Correzione di bozze e saggio di riparazione del DNA usando l'analisi di spettrometria di massa di singolo Nucleotide estensione e MALDI-TOF
Summary
Un metodo non-radio-isotopica non etichettata per correzione di bozze della polimerasi del DNA e un saggio di riparazione del DNA è stato sviluppato utilizzando la spettrometria di massa MALDI-TOF ad alta risoluzione e una strategia di estensione di singolo nucleotide. Il test ha dimostrato di essere molto specifico, semplice, rapida e facile da eseguire per la correzione di bozze e riparare le patch inferiore 9-nucleotidi.
Abstract
Il mantenimento del genoma e suo fedele replica è di primaria importanza per la conservazione di informazioni genetiche. Per valutare la replica ad alta fedeltà, abbiamo sviluppato un semplice non marcato e analisi di spettrometria (MS) per uno studio di correzione di bozze di massa non-radio-isotopica metodo utilizzando un’ionizzazione di matrix-assisted laser desorption con tempo di volo (MALDI-TOF). Qui, una polimerasi del DNA [per esempio, il frammento di Klenow della polimerasi di DNA di Escherichia coli (KF) ho (pol io) in questo studio] in presenza di tutti e quattro i trifosfati dideoxyribonucleotide viene utilizzato per elaborare un duplex non corrispondenti primer-modello. Il primer non corrispondente è quindi esteso Rileggi e sottoposti a MALDI-TOF MS. I prodotti si distinguono per la variazione della massa del primer fino a variazioni di singolo nucleotide. Importante, una correzione di bozze può anche essere determinato per interno singolo disadattamento, seppur alle efficienze diverse. Mancate corrispondenze in posizione 2-4-nucleotidi (nt) dall’estremità 3′ sono stati efficacemente corretto da pol io, e una mancata corrispondenza alle 5 nt dal capolinea primer ha mostrato solo una parziale correzione. Nessuna correzione di bozze si è verificato per le mancate corrispondenze interne, situate al 6-9 nt da estremità 3′ primer. Questo metodo può essere applicato anche ai test di riparazione del DNA (per esempio, valutare una riparazione di base-lesione dei substrati per la via di riparazione endo V). Primer contenenti 3′ penultimo deoxyinosine (dI) lesioni potrebbe essere corretto da pol io. Infatti, penultimo T-I, G-I e A-ho substrati ha avuto loro ultimo 2 nucleotidi contenenti dI asportato da pol io prima di aggiungere un corretta ddN 5′-monofosfato (ddNMP) mentre la penultima C-mi mancate corrispondenze sono state tollerate da pol I, permettendo il primer per essere esteso senza riparazione, che dimostrano che la sensibilità e la risoluzione del MS test per misurare la riparazione del DNA.
Introduction
Le funzioni di correzione di bozze di polimerasi del DNA durante la replicazione del DNA sono essenziali per garantire l’alta fedeltà dell’informazione genetica che deve essere trasferito alla progenie1,2,3,4, 5,6,7. Essendo in grado di valutare il contributo della polimerasi esonucleasi correzione di bozze sarebbe chiarire i meccanismi di salvaguardia della stabilità genetica.
Etichettatura del radioisotopo e gel a base di saggi in combinazione con analisi densitometriche del autoradiogrammi o fosforo imaging8,9,10 sono stati usati tradizionalmente per rilevare attività di correzione delle bozze del DNA polimerasi. Mentre funzionale, queste analisi sono laborioso, costoso e non suscettibili di formati ad alta velocità. In più, radioisotopi soffrono di problemi di sicurezza, compreso lo smaltimento dei rifiuti. In alternativa, correzione di bozze di attività sono stati analizzati mediante tecniche fluorometriche. Ad esempio, 2-aminopurine (2-AP) possa essere incorporati nei prodotti di estensione durante in vitro della polimerasi Revisione saggi per produrre un segnale fluorescente11,12. Purtroppo, questi approcci soffrono di una bassa specificità, poiché 2-AP può abbinare con timina e citosina. Approcci più recenti includono una sensibile basati su G-quadruplex luminescente accensione sonda per una polimerasi 3′ – 5′ esonucleasi dosaggio13 come pure una sonda fluorescente etichettati singolarmente per una polimerasi correzione bozze di dosaggio che supera alcuni del suddetti inconvenienti14. Entusiasmo per questi metodi fluorimetrici è diminuita a causa della necessità per l’etichettatura specifica dei substrati di DNA.
Al contrario, un MALDI-TOF MS per l’analisi del DNA è stata impiegata nell’analisi della PinPoint, dove le reazioni di estensione del primer con adenoide 4 ddNTP possono essere utilizzate per identificare i polimorfismi a un dato locus15,16,17 e è stato ampiamente adottato in applicazioni cliniche per i rilevamenti di mutazione e di diagnosi di cancro18. Utilizzando questi principi di base, abbiamo creato un’analisi senza etichetta per la determinazione in vitro del DNA polimerasi bozze attività sfruttando l’alta risoluzione, alta specificità e alto-rendimento potenziale di utilizzo di MALDI-TOF MS. E. coli DNA polimerasi ho Klenow frammento come un enzima di modello, dideoxyribonucleotide trifosfati (ddNTP) come substrati possono prendere un “snapshot” di correzione di bozze prodotti dopo un singolo nucleotide estensione tramite MALDI-TOF MS (Figura 1).
Allo stesso modo, questo metodo è stato sviluppato anche per un dosaggio di riparazione del DNA dove primer contenenti 3′ penultima dI lesioni sono sottoposti a una pol che riparare dosaggio che imita endo V scalfito riparazione intermedi. Mentre non pienamente compreso, la via di riparazione endo V è l’unico sistema di riparazione conosciuto ad impiegare il pol ho correzione bozze attività esonucleasi per lesione asportazione19,20. Mediante MALDI-TOF MS, vi mostriamo una patch di riparazione chiaramente definiti dove dI possono essere asportate da pol io quando che si verificano sulle ultime 2 nt del primer prima di aggiungere il nucleotide accompagnato corretto.
Per lo studio della revisione e riparazione del DNA, questo metodo è più veloce e meno laborioso rispetto ai metodi precedenti e fornisce informazioni aggiuntive verso meccanismo e funzione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo studio ha descritto una dettagliate analisi di attività correzione di bozze analizzata mediante lo strumento commerciale prescelto (Vedi la Tabella materiali) mediante MALDI-TOF MS. I vantaggi principali sono che il primer e il modello sono etichetta gratuito e facile da eseguire, permettendo una maggiore flessibilità nella progettazione di esperimenti. Un flusso-calce completa elaborazione di 30 correzione test avrebbe preso 4 h, tra cui 3 h per eseguire manualmente la correzione di bozze reazi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il NCFPB Integrated Core Facility di genomica funzionale (Taipei, Taiwan) e il laboratorio di farmacogenomica NRPB (Taipei, Taiwan) per il loro supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto da borse di ricerca da Taiwan Health Foundation (L-I.L.) e il Ministero della scienza e tecnologia, Taipei, Taiwan, ROC [più 105-2320-B-002-047] per Hu Yao Wei, [più 105-2628-B-002-051-MY3] per Su Kang-Yi e [ Most-105-2320-B-002-051-MY3] per Lin Liang-In.
Materials
| Oligonucleotides | Mission Biotech (Taiwan) | ||
| phosphorothioate modified oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Taiwan) | ||
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs, MA | M0210L | |
| Klenow fragment (3'→5' exo-) | New England Biolabs, MA | M0212L | |
| NEBuffer 2.1 (10X) | New England Biolabs, MA | B7202S | |
| 2', 3' ddATP | Trilink Biotechnologies, CA | N4001 | |
| 2', 3' ddGTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4002 | |
| 2', 3' ddTTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4004 | |
| 2', 3' ddCTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4005 | |
| dATP, dGTP, dCTP, dTTP set | Clubio, Taiwan | CB-R0315 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | ||
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | |
| Clean Resin Tool Kit | Agena Bioscience, CA | #08040 |
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