새로운 바이러스 게놈을 발견 감염 된 잎에서 RNA 분석 원유 Virion 추출에 DNA의 결합 분석
Summary
여기 우리는 이중 가닥 DNA 게놈으로 식물 바이러스를 식별 하는 새로운 접근 방식을 제시. 감염 된 잎에서 DNA와 RNA를 추출 하 고 다음-세대 시퀀싱을 수행 표준 방법을 사용 합니다. Bioinformatic 도구 contigs로 시퀀스를 조립 하 고 contigs 바이러스 게놈을 나타내는 식별 분류학 그룹에 게놈을 할당 합니다.
Abstract
Metagenome 이렇게는 원형 DNA 게놈으로 식물 바이러스 및 그들의 증명서를 식별 하는 데 사용 됩니다. 종종 식물 DNA 바이러스는 그들의 호스트에 낮은 titers에서 발생 또는 다른 호스트에 기계적으로 주사 될 수 없다는 전파 감염 물질의 더 큰 titer를 달성 하기 어렵다. 감염 된 잎은 최적의 pH와 이온 조성 대부분 bacilliform 파라 레트로 바이러스를 정화 하는 것이 좋습니다 가벼운 버퍼에 지상. 요소는 virions 함정 포함 시체를 휴식 하 고 세포질 구성 요소를 분해 하는 데 사용 됩니다. 차등 원심 분리 공장 오염 물질에서 virions의 분리를 추가 제공합니다. 다음 가수분해 K 치료는 capsids 제거합니다. 바이러스 성 DNA 이다 집중 그리고 차세대 시퀀싱 (NGS) 사용 합니다. NGS 데이터는 NCBI-BLASTn 바이러스 시퀀스 생성 된 데이터 집합의 하위 집합을 식별 하는 제출 contigs 조립 하는 데 사용 됩니다. 병렬 파이프라인에서 RNA는 감염 된 잎은 표준 열 기반 RNA 추출 방법을 사용 하 여 격리 됩니다. 다음 리보솜 고갈 mRNA 및 바이러스 성적 하위 집합에 대 한 풍부 하 게 수행 됩니다. 조립된 시퀀스 RNA 시퀀싱 (RNA-seq)에서 파생 된 바이러스 시퀀스에서이 데이터 집합의 하위 집합을 식별 하기 위해 NCBI BLASTn에 제출 했다. 우리의 연구에서 우리는 두 개의 데이터 집합에서 두 개의 관련된 전체 길이 badnavirus 유전자 발견. 이 메서드는 식물 바이러스 게놈 시퀀스를 다시 구성할 작은 RNA 시퀀스의 집계 인구를 추출 하는 또 다른 일반적인 접근을 선호. 이 후자의 metagenomic 파이프라인 복구 바이러스 관련 시퀀스는 복고풍 속기 요소 식물 게놈으로 삽입 됩니다. 이를 더 적극적으로 전염 성 요원을 분별 생화학 또는 분자 분석을 결합 이다. 이 연구에서 설명 하는 접근 가능성이 표시 활성 바이러스 감염 하는 바이러스 복제의 시퀀스를 복구 합니다.
Introduction
신흥 식 물병 드라이브 올바른 인과 에이전트를 식별 하는 새로운 도구를 개발 하는 연구원. 새로운 또는 되풀이 바이러스 질병의 초기 보고서 모자이크 및 잎 정 맥 지우기, 왜소, 시 들고, 병 변, 괴 사, 기형 같은 일반적으로 발생 증상 또는 다른 증 후를 기반으로 합니다. 질병에 대 한 인과 에이전트 다른 오염 병원 체에서 그것을 분리 하는 새로운 바이러스를 보고 하기 위한 표준 적합 한 호스트에 그것을 전파 하 고 원래 호스트 종의 건강 한 식물으로 접종에 의해 질병을 재현. 이 접근에 한계는 식물 바이러스의 많은 속 곤충 또는 다른 벡터 전송 또는 다시 원래 호스트 종에 적합 한 호스트에 대 한 의존 이다. 이 경우에, 적절 한 벡터에 대 한 검색을 연장 수, 실험실 식민지는 벡터의 설정에 어려움이 있을 수 있습니다 있으며 더 노력 실험적인 전송에 대 한 프로토콜을 고안 하는 데 필요한. 성공적인 실험실 전송 연구에 대 한 조건을 얻을 수 없는 경우 다음 작업 짧은 폭포 표준 보고 새로운 바이러스 질병. 매우 낮은 titers에 그들의 자연적인 호스트에서 발생 하는 바이러스에 대 한 연구자는 연구 수행에 대 한 충분 한 전염 성 주식을 유지 하기 위해 전파에 대 한 대체 호스트를 식별 해야 합니다. 몇 가지 식물을 감염 하는 바이러스 종에 대 한이 주식 문화1성장에 걸림돌이 될 수 있습니다.
최근 몇 년 동안, 과학자는 고용 더 자주 높은 처리량 NGS와 metagenomic 접근 알려진된 질병에 관련이 있을 수 있습니다 하지만 분류학 종과 장군에 할당 될 수 있습니다 환경에 존재 하는 바이러스 시퀀스를 밝히기 2 , 3 , 4. 발견 및 고유한 환경에서 유전 물질의 분류에 같은 접근 자연에서 바이러스 다양성 또는 특정 생태계에서 그들의 존재를 설명 하는 방법을 제공 하지만 반드시 정의 하기 위한 프레임 워크를 확인 하지 않습니다 명백한 질병에 대 한 인과 대리인입니다.
Badnavirus 속 pararetroviruses의 Caulimoviridae 가족에 속한다. 이 바이러스는 약 7 ~ 9 kb의 원형 이중 가닥 DNA 게놈을 가진 모양에 있는 bacilliform. 모든 pararetroviruses RNA 중간을 통해 복제합니다. Pararetroviruses는 episomes로 존재 하 고 복제 식물 염색체 DNA5,6의 독립. 바이러스 인구의 분야 연구는 이러한 바이러스는 유전자 복잡 한 나타냅니다. 또한, 높은 처리량 연속 식물 게놈의 범위에 걸쳐 얻은 정보 위법 통합 이벤트로 식물 게놈으로 삽입 하는 badnavirus 게놈 조각의 수많은 예제를 발견 있다. 이러한 내 생 badnavirus 시퀀스 감염7,,89,,1011와 반드시 연결 되지 않습니다. 그 후, 질병의 인과 대리인으로 새로운 badnaviruses를 식별 하는 NGS의 사용 episomal 게놈의 부분 모집단 다양성 생 시퀀스12,13의 발생에 의해 복잡 합니다.
소설 pararetrovirus 유전자의 발견에 대 한 최적의 파이프라인은, 질병에 대 한 인과 대리인으로 서 이러한 바이러스를 식별 하는 두 가지 일반적인 방법 있습니다. 1 개의 방법은 감염 된 잎에서 작은 RNA 순서에 대 한 풍부 하 고 다음 이러한 시퀀스 바이러스 genome(s)14,15,,1617를 다시 구성할 것입니다. 다른 방법은 회전 원형 증폭 (RCA) 원형 DNA 바이러스 게놈18증폭입니다. RCA의 성공 잎 및 선택한 조직에 바이러스 titer의 나이에 따라 다릅니다. RCA 제품 제한 소화를 받게 되며 직접 시퀀싱19,,2021플라스 미드로 복제.
칸 나 노란색 반점 바이러스 (CaYMV)는 badnavirus 이며, 게놈의만 565 bp 파편 이전 감염된 cannas22분리 되었습니다 비록 칸 나에 노란 반점 질병의 etiological 원인으로 설명. 현대 연구에서 Alpinia purpurata (꽃 생강; CaYMV 식별 CaYMV-Ap)23. 이 연구의 목표는 감염 된 칸 나 백합에서 완전 한 badnavirus 게놈 시퀀스를 복구 했다. 우리 공장에서 오염 물질에서 바이러스를 정화 하 고이 준비에서 바이러스 성 DNA 분리에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 DNA 도서관 NGS에 사용 하기 위해 준비. 이 방법은 중간 분자 증폭 단계에 대 한 필요가 없다. 우리 또한 RNA이 NGS, 대 한 감염 된 식물에서 mRNA를 분리 RNA-seq 포함 실시 했다 각 핵 산 준비를 사용 하 여. 조립된 contigs Badnavirus taxon 도구에 대 한 생물 공학 정보 (NCBI) 기본적인 현지 줄 맞춤 검색 핵 산 (BLASTn)에 대 한 국립 센터를 사용 하 여 두 데이터 집합에 관련 된 발견 되었다. 우리는 2 개의 badnavirus 종24의 유전자 발견.
Protocol
1. 일반 바이러스 정화 코비 외 에 의해 표준 메서드를 사용 하 여 차등 원심 분리 하 여 25 첫째, 병에 걸린 식물에서 잎의 80-100 g를 잘라내어 200 mL가 하는 버퍼를 사용 하 여 4 ° C에서 waring 믹서 기에 갈아 (0.5 M NaH2포4, 0.5 M2나 HPO4 (pH 7.2). 0.5% (w/v) 나2이렇게3). 실험실 외 투 및이 절차의 모든 단계에 대 한 장갑을 착용 하십시오. 그런 다음, 1.0 L 비 커 homogenate (300 mL) 전송. Homogenate 화학 후드 내부에 우 레 아의 18 g와 10% 비 세제 (t-10 월-C6H4-(OCH2CH2)9오) 25 mL를 추가 합니다.참고:이 단계에 대 한 그것은 최고의 안전 고글과 개인 보호에 대 한 간단한 호흡 마스크 착용 하입니다. 짧게 후드에에서 자력으로 약동 하 고는 호 비 커를 커버. 콜드 룸에 덮여 포 비 커를 전송 그리고 4 ° c.에 하룻밤 자력으로 저 어 로 터 병 (250 mL 컨테이너) 및 4 ° c.에서 10 분 동안 4000 x g에서 고정된 각도 터 원심 분리기 원심을 homogenate 전송 화학 증기 두건에서 상쾌한 고 투박한 무명의 4 층을 통해 필터를 복구. 분할 38.5 mL 폴 리 프로필 렌 원심 분리기 튜브 사이 4 ° c.에 40000 x g 2.5 h에 대 한 원심 분리기 homogenate 일반적으로 튜브의 하단에 녹색 펠 릿과 튜브의 길이 따라 하얀 펠 릿의 존재를 확인 합니다. 상쾌한을 부 어와 유지 두 펠 릿; 얼음에 샘플을 놓습니다.참고: 녹색 펠 릿에 엽록체, 전 분, 그리고 다른 세포가 포함 되어 있습니다. 화학 후드에서 working 고무 경찰관 펠 릿을 사용 하 여. 자료 솔루션으로 완벽 하 게 분해를 수 있도록 4 ° C에서 하룻밤 사이 정지 하면서 1-2 시간에 걸쳐 ddH2O의 1 mL에 각로 터 병에 흰색 펠 릿을 resuspend. 정지 g x 6000과 10 분 남은 파편을 제거 하기 위한 4 ° C 원심 136,000 x g virions를 펠 렛을 4 ° C에서 2 h에 집중된 중지 원심 버퍼 (50 mM Tris HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl2)의 1 mL에 산 탄을 resuspend.참고: 옵션 단계 DNAse와 virions를 치료 하는 나 (10 µ g/mL) 비 encapsidated DNA, 즉, 엽록체와 미토 콘 드리 아 DNA 오염 제거를 37 ° C에서 10 분. 그런 다음 비활성화는 DNAse I 1 mm EDTA를 추가 하 여. 15 분 동안 37 ° C에서 2 µ g / µ L 성분 K의 40 µ L로 virions를 중단. 유기 추출에 의해 virion DNA를 복구 하는 화학 후드 안에서 작업 합니다. 잠재적인 심각한 건강 효과 대 한 보호에 대 한 추출 중 얼굴 방패, 장갑, 그리고 실험실 외 투를 착용 합니다. 샘플을 페 놀-클로 프롬-isoamyl 알콜 (49:50:1)의 1 볼륨을 추가 하 고 5 분 16000 x g. 제거 위 수성 단계 및 새로운 튜브에 대 한 실 온에서 20 s. 원심 분리기에 대 한 손으로 흔들어. 이 추출 두 번 이상 반복 합니다. 적절 한 제도적 화학 처리26유리 폐기물 병에서 그것을 배치 하 여 유기 단계를 삭제 합니다. 에탄올 강 수를 사용 하 여 DNA를 집중. 나트륨 아세테이트 (pH 5.2)의 최종 농도 0.3 M를 사용 하 여 및 95% 에탄올의 2.5 볼륨. -20 ° c에서 30-60 분 및 10-20 분 작은 DNA2613000 x g에서 원심 분리기 샘플을 놓습니다. 실험실 벤치에서 working, 0.1 m m 테 버퍼 (pH 8.0)의 1 mL에 DNA 펠 릿 resuspend. Filer 상업 젤 여과 (일반적으로 사용 되는 열의 연쇄 반응 (PCR)에 대 한 청소)를 통해 정지 소금과 NGS 방해 수도 낮은 분자량 재료를 제거 하. 1 %agarose 젤 전기 이동 법은 ethidium 평범한 사람 얼룩이 준비의 품질을 볼 수를 사용 하 여 샘플을 분석 합니다. Nanodrop 분 광 광도 계를 사용 하 여 DNA의 품질을 평가 합니다.참고: 준비 불순물의 “깨끗 한” 고 원하는 품질의 260 λ 및 1.85와 2.0 사이 280 λ에서 샘플의 흡 광도의 비는 일반적으로 나타냅니다. DNA의 질을 분석 (10 5 pg를 사용 하 여 ng) 모 세관 전기 이동 법 악기를 기반으로 칩을 사용 하 여.참고: 품질 출력 깨끗 한 봉우리, 대표 하는 DNA 파편 크기는 x 축 따라 배포를 보여 줍니다. 피크 높이 파편의 풍부를 나타냅니다. 들쭉날쭉한 봉우리는 부분적으로 저하 조각 또는 화학 오염 물질을 나타냅니다. 둥근 곡선 대표 품질을 나타내는 DNA의 얼룩 2. 라이브러리 준비 사용 하 여 DNA 및 유제 기반 클론 증폭 (emPCR 증폭) 참고: 라이브러리는 일반적으로 고객 지향 작업 수행을 NGS 시설에 의해 준비 됩니다. DNA 조각을 변환 분무기를 사용 하 여 DNA (> 200 ng)의 솔루션 전단 매뉴얼의 지침27에 따라 상업 어댑터 선 제조업체의 지침28,,2930에 따라 DNA 샘플의 emPCR 확대를 실시 합니다. 세 번 세척 단계를 반복 하 고 각 세척 후 작은 한 minicentrifuge에 구슬 10 s. 폐기를 위해는 상쾌한 각 세척 후.참고: 프로시저 세척 키트와 함께 제공 된 상업 워시 버퍼에 의해 캡처 구슬의 준비로 시작 합니다. emPCR는 일반적으로 NGS에 대 한 템플릿 증폭에 사용 됩니다. 열 변성 DNA 또는 RNA 95 ° C에서 2 분 한 다음 사용할 준비가 될 때까지 4 ° C. DNA/RNA의 5 백만 캡처 구슬 30 µ L. 마지막 볼륨에 사용 200 백만 분자 DNA/RNA 샘플과 모의 샘플으로 서 핵 산 샘플 다음 단계 수행 함께 모의 샘플 준비. Vortexing 유제 오일 10의 튜브에 의해 유화를 수행 최대 속도로 s 다음 교 반 튜브 플랫폼 균질 화기와 호환 되는 플라스틱으로 전체 콘텐츠 (4 mL)를 붓는 다. 5 분 동안 2000 rpm에서 유제를 혼합 플랫폼에 교 반 튜브를 놓습니다. 8-스트립 캡 튜브 또는 96 잘 접시로 100 µ L aliquots 유제의 분배. 튜브 캡 또는 접시를 봉인 하 고 emPCR 제조 업체의 권장된 프로그램28를 사용 하 여 수행.참고: PCR 완료 된 후 웰 스 유제 그대로 인지 확인 하 고 다음 진행을 확인 합니다. 유제 깨진 경우 전체 우물을 삭제 합니다. 실험실 외 투를 착용 하 고 증폭 된 DNA 구슬 (ADB)를 수집 하는 화학 후드에서 작동. 진공 우물에서 유제를 발음 하 고 50 mL 튜브에 비즈를 수집 합니다. 웰 스 소 프로 파 놀의 100 µ L로 두 번 헹 구 고 린스 같은 50 mL 튜브에 발음. 소용돌이 수집 된 유화 제 및 35 mL의 최종 볼륨을 소 프로 파 놀과 ADB resuspend. 작은 930 x g 5 분 제거에서 ADB는 상쾌한 고 강화 버퍼의 10 mL를 추가 합니다. 소용돌이 ADB와 추가 40 mL 최종 볼륨 원심 분리기에 소 프로 파 놀 삭제는 상쾌한 각 세척 후 세척 단계를 두 번 반복 하 여 다음 세척. 소 프로 파 놀 대신 에탄올을 사용 하 여 최종 세척을 실시 합니다. 추가 버퍼 35 mL 최종 볼륨, 소용돌이, 그리고 펠 릿을 향상 930 x g 5 분에 구슬은 상쾌한 제거 하지만 버퍼를 강화의 2 개 mL를 떠나. Microcentrifuge 튜브에 정지를 전송 하 고 짧게 ADB 펠 렛을 원심. 삭제는 상쾌한, 후 ADB 펠 릿 강화 버퍼의 1 mL로 두 번 씻어. 원심 및 각 세척 후에 상쾌한 삭제. DNA 라이브러리 비드 농축에 대 한 준비, 구슬에 1 N NaOH의 1 mL를 추가 합니다. 소용돌이 ADB와 다음 실 온에서 2 분 동안 품 어. 원심 및 삭제는 상쾌한. 한 번이 세 단계를 반복 합니다. 어 닐 링 버퍼의 다음 소용돌이 ADB의 1 mL을 추가 하 고 실 온에서 2 분 동안 품 어. 짧게 원심 고는 상쾌한 삭제. 어 닐 링 버퍼의 100 µ L를 사용 하 여 다시이 단계를 반복 합니다. DNA에 시퀀싱 뇌관 anneal, Seq 뇌관 A의 15 µ L와 키트에 제공 된 Seq 뇌관 B의 15 µ L를 추가 합니다. 짧게 vortexing에 의해 혼합과 5 분 2 분 동안 얼음에 65 ° C에서 열 블록에 microcentrifuge 튜브를 놓습니다. 어 닐 링 버퍼의 1.0 mL로 세 번 세척. 5 s 및 삭제 때마다 상쾌한 소용돌이. 시퀀싱 하기 전에 상용 구슬 카운터를 사용 하 여 구슬의 수를 측정 합니다. 적어도 500000 농축된 구슬 이어야 한다.참고: 구슬 카운터 제공 된 microcentrifuge 튜브에 비즈를 측정 하는 특별 한 장치입니다. 3. 일반 mRNA 고립과 dsDNA 합성 감염 칸 나 잎 테스트를 사용 하 여 보고 진단 뇌관 CaYMV에 대 한 RT-PCR에 의해 시작 모든 후속 단계에서 실험실 외 투 및 개인 보호를 위해 라텍스 장갑 착용. 실험실 벤치에 일, 잎에서 12 샘플을 수집 하 고 샘플을 액체 질소에 급락. 균질에 대 한 비드 밀을 사용 합니다. 총 식물 RNA 격리에 대 한 표준 열 기반 메서드를 제공 하는 상업 키트를 사용 합니다. 20 지상 샘플을 흔들어 키트에 의해 제공 된 guanidine isothiocyanate 세포의 용 해 버퍼를 추가 s. 에탄올을 추가 하 고 키트 지침에 따라 철저 하 게 혼합. 막에 RNA는 스핀 열에 각 homogenate를 추가 합니다. 세 번 세척 하 고 복구 튜브24에 RNA을 elute. Λ 260 및 280 λ. 확인 RNA 무결성 ethidium 평범한 사람으로 물는 1 %agarose 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 흡 광도의 비율을 측정 하는 분 광 광도 계를 사용 하 여 RNA를 계량.참고: 1.85와 2.0 사이의 흡 광도 비율 원하는 품질의 준비 임을 나타냅니다. 치료 DNase와 RNA 나 (10 µ g/mL) 37 ° c.에서 10 분 RNase 무료 물31에서 RNA를 집중 상업 회전 열을 사용 합니다. 계속 하기 전에 수영장 RNA 샘플입니다. RRNA 제거 키트를 사용 하 여 공장 ribosomal RNA를 제거. Microcentrifuge 관을 두 번 세척 aliquot 자석 구슬 RNase 무료와 물. 소용돌이 관 resuspend, aliquot 마그네틱 스탠드에 튜브를 배치 하 고 액체를 기다립니다. 삭제는 상쾌한 고 자석 구슬 물의 resuspension 솔루션으로 바꿉니다. Resuspend RNase 억제제의 1 µ L을 추가 하는 소용돌이.참고: 이러한 키트 사용 올리고 dT mRNA에 교배는 자성 구슬에 바인딩된. 방법은 성적24복구 표준 자석 구슬 분리 기술을 사용 합니다. 1.25 µ g의 RNA에 결합 500 ng RNase 무료 물, 그리고 반응 버퍼 키트에 의해 제공. 50 ° c.에서 10 분을 위한 혼합물을 배치 열에서 제거 하 고 씻어 자석 구슬 RNAse 무료 물에 추가. 짧게 소용돌이 그리고 5 분 동안 실내 온도에 설정. 마그네틱 스탠드에 놓고 취소 액체를 기다립니다. 신선한 microcentrifuge 튜브는 상쾌한 전송. 얼음에 설정 합니다. 캡처 솔루션 기반 메서드를 사용 하 여 exosomes 및 200의 농축 cDNA 라이브러리를 준비 하는 RNA의 ng.참고: 이중 가닥 cDNA 라이브러리는 일반적으로 고객 지향 작업 수행을 NGS 시설에 의해 준비 됩니다. 조각화는 상업적인 RNA 조각 솔루션 (0.136 g ZnCl2 , 100 mM Tris HCl pH 7.0)를 사용 하 여 RNA. RNA의 18 µ L를 솔루션의 2 µ L를 추가 (200 ng 총). 회전 튜브는 microcentrifuge에서 짧게, 30 s 및 얼음에 70 ° C에서 샘플을 배치. 0.5 M EDTA 10 mM Tris HCl pH 7.5의 pH 8.0과 28 µ L의 2 µ L를 사용 하 여 반응을 중지 합니다. 10 분 사용 하 여 비즈를 수집 하는 상쾌한 버리고 자기 집중 장치에 대 한 실내 온도에서 혼합 하 여 자성 구슬에 RNA를 바인딩하십시오. 구슬 200 µ L의 70% 에탄올으로 세 번 세척. 삭제 각 세척 하 고 건조 한 공기 다음 3 분에 대 한 실 온에서 수송과 비즈 10 mM Tris HCl pH 7.5의 19 µ L에서 Resuspend. 10 분 동안 70 ° C에 난방에 의해 조각난된 RNA에 임의의 뇌관 anneal 고 2 분 준비 첫 번째 가닥 및 표준 상업 cDNA 합성 키트를 사용 하 여 두 번째 가닥 cDNA 얼음에 튜브를 장소. 마그네틱 비드 집중 장치를 사용 하 여 이중 가닥 cDNA를 정화. 70% 에탄올의 800 µ L 세 번 씻어. 삭제 각 세척 하 고 건조 한 공기 3 분에 대 한 실 온에서 펠 릿 10 mM Tris HCl pH 7.5의 16 µ L에서 Resuspend. 마그네틱 비드 집중 장치를 사용 하 여 솔루션에서 더블-좌초 된 cDNA에서 구슬 분리. 새로운 200 µ L PCR 튜브에 pipetting 여는 cDNA를 제거 합니다. Taq 중 합 효소 및 상업 도서관 준비 키트에서 제공 하는 deoxyribonucleotides의 혼합물을 사용 하 여 조각 끝 수리를 실시 합니다. 상업적인 키트는 25 ° C에서 10 분 동안 상업 리가 사용 하 여 이중 가닥 cDNA의 각 끝에 추가 하려면 미리 희석된 어댑터를 제공 합니다. 4. DNA 도서관 원유 바이러스 준비 및 dsDNA mRNA에서 준비 하는 도서관에서 준비의 NGS 표준 높은 처리량 pyrosequencing 악기를 사용 하 고 DNA 시퀀스의 직접 정보를 생성 하기 위해 모든 권장된 제조 업체 프로토콜을 따릅니다. 붙일 레이블된 뉴클레오티드를 포함 하 여 상업 시퀀싱 시 약을 사용 합니다.참고: 자세한 내용은 악기와 함께 제공 된 제조업체의 지침을 참조. 자동으로 조립 생산 < 700 bp.의 평균 길이 contigs의 첫 번째 집합에 게놈 어셈블리 소프트웨어를 사용 하 여 포스트 시퀀싱 분석 수행 품질 관리를 수행 하는 iPlant/CyVerse 웹사이트에 FastQC 소프트웨어를 사용 하 여 원시 시퀀스 데이터32에 확인 합니다. 매핑 및 amplicon 소프트웨어를 사용 하 여 작은 순서 읽기24 에서 더 이상 순서를 재구성 하 계속 Phred 점수 ≥ 30 시퀀스를 선택 합니다.참고:에 대 한 자세한 내용은 참조 제조 업체의 지시. 이러한 조립된 contigs NCBI BLASTn 분석 MEGABLAST 기본 모듈 뿐만 아니라 Viridplantae를 사용 하 여 제출 (TaxID: 33090)과 바이러스 (TaxID: 10239)33의 이름을 제한 하는 organismal로. 보고서에 보고 된 Badnavirus 유전자를 높은 유사성을 보여 주는 contigs의 부분 모집단을 수집 합니다. 하나 이상의 후보 전장 바이러스 게놈을 나타내는 조인 된 건설 기계 올바르게 표준 badnavirus 게놈와 동일한 조직에 있는 프레임에 시퀀스 생성 확인 합니다. 이렇게 하려면 그리기 소프트웨어를 플라스 미드에 후보 전체 길이 바이러스 게놈을 입력 합니다. 그런 다음 처음 15 뉴클레오티드는 tRNA만난 (TGGTATCAGAGCGAG)이 높은 badnaviruses 중 보존을 구성 확인 합니다. 끝부분 3′ 게놈의 잠재적인 polyadenylation 신호를 찾습니다. 주석을 두 작은 ORFs는 polyprotein 인코딩 한 큰 ORF의 존재를 식별 하기 위해 완전 한 게놈. 다음 사용 하 여 ExPASy 포털 번역 badnavirus ORF1, ORF2, 및 ORF3 번역 제품34를 식별 하는 도구.참고:이 과학 소프트웨어는 무료 및 것 이다 원형 DNA를 생성, 식별 모든 열려있는 독서 프레임, 고 시퀀스 전체 길이 원형 DNA 게놈 나타내는 확인 즉시 출력을 제공 한다. 여러 시퀀스 비교 도구, 근육 및 CLUSTALW, DNA와 RNA 분석35,36에서 얻은 바이러스 게놈을 비교 오픈 소스를 사용 합니다. 30 badnavirus 종의 전체 게놈 시퀀스를.fasta 형식에서 문서로 NCBI 뉴클레오티드 데이터베이스를 검색 합니다. NGS 여 바이러스 게놈 시퀀스와 시퀀스의 진화 유전자 분석 소프트웨어를 시퀀스를 업로드. 여러 시퀀스 정렬 및 근육37을 사용 하 여 최대 가능성 트리를 생성 합니다. 5. 감염 된 식물에서 바이러스 게놈의 PCR 증폭에 의해 드 노 보 시퀀싱의 품질 평가 PCR 뇌관38파생 무료 온라인 Primer3 도구에 새로 확인된 된 전체 길이 badnavirus 게놈 시퀀스 (.fasta 형식)을 입력 합니다. 바이러스 genome(s)의 전체 길이 따라 1000-1500 bp의 정열된 제품을 생산할 예정 이다 뇌관 세트를 식별 합니다. 합성 하 고 PCR 뇌관을 제공 하는 서비스 시설을 시퀀스를 보냅니다.참고: 출력 일반적인 고 녹는 온도와 도입된 시퀀스에 따라 정확한 뇌관 위치 허용 뇌관 쌍을 식별합니다. 실험실 벤치에서 작업 하 고 실험실 코트와 장갑, 표준 상자성 셀 루 로스 식물 소재39 에서 DNA를 분리 입자를 포함 하는 자동화 된 방법을 사용 하 여 바이러스에 감염 된 하 고 건강 한 제어 잎에서 DNA의 5 µ g를 격리 합니다. Microcentrifuge 튜브에 액체 질소에 잎 소재 (20-40mg)를 어 십시오 그리고 비드 밀을 사용 하 여 갈아. Microcentrifuge 튜브에 세포의 용 해 버퍼와 샘플을 결합 하 고 각 샘플에 RNase A를 추가. 소용돌이 샘플 10-20 s 그리고 짧게 스핀 고체 입자를 제거 하는 예제.참고: 상자성 룰 입자 높은 DNA 묶는 능력 있고 순수한 DNA의 높은 수익률을 분리. DNA 분리에 대 한 표준 상용 실리 카 열 방법은 효율적으로 다양 한 식물 종에서에서 DNA를 추출 하지 않습니다. 따라서, 방법의 수십 존재 개별 식물 종에 대 한 효율을 개선 하기 위해 이러한 절차의 수정. 자동화 된 상자성 룰 입자 방법 이상의 25 초본 angiosperm 종40에서 점점 더 높은 품질 DNA를 생성 하기 때문에 선택 되었다. 상업적인 시 약 카트리지를 사용 하 여 자동화 된 상자성 DNA 분리. 각 상업 시 카트리지 전송 공장 같은 카트리지에 lysate nuclease 무료 물 300 µ L를 추가 합니다. 카트리지를 카트리지 랙 에서도, 차입 튜브에 가까운 우물에서 플런저 장소 고 차입 버퍼 차입 관 합니다. 자동된 핵 산 격리 기계에 카트리지를 로드 하 고 식물 DNA 격리 프로토콜41,42를 실행 합니다. PCR 파생 겹치는 PCR 제품의 집합을 수행 합니다. 각 정방향 및 역방향 뇌관의 5 µ M를 사용 하 여 PCR 증폭의 35 주기를. 다음 자전거 조건 사용: 95 ° C 60 s, 7-10 분 prepackaged 젤 여과 열 제거를 사용 하 여 소금에 대 한 45 s, 및 72 ° C에서 최종 확장으로 1-2 분 동안 72 ° C에서 확장 하는 50 ° C에서 어 닐 링 및로 저 분자 무게 물자에서 변성 1.231단계. 벡터 50 선 PCR 제품의 크기를 결정 하는 PCR 제품의 어 금 니 비율을 3: 1의 선형화 pGEM 플라스 미드43ng. ligations가 효율적으로 작동 여부를 확인 하기 위해 DNA를 삽입 하는 컨트롤을 사용 합니다. 4 ° c.에 하룻밤 T4 DNA 리가 (3 U / µ L)를 사용 하 여 결 찰을 수행 다음 변환 상업적으로 준비 JM109 유능한 대장균 세포. 사용 효율 변화에 대 한 긍정적인 컨트롤로 포경된 플라스 미드 DNA의 100 페이지를 제어 합니다. 합자 플라스 미드26복구 항생제와 블루/화이트 선택과 파운드-한 천 배지 위에 변형 된 세포의 100 µ L 플레이트. 37 ° c.에서 16-24 h에 대 한 번호판을 품 어참고: pGEM 벡터에 β-galactosidase 인코딩하는 lacZ 유전자는. 접시에 성장 하는 변형 된 박테리아 100 µ g/mL 암 피 실린, 0.5 m m IPTG, 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactopyranosidase 80 µ g/mL를 포함 된 (X-gal) 바뀝니다 블루 β-galactosidase 활동 때문에. PGEM 플라스 미드는 lacZ 유전자를 방해 하는 방식으로 오는지. 식민지 PCR 제품 삽입을 포함 하는 lacZ 유전자 고 X-여자를 대사 하지 않습니다 됩니다. 이 식민지는 흰색입니다. 따라서 삽입 된 식민지 식민지 (블루와 화이트)26의 색으로 삽입 없이 그 분화 될 수 있다. 표준 열 기반 플라스 미드 분리 키트39를 사용 하 여 3 개의 식민지에서 DNA를 분리. 시퀀스 변환 제품의 3 개의 플라스 미드. 각 DNA 시퀀스를 비교 하 여 제작한 NGS 드 노 보 조립 바이러스 유전자와 함께. CLUSTALW를 사용 하 여 시퀀스를 정렬 하 고 그들은 적절 하 게 정렬 되도록.
Representative Results
이 수정된 바이러스 정화 방법 바이러스 DNAs NGS와 생물 정보학 두 바이러스 종 식별 하는 데 유용의 농축을 제공 합니다. 후에 homogenate에서 40000 x g 2.5 h에 대 한 centrifuged는, 튜브의 하단에 녹색 펠 릿과 길이 따라 흰색 펠 릿 있었습니다. 녹색 펠 릿은 한 microcentrifuge 튜브에 resuspended 그리고 화이트 펠 릿 두 microcentrifuge 튜브 resuspended 했다. PCR 표준 CaYMV PCR 진단 뇌관을 사용 하 여 실행 되었다 고 제품 solubilized 화이트 펠 릿과 하지 녹색 펠 릿 (그림 1A)에서 발견 되었습니다. 원유 준비의 샘플 전송 전자 현미경에 의해 조사 되었다 하 고 우리가 124-133 nm 길이 (그림 1B)를 측정 하는 bacilliform 입자를 관찰. 이것은 대부분 badnaviruses의 예측된 모달 길이 이내 이다. DNA는 흰색과 녹색 알갱이에서 추출 하 고 별도로 resuspended. 그림 1C, 우리는 녹색에서 추출한 DNA의 5 µ L 로드 고 흰색 펠 렛 샘플 (녹색 부분에 대 한 DNA의 1.6 µ g)와 흰 부분을 위해 DNA의 3.1 µ g 0.8 %agarose 젤 전기 이동 법 ethidium 평범한 사람을 다음 DNA를 분석 얼룩. 녹색 부분 흰색 분수 높은 분자량 DNA, DNA (그림 1C) 낮은 분자량의 두 밴드를 생산 하는 반면 낮은 분자량 DNA를 포함. 그림 1C 에 젤 100 V에서 40 분 동안 실행 하 고 레인 3에 얼룩 젤 전압 명확 하 게 밴드를 생산 하기 위해 인하 해야 제안 합니다. 이러한 데이터 제안 화이트 펠 릿 virions에 대 한 풍부한 했다. 흰색 샘플에서 추출 된 DNA (0.6 µ g/mL) 농도, 했지만 NGS, 10의 최소 필요에 대 한 적절 한 진행에 DNA의 ng. 조각난된 DNAs는 NGS에 대 한 라이브러리를 준비 하 사용 되었다. 동시에, RNA 높은 처리량 RNA-이 대 한 감염된 칸 나 식물 (그림 1D)에서 추출 된 표준 워크플로 라이브러리 준비, NGS, contigs, 만들고 확인 하는 바이러스 성 게놈 시퀀스 (그림 1E)를 위해 수행 되었다. 재료를 시작으로 DNA와 RNA를 사용 하 여 출력 결과 비교 했다. 우리는 원유 바이러스 준비에서 고립 된 DNA를 사용 하 여 188,626 원시 DNA 읽기를 NGS 여 얻었다. 읽기 13,269 contigs로 조립 및 BLASTn 뉴클레오티드 시퀀스의 NCBI 데이터 집합을 검색 하는 데 사용 되었다 (Viridplantae TaxID를 사용 하 여: 33090 및 바이러스 TaxID: 제한 기체로 10239) (그림 1E). NCBI BLASTn 결과 계시는 데 노 보 조립 contigs의 93% 셀룰러 시퀀스, 22%, 아니었다 고 0.3% 바이러스 contigs (그림 2A). Contigs 셀룰러 시퀀스도 미토 콘 드리 아 발견 했다로 분류 또는 엽록체 DNA의 대부분. 바이러스 contigs dataset에서 바이러스 contigs의 32% (되지 않은 Badnavirus 시퀀스) Caulimoviridae 의 회원 관련 있었다와 이들 중 58% 관련이 있었다 Badnavirus. 바이러스 contigs의 29% 매우 비슷한 (e < 1 x 10-30) CaYMV 격리 V17 ORF3 유전자 (EF189148.1), 사탕수수 bacilliform 바이러스 Batavia D, 완전 한 게놈 (FJ439817.1), 격리 되었고 바나나 행진 CA 바이러스 게놈 (완료 KJ013511)입니다. 이 인구 내에서 두 개의 전체 길이 genomes 닮은 긴 contigs가 있었습니다. 높은 처리량 RNA-seq 생산 153,488 청소 개별 시퀀스 읽기 읽기 < 500 bp. Contig 어셈블리의 길이 평균 8,243 contigs이 감소. 이러한 NCBI BLASTn에 제출 했다 (TaxID Viridplantae를 사용 하 여: 33090 및 바이러스 TaxID: 제한 기체로 10239) 출력 식물 세포 시퀀스, 23%의 범주에는 contigs의 76%를 배치 했다, 그리고 0.1% 바이러스 contigs (로 분류 했다 그림 2 B). 가까이 시험 바이러스 contigs 인구의 0.1%의 인구의 68% Caulimoviridae (그림 2B)에 할당 된 결정. 이 인구 내의 3 개의 큰 contigs 높은 유사성을 발견 했다 (10-30X e < 1) CaYMV 격리 V17 ORF3 유전자 (EF189148.1), 사탕수수 bacilliform 바이러스 분리 Batavia D, 완전 한 게놈 (FJ439817.1)와 바나나 행진 CA 바이러스 완전 한 게놈 (KJ013511). 우리가 수동으로 전체 길이 바이러스 게놈을 생산 하기 위해 이러한 두 합류 3 contigs 검사. 우리는 두 개의 전체 길이 바이러스 게놈의 존재를 확인 상호 발판으로 DNA와 RNA 시퀀싱 제작한 바이러스 게놈 길이 contigs 비교. 6,966의 1 개의 전체 길이 바이러스 게놈 bp 가칭 칸 나 노란색 반점 관련 바이러스 1 (CaYMAV-1) (그림 3A) 지명 되었다. 두 번째 게놈 이었다 7,385 bp와 CaYMV Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01) (그림 3A) 감염의 변종. 마지막으로, 각 바이러스의 복제 ~ 1000 bp 파편 설계 되었다 PCR 뇌관 차동 9 상업 종류를 나타내는 227 칸 나 식물의 인구에 있는 두 유전자를 감지 사용 되었다. 많은 경우에 개별 공장 두 바이러스에 감염 되었습니다. 12 식물에서 CaYMAV-1 및 CaYMV Ap01 RT-PCR 탐지의 예를 제공합니다. 3 다음 긍정적인 CaYMV Ap01 대해서만 되었고 9 두 바이러스 (그림 3B)에 대 한 긍정적인 했다. 그림 1 : 바이러스 핵 산 준비 및 NGS 워크플로. (1.0%) (A) Agarose 젤 전기 이동 법 CaYMV 유전자의 565 bp PCR 파편의. 두 개의 PCR 제품 녹색 펠 렛 샘플 (3 차선)에 흰색 펠 릿 (차선 1, 2)에서 준비 하는 샘플만 발견 했다. 긍정적인 컨트롤 (+)은 감염 된 공장 표준 상자성 셀 입자를 포함 하는 자동화 된 방법을 사용 하 여 격리 된 DNA에서에서 증폭 PCR 제품을 나타냅니다. 레인 L 샘플 레인에 선형 DNA 밴드의 크기를 측정 하기 위한 표준으로 사용 하는 DNA 사다리를 포함 합니다. 감염 된 칸 나 잎의 원유 분류 되는 백색 펠 릿에 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 전망 하는 바이러스 입자의 (B) 예. (C) Agarose (0.8%) 녹색 (1 레인)에서 복구 된 DNA의 전기 영동 젤과 화이트 (2 레인) 패널 A. PCR에 의해 시험 된 긍정적인 그 펠 릿 레인 2 옆 빨간색과 노란색 점 두 높은 분자량 DNA 밴드 흰색 부분에서 발생 하는 식별 합니다. (D) Agarose (1%) 되는 RNA 정화 열 기반 총 RNA의 전기 이동 법 젤. 레인 L 샘플 레인에 선형 밴드의 크기를 측정 하기 위한 표준으로 사용 하는 DNA 사다리를 포함 합니다. 레인 1-6 ribo-고갈 및 핵 산 격리, 도서관 준비, 시퀀싱, contig 어셈블리 및 바이러스 게놈 RNA-이 (E) 도식 파이프라인에 대 한 단일 샘플에는 풀링된 했다 감염 된 칸 나 잎에서 분리 된 RNA를 포함 발견입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 2 : 크로나 차트 시각화 contigs의 분류학 종류. (A) 풍요로 움과 contigs의 분류학 배포 원유 바이러스 준비에서 조립 왼쪽된 쇼에 차트. 오른쪽 차트 Caulimoviridae 가족, Badnavirus 속, 및 3 개의 밀접 한 관련이 종와 관련 된 바이러스 contigs의 비율을 보여 줍니다. (B) 왼쪽에 있는 패널 contigs RNA-seq에서 파생 된의 풍부한 그들의 분류학 분포에 따라 보여 줍니다. 오른쪽에 Caulimoviridae 가족, Badnavirus 속, 및 3 개의 밀접 한 관련이 종와 관련 된 바이러스 contigs의 인구 내의 contigs의 풍요를 묘사 하는 그래프입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 3 . CaYMAV-1 및 CaYMV Ap01 유전자의 특성. (A) 도표 표현의 칸 나 노란색 반점 연결 바이러스 1 (CaYMAV) 및 칸 나 노란색 반점 바이러스 게놈에서 절연 비슷한 Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01). 뉴클레오티드 위치 1-10 게놈의 시작으로 식별 되 고 tRNA만난 anticodon 사이트가 대부분 badnavirus 유전자의 전형. 열려있는 독서 프레임 (ORF) 1과 2의 번역에 대 한 중지 및 시작 위치는 인접 한. 이 단백질에는 알 수 없는 함수. ORF3 아연 손가락 (ZnF), 프로 테아 제 (프로), 역전사 (RT), RNAse H 도메인을 포함 하는 polyprotein입니다. 3′ 많은 신호 순서는 두 바이러스 게놈에 대 한 보존입니다. (B) RT-PCR 분석 RNA 바이러스에 감염 된 잎 및 CaYMAV 및 CaYMV Ap01 검출 뇌관에서 격리를 사용 하 여 실시 되었다. 12 식물의 동일한 인구, 3 감염 되었습니다 CaYMV Ap01만, 반면 CaYMAV와 CaYMV Ap01 감염 된 나머지. (+) 나타냅니다 긍정적인 제어 (-) 부정적인 제어를 나타냅니다. 이 수치는 Wijayasekara 그 외 여러분 에서 재현/수정 24 동의입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
최근 몇 년 동안에서 다양 한 방법 바이러스 유사 입자 (VLP) 또는 바이러스 특정 RNA 또는 DNA2,3,44, 풍부 하 게 포함 하는 자연 환경에서 식물 바이러스 생물 다양성 연구에 고용 되어 45,46 . 이러한 메서드는 NGS와 bioinformatic 분석 뒤. 이 연구의 목표는 재배 식물에 일반적인 질병의 인과 대리인을 찾을 했다. 질병은 비 싸여 bacilliform 입자는 565 bp 조각만 복제47는 되었습니다 알 수 없는 바이러스의 결과 보고. 이 정보는 이전 연구자 가정해 가족 내에서 Caulimoviridae Badnavirus 속에 바이러스를 할당에 대 한 충분 한 했다. 이전 보고서는 칸 나 백합에 칸 나 순 질병은이 연구에서 제시 된 metagenomics 접근을 사용 하 여 단일 badnavirus의 결과 가설 하는 동안 우리는 질병 두 미정 badnavirus 종24기인 했다 결정. 따라서, 질병의 인과 대리인을 발견 하는 metagenome 접근을 사용 하 여의 힘은 우리가 지금 상황을 식별할 수 있는 하나 이상의 원인이 있을 수 있습니다.
DNA와 RNA 시퀀싱 데이터를 결합 하는 우리의 접근 철저 한 이며 또한 결과 두 가지 방법을 사용 하 여 일관 된 결과 굴복 하 고 두 개의 관련된 바이러스의 존재를 확인을 보여 줍니다. 우리 caulimoviruses의 격리에 대 한 수정된 절차를 고용 하 고는 관련 바이러스 핵 산에 대 한 풍부한 했다 고 그 바이러스 capsid 내에서 보호 된 샘플 제작. 서비스 실험실 DNA 시퀀싱을 수행 하기로 계약 했다. 드 노 보 시퀀싱에 대 한 필수 개념은 DNA 중 합 효소는 DNA 합성의 순차적 주기 동안 서식 파일 DNA 가닥으로 뉴클레오티드를 표시 하는 형광 통합 이다. contigs 조립 뒤 NGS에 의해 생산 바이러스 contigs로 확인 된 몇 가지 contigs bioinformatic로 제출 했다. 두 바이러스 게놈10,24,,4849,50 의 추가 확인 RNA-seq 데이터 ribo 고갈 RNA 준비에서 얻은 bioinformatic 분석을 통해 얻은 것입니다. 흥미로운 결과 시퀀스의 인구 DNA와 RNA 시퀀싱 되 배워야 하나 비 바이러스 및 바이러스 핵 산의 유사한 배급 제공. DNA와 RNA 시퀀싱에 대 한 시퀀스의 < 0.5% 바이러스 기원 했다. 내 바이러스 Caulimoviridae가족에 속한 시퀀스 78-82%의 인구. DNA와 RNA 시퀀싱에서 조립된 바이러스 contigs 비교 하 여 우리는 두 개의 조립된 게놈 두 데이터 집합에서 발생 한 확인 했다.
유일한 DNA 시퀀싱을 사용 하 여 새로운 바이러스 유전자를 식별 하는 관심사 badnavirus 게놈 오픈 원형 DNA 이다. 우리는 게놈에 있는 불연속을 중첩 시퀀스 contigs에서 게놈 어셈블리에 대 한 장애물을 제시 수 있습니다 추측. DNA 시퀀싱 결과의 초기 시험 두 유사한 바이러스 게놈을 공개 했다. 우리는 이러한 게놈 중 하나는 공부 하지 않은, 종의 유전적 다양성 대표 가설 또는 공동 감염 같은 대표 두 종 공장24. 따라서, 집단 bioinformatic 분석 NGS DNA와 RNA 시퀀싱 하 여 가져온 데이터 집합의 두 개의 전체 길이 genomes의 존재의 확인을 사용할 수 있습니다.
Metagenomic 연구, 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV;는 caulimovirus)3에서 DNA를 복구 하는 절차에 따라 식물 homogenates에서 VLP 및 핵 산을 추출 하기 위한 다른 방법을 개발 하는 다른 보고서가입니다. 이 방법은 식별 소설 RNA 및 DNA 바이러스 시퀀스 비 재배 식물. 재배 식물의 질병의 인과 대리인 발견이 연구에 사용 된 caulimovirus 격리 절차에서 파생 된 단계 VLP을 추출 하는 자연적으로 감염 된 식물24에서 파생 된 단계와는 달리 있습니다. 두 수정된 방법의 성공 caulimovirus 격리에 대 한 프레임 워크 절차 일반적으로 식물 바이러스의 metagenomic 연구에 대 한 귀중 한 시작 지점을 있을 수 있습니다 제안 합니다.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
연구는 과학의 발전 및 기술 적용 연구 프로그램 단계 II 아칸소 132-053-2; 오클라호마 센터에 의해 투자 되었다 그리고 농업 특수 작물의 오클라호마 부에 의해 연구 교부 금 프로그램. 우리 감사 황 홍 진 오 생물 정보학 핵심 시설 NSF (EOS-0132534)와 NIH (2P20RR016478-04, 1P20RR16478-02 5P20RR15564-03)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich St. Louis MO | S5976 | Grinding buffer for virus purification |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | Grinding buffer for virus purification |
| Na2SO3 | Thermo-Fisher Waltham, MA | 28790 | Grinding buffer for virus purification |
| urea | Thermo-Fisher | PB169-212 | Homogenate extraction |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | Homogenate extraction |
| Cheesecloth | VWR Radnor, PA | 21910-107 | Filter homogenate |
| Tris | Thermo-Fisher | BP152-5 | Pellet resuspension& DNA resuspension buffers |
| MgCl2 | Spectrum, Gardena, CA | M1035 | Pellet resuspension buffer |
| EDTA | Spectrum | E1045 | Stops enzyme reactions |
| Proteinase K | Thermo-Fisher | 25530 | DNA resuspension buffer |
| phenol:chloroform:isoamylalcohol | Sigma-Aldrich | P2069 | Dissolve virion proteins |
| DNAse I | Promega | M6101 | Degrade cellular DNA from extracts |
| 95% ethanol | Sigma-Aldrich | 6B-100 | Virus DNA precipitation |
| Laboratory blender | VWR | 58984-030 | Grind leaf samples |
| Floor model ultracentrifuge &Ti70 rotor | Beckman Coulter, Irving TX | A94471 | Separation of cellular extracts |
| Floor model centrifuge and JA-14 rotor | Beckman Coulter | 369001 | Separation of cellular extracts |
| Magnetic stir plate | VWR | 75876-022 | Mixing urea into samples overnight |
| Rubber policeman | VWR | 470104-462 | Dissolve virus pellet |
| 2100 bioanalyzer Instrument | Agilent Genomics, Santa Clare, CA | G2939BA | Sensitive detection of DNA and RNA quality and quantity |
| 2100 Bioanalyzer RNA-Picochip | 5067-1513 | Microfluidics chip used to move, stain and measure RNA quality in a 2100 Bioanalyzer | |
| 2100 Bioanalyzer DNA-High Sensitive chip | 5067-4626 | Microfluidics chip used to move, stain and measure DNA quality in a 2100 Bioanalyzer | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000 | Analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures |
| Plant total RNA isolation kit | Sigma-Aldrich | STRN50-1KT | Isolate RNA for RNA-seq |
| RNase-free water | VWR | 10128-514 | Resuspension of DNA and RNA for NGS |
| RNA concentrator spin column | Zymo Research, Irvine, CA | R1013 | Prepare RNA for RNA-seq |
| rRNA removal kit | Illumina, San Diego, CA | MRZPL116 | Prepare RNA for RNA-seq |
| DynaMag-2 Magnet | ThermoFisher | 12321D | Prepare RNA for RNA-seq |
| RNA enrichment system | Roche | 7277300001 | Prepare RNA for RNA-seq |
| Agarose | Thermo-Fisher | 16500100 | Gel analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures |
| Ethidium bromide | Thermo-Fisher | 15585011 | Agarose gel staining |
| pGEM-T +JM109 competent cells | Promega, Madison, WI | A3610 | Clone genome fragments |
| pFU Taq polymerase | Promega | M7741 | PCR amplify virus genome |
| dNTPs | Promega | U1511 | PCR amplify virus genome |
| PCR oligonucleotides | IDT, Coralvill, IA | Custom order | PCR amplify virus genome |
| Miniprep DNA purification kit | Promega | A1330 | Plasmid DNA purification prior to sequencing |
| PCR clean-up kit | Promega | A9281 | Prepare PCR products for cloning |
| pDRAW32 software | ACAClone | Computer analysis of circular DNA and motifs | |
| MEGA6.0 software | MEGA | Molecular evolutionary genetics analysis | |
| Primer 3.0 | Simgene.com | ||
| Quant-iT™ RiboGreen™ RNA Assay Kit | Thermo-Fisher | R11490 | Fluorometric determination of RNA quantity |
| GS Junior™ pyrosequencing System | Roche | 5526337001 | Sequencing platform |
| GS Junior Titanium EmPCR Kit (Lib-A) | Roche | 5996520001 | Reagents for emulsion PCR |
| GS Jr EmPCR Bead Recovery Reagents | Roche | 5996490001 | Reagents for emulsion PCR |
| GS Junior EmPCR Reagents (Lib-A) | Roche | 5996538001 | Reagents for emulsion PCR |
| GS Jr EmPCR Oil & Breaking Kit | Roche | 5996511001 | Reagents for emulsion PCR |
| GS Jr Titanium Sequenicing kit* | Roche | 5996554001 | Includes sequencing reagents, enzymes, buffers, and packing beads |
| GS Jr. Titanium Picotiter Plate Kit | Roche | 5996619001 | Sequencing plate with associated reagents and gaskets |
| IKA Turrax mixer | 3646000 | Special mixer used with Turrax Tubes | |
| IKA Turrax Tube (specialized mixer) | 20003213 | Specialized mixing tubes with internal rotor for creating emulsions | |
| GS Nebulizers Kit | Roche | 5160570001 | Nucleic acid size fractionator for use during library preparations |
| GS Junior emPCR Bead Counter | Roche | 05 996 635 001 | Library bead counter |
| GS Junior Bead Deposition Device | Roche | 05 996 473 001 | Holder for Picotiter plate during centrifugation |
| Counterweight & Adaptor for the Bead Deposition Devices | Roche | 05 889 103 001 | Used to balance deposition device with picotiter plate centrifugation |
| GS Junior Software | Roche | 05 996 643 001 | Software suite for controlling the instrument, collecting and analyzing data |
| GS Junior Sequencer Control v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) | |
| GS Run Processor v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) | |
| GS De Novo Assembler v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) | |
| GS Reference Mapper v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) | |
| GS Amplicon Variant Analyzer v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) |
References
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Citer Cet Article
Verchot, J., Thapa, A., Wijayasekara, D., Hoyt, P. R. Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes. J. Vis. Exp. (137), e57855, doi:10.3791/57855 (2018).