||
| Cotton swab | |||
| Surgical clipper |
References
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