JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Environnement

Deniz bir Model - olarak Barnacle Balanus improvisus kültür ve gen ekspresyonu

Published: August 08, 2018
doi:
10.3791/57825
, , , , ,
1Department of Marine Sciences,University of Gothenburg, 2Department of Chemistry and Molecular Biology,University of Gothenburg, 3IVL Swedish Environmental Research Institute

Summary

Balanus (Amphibalanus) improvisus barnacle ozmoregülasyon ve zehirli çalışmak için bir modeldir. Ancak, doğal mevsimlik yumurtlama cyprid larva öngörülemeyen bir kaynağı verir. Burada, larva üretimi dahil olmak üzere tüm yıl yuvarlak B. improvisus kültür için bir protokol anlatılan. Gen ifade çalışmalarda kültürlü kıskaç kullanımı gösterilmiştir.

Abstract

Kıskaç sesil bir yetişkin ile deniz kabukluları vardır ve free-swimming, planktonik larvaları. Barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus onun aşırı hoşgörü için düşük tuzluluk nedeniyle özellikle osmoregulatory mekanizmaları çalışmaları için bir model olarak uygundur. Ayrıca yaygın biyoloji, özellikle zehirli araştırma ile ilgili olarak yerleşme bir model olarak kullanılır. Ancak, doğal mevsimlik yumurtlama cyprid larva araştırmaları öngörülemeyen bir kaynağı verir. Bir iletişim kuralı tüm yıl yuvarlak B. improvisus kültür geliştirilmiştir ve tüm ayrıntılı bir açıklamasını üretim hattında adımları için özetlenen (yani, Yetişkin kültürleri paneller, koleksiyon ve yetiştirme kurulması Barnacle larva ve yetişkin ve larva yem yönetimi). Açıklama aynı zamanda sorun giderme üzerinde rehberlik sağlar ve kritik parametreleri (Örneğin, kontaminasyon kaldırılması, yüksek kaliteli yem üretimi, gerekli insan gücü ve yüksek kaliteli deniz suyu önemi) anlatılmaktadır. Kodlamayla sisteminden her toplu iş sonuna kadar yaklaşık 12.000 nauplii verimleri ve dört toplu işlemleri haftada neredeyse 50.000 larva kadar üretilen bu yüzden bir haftada teslim edebilirsiniz. Kültür B. improvisus kullanılan yöntem budur, muhtemelen, büyük ölçüde diğer deniz omurgasızlar ücretsiz-swimminglarvae ile de uygulanabilir. İletişim kuralları çeşitli dokularda diseksiyon için yetişkin yanı sıra yüksek kaliteli RNA gen ekspresyonu araştırmalar üretimini sunulmaktadır. Ayrıca açıklanan ne kadar kültürlü yetişkin ve yetiştirilen cyprids gen ekspresyonu dış faktörler ile ilgili olarak incelenmesi için Deneysel tasarımlar geniş bir dizi yararlı olabilir. Gen ifadesinde kültürlü kıskaç kullanımı mümkün osmoregulatory rolleri na+çalışmaları ile resimli /K+ ATPaz ve aquaporins.

Introduction

Kıskaç sesil bir yetişkin ile deniz kabukluları vardır ve free-swimming, planktonik larvaları. Kıskaç 1200 türlerin çoğu sığ suda yaşayan ve çoğu kez düşük tuzluluk maruz kalır. Charles Darwin bu tür küçük bir dere içinde Haliç üzerinden Rio de la Plata Uruguay1açıklanan ve bir türün, defne barnacle (B. improvisus), Balanus (Amphibalanus) improvises neredeyse tatlı su tolere edebilir. Aşırı hoşgörü tolow tuzluluk B. improvisus osmoregulatory mekanizmaları2,3etütler özellikle ilgili bir model haline getirir. Bu barnacle acı koşulları tercih ediyor fakat yaklaşık 1.6 psu dan salinities sularda yaşayan yetenekli 40 psu4olarak yüksek. Bu acı Baltık Denizi’nde bulunan tek barnacle türdür. B. improvisus Amerika kıtasının Doğu kıyısında kaynaklanan inanılıyor ancak bugün5nakliye tarafından yayılma nedeniyle Dünya çapında bulunur. Bu büyük bir kirlenme organizma ve yaygın kaya, jetties ve tekne gövde üzerinde bulunur ve bu nedenle genel ilgi biofouling deniz ve tuzlu suları6,7inşaatlarda üzerinde mekanizmaları anlamak için.

Çoğu diğer kaya midyeleri, B. improvisus ile karşılıklı etkileşimlere hermaphroditic benzer; üreme bir uzun penis ve iç döllenme kullanarak komşu bireyler arasında çiftleşme yoluyla oluşur. Üreme dönemi esas olarak Mayıs Eylül arasındadır. B. improvisus yedi pelajik larva aşamaları (altı nauplii bir cyprid sahne8tarafından takip) vardır. Döllenmiş yumurta kapakları olan free-swimming ve cyprid sigara besleme larva bir deri değiştirme önce birkaç hafta kadar su sütun için beslemeleri bir nauplius larva içine. Cyprid yerleşmek için uygun bir site bulmak için birden fazla ipuçları kullanır ve sonra metamorfoz sesil Juvenil barnacle9içine uğrar. Bu tür laboratuvarda kültürlü olabilir ve deniz (2-3 yıl içinde laboratuvar kültür) 1-2 yıllık bir ömrü vardır. Ortalama olarak, B. improvisus 10 mm çapında (ile en fazla 20 mm civarında) için büyür ve her ne kadar (kalabalık koşullarda uzun büyüyebilir) yaklaşık 6 mm maksimum yüksekliğe ulaşır. Belgili tanımlık tür-ebilmek var olmak onun pürüzsüz kalkerli hatta shell tarafından (beyaz veya gri), radyal desenli kalkerli Bankası kabuk plaka ve anlamlar plakaları1,10şeklinde tanımlanan.

Barnacle B. improvisus ozmoregülasyon, moleküler ve fizyolojik mekanizmaları hem de ekolojik etkileşimleri ve evrimsel sonuçları odaklanarak çalışmaları için bir model olarak çeşitli avantajlı özelliklere sahip. Biyoloji, özellikle yerleşim zehirli araştırma ve mekanizmaları dahil7,11,12,13ile ilgili araştırmalar için bir model olarak da yaygın kullanılır. Ancak, doğal mevsimlik yumurtlama cyprid larva araştırmaları öngörülemeyen bir kaynağı verir. Bu barnacle onun tüm yaşam döngüsü boyunca tüm yıl boyunca kültür, bu nedenle, moleküler ve mekanik çalışmaların çeşitli türlerini etkinleştirmek için önemli bir varlık yeteneğidir. Ayrıca, varlığını deniz/tuzlu sularda dünya çapında bir arada alan ve deneysel çalışmalar için sağlar. Kontrollü üreme de uzun vadeli kodlamayla14için bilinen soylular ailelerinin üretebilir ve birkaç aylık bir oluşturma süresi uzun vadeli deneysel evrim izin verebilir. Ayrıca mevcuttur bir taslak genom ve çeşitli transcriptomes ve bu kaynakları çeşitli genler (Örneğin, genler ozmoregülasyon önem)2,3‘ klonlama için kullanılmıştır.

Bu iletişim kuralının amacı kurmak ve yetişkin veya bu organizma larva gen ifade çalışmaları gerçekleştirmek için yıl boyunca barnacle B. improvisus kültürünü korumak nasıl tarif etmektir. Rittschof vd. 15 kısaca cyprids Balanus amphitritetürler için yerleşim nauplii yayımlanmasından itibaren kıskaç kültür yöntemi açıklanmıştır. İletişim kuralı tüm yıl yuvarlak B. improvisus Tjärnö deniz Araştırma Laboratuvarı (İsveç), kültür için adapte edilmiş ve üretim hattında tüm adımları ayrıntılı bir açıklamasını ve üretimi dahil olmak üzere barnacle yetiştirme özetlenen larva yanı sıra yetişkinler ve larva yem yönetimi. Tam yordam genel bakış için bkz: Şekil 1. Kodlamayla sisteminin kullanımı ile ortak bazı deneysel set-up örneği ve fonksiyonel genomik Na+çalışmalarda gösterilmiştir /K+ ATPaz ve olası işlevlerini ozmoregülasyon2, elucidating aquaporins, 3. Bazen belirli dokularda gen ekspresyonu incelemek için gereklidir ve bazı temel barnacle kandan da yer. Yüksek kaliteli deniz suyu iyi bir kaynağı ile barnacle B. improvisusve olabilecek birçok diğer türler, kültür Dünya çapında deniz laboratuarlarında mümkün olmalıdır.

Protocol

1. yeni bir Broodstock başlamak üzere alana yetişkin kıskaç topluluğu Termoplastik (poli-Metil metakrilat) Transparan panelli (110 x 110 x 1.5 mm3) ≈, Yetişkin kıskaç alandan toplamak için 1-3 m derinlik içinde sakin suları dağıtın. Çeşitli paneller (Şekil 2A), alabilir kullanım çerçeveler her panel ve attachthepanelstotherackusingcableties üst köşelerinde (6 mm çaplı) 2 delik matkap. Böylece, su thepanelswillhangverticallyin. Ne zaman kaya midyeleri yerleşim (küçük beyaz zor noktalar panellerinde olarak tanımlanan) oluştu, kıskaç büyük olduğundan emin olmak en az 2-3 hafta için panelleri bırakın yeterli (5 laboratuara kurutulmuş veya zarar olmadan transfer edilecek mm). Ne zaman onlar cabüyüklüğüne ulaşan kapatılan B. improvisus ile kaplıdır paneller laboratuvar haline getirmek. 5 mm indiameter.Not: Yetişkinler için 5 mm alanında geliştirmek için süre son derece gıda ve sıcaklık kullanılabilirliğine bağlıdır. Normalde, bu Tjärnö deniz araştırma laboratuvarı yaklaşık 3 hafta sürer (58.87 ° N, 11.14 ° E). En sık, paneller yeni broodstock için genellikle Haziran ayı sonunda dağıtılır ve Ağustos sonunda toplanan. Paneller kültür tesis içine tanıtımı önce diğer organizmaların panelleri temiz. Diğer barnacle türler kaldırmak çok önemlidir. Lütfen sık sık bu önemli ölçüde broodstock yaşama şansını arttıracak beri türlerin ekimi sırasında kirletici kurtulmak için panelleri temizlemek önemli olduğunu unutmayın. Panelleri dikey bir stand kenar polietilen tepsisinde (400 x 400 x 20 mm3) öğütülmüş yivli yerleştirin (rakamlar 2C ve 2E). Yiv stand içinde 15 mm apart vardır. Kasetlerdeki hazırlamak amacıyla, her tepsi karşı tarafta üssünde bir giriş portu ve bir çıkış bağlantı noktası üst olun. Yaklaşık 30 akışı aracılığıyla caoranında izin vermek için L su bir giriş 20 ° c açık deniz suyu ile içeren 100 L su deposu için giriş bağlantı her tepsisinin bağlayın. 2 L min başına.Not: en fazla 8 tepsiler tek 100 L su deposu için bağlı idi. 100 lt depo ısı kontrollü deniz suyu (20 ° C) (gelen deniz suyu ısı alışverişi bir ısı pompası tarafından sağlananmesela ) takın.Not: Yapışkan kardeşin B. improvisus büyümeye ve bir tam deniz tuzluluk (30-35 psu); yeniden Ancak, CA’yatuzluluk azaltılması. 100 lt depo için tatlı su ekleyerek 25 psu larvaları ile kültür çıkışını artırır. 2. başlangıç yeni nesiller kültürlü Cyprids yetişkinlerden Termoplastik panelleri üst kısmında açık söyleşilerin 5 panelleri birlikte bir toksik olmayan, suya dayanıklı bant kullanarak küpleri oluşturmak. Küp (kaçak) halinde küçük bir tepsiye yerleştirin ve deniz suyu (25 psu) ile doldurun. Su oda sıcaklığında tutmak (ca. 20 ° C). Yaklaşık 200 cyprids küp başına ekleyin. Gençlere her geçen gün Skeletonema marinoi 100 mL ile besleme (bkz. Adım 5) iken küpteki.Not: Juvenil kıskaç Artemia salina sindirerek ile zorluklar olabilir (bkz. Adım 3) onlar büyük ve bu nedenle, yeni kapatılan barnacle için yutmak zor olduğundan. Değişmek belgili tanımlık su 1 x bir hafta. Ne zaman belgili tanımlık kapı aynası yeterince kurulan gençlere en az 5 mm çapında içerir, 2 hafta sonra küp ayrı almak ve gençlere panellerle tepsiler akışı-throughseawater ile gitmek ve, bundan sonra kıskaç ile A. salina nauplii yem. 3. kültür Artemia salina Nauplii yetişkin kıskaç için yem olarak Bir kodlamayla sistemi A. salina için nerede bottomis kesti ve şişeyi ters bir stand ve ışıklı yan yerleştirilir 1, 5 L plastik şişe kullanarak ayarlarsınız. Bir kelepçe ile performans sorunu bir silikon tüp için uygun ve bunu bir havalandırma pompa (Şekil 2D) ekleyin. Yumurtalar çatlar için 1 L ofseawater için yaklaşık 15 mL Artemia kuru dinlenme yumurta ekleyin.Not: Artemia yumurtaları kapak nauplius larva 24-48 h sonra içine. A. salina nauplii (Örneğin, sonları) tarama geciktirmek için ışık sıcaklık biraz azaltmak için kapatılabilir. Artemia nauplii hasat etmek için havalandırma ve alüminyum folyo (veya benzer Örneğin, bir kutu) şişeyle üst kısmındaki darken… Aydınlatmak için 10 dk. Hatched Artemia nauplii şişe alt kısmı ışığa doğru yüzmek. Sigara yumurtadan kist altına lavabo olacak ve kist kabukları yüzeyde yüzer olacak. Kelepçe alt açın. Ara kesir yüzme nauplii yoğun bir nüfus toplamak.Not: Her gün (hafta sonları hariç), yoğun Artemia nauplii süspansiyon 1 L el ile tepsiler yetişkin kıskaç ile bağlanma 100 lt depo için eklendi. Onlar beslenme sağlamak ve özellikle kültür daha sık aralıklarla temizlemek ihtiyacı neden bu yana herhangi bir boş kist kabukları ile besleme kaçının. 4. toplama ve Barnacle larva yetiştirme Yavaşça onları ile tatlı su püskürtülerek yetişkin kıskaç panellerle Temizleme ve gerekirse, herhangi bir kirlenme barnacle kabukları ve yumuşak bir diş fırçası kullanarak panelleri kaldırın. Ayrıca, tepsiler (olmadan kıskaç) ve sıcak (75 ° C) tüplerde temiz tatlı su. 90 µm plankton-net bir kesim PVC boru (16 cm çapında, 15 cm yüksekliğinde) sonuna yapıştırılmış yapılmış bir elek bir taşma bağlantı noktası ile polietilen tepsi (30 x 20 x 10 cm3) yerleştirin. B. improvisus larva elek gecede (Şekil 2C) içinde toplamak.Not: Elek tepsi barnacle panelleri ve outflowing su almak için nauplii süzmek için çıkış bağlantı noktasını hemen altında yerleştirildi. Deniz suyu küçük tepsi taştı ise larva elek içinde kaldı. Bu küçük tepsi bu elek sağlamıştır asla driedout. 30 L kova nereye sıcaklık akvaryum balık tank Isıtma cihazları (Şekil 2E) kullanarak 26 ° C’de tutulan bir büyük su banyosunda yerleştirin. Havalandırma ve ajitasyon hava sistemi yoluyla köpüren tarafından emin bulunmaktadır. Kova süzülmüş deniz suyu (0.2 µm; 25 psu) 20 L ile doldurun. 1 L 2 diatom mikroalg, S. marinoi ve C. gracilis (bkz. Adım 5) 60/40 karışımı kova için ekleyin. Bu yaklaşık 5 x 104 Diyatomlarla mL kova başına ilk yoğunluğu verecektir.Not: Barnacle nauplii larva olumlu phototactic. Biraz ışık izin kapaklar ile opak beyaz plastik kovalar yapıldı. Kış boyunca, ama gece boyunca karanlık gündüz (8:00 – 17:00), Oda yaktı. Yaz aylarında, dış ışık sırasında günün en odama geldi. Toplanan transfer B. improvisus nauplii crystallizing çanak (300 mL; 90 mm çapında; 50 mm içinde yükseklik). Işık kaynağına larva çekecek yan çanak aydınlatmak. Bir pipet ile gelen ışıkta toplamak ve onları başka bir crystallizing yemek için transfer barnacle nauplii toplamak. Kalan herhangi bir Artemia larvaları kaldırın. B. improvisus nauplii larva bir ölçek 1 L süzülmüş deniz suyu ile aktarın. Nauplii karıştırma kabı hafifçe larva bile bir askıya almak ve sonra kabı farklı yerlerden beş 1 mL örnek alarak saymak. Her örnek için bir stereomicroscope ile bir görsel denetim Mikroplaka içine aktarın. Nauplii her birinde beş örnek sayısını ve onları ekleyin. Larva bütün kabı kaç binlerce tahmin etmek için 200 (1000 mL/5 mL) tarafından sınırlı sayıda numara çarpın. Kabı içinde çok fazla nauplius larvaları ise yoğunluğu en az 14.000 larva/M (genellikle aralığında 11.000-12.000 larva/M) kadar örnek oranında seyreltin. B. improvisus nauplii 1 litre bir kova, böylece yaklaşık 11.000-12.000 larva kova başına ekleme ekleyin.Not: bu yana bu larvalar ile ilgili olarak çok az yiyecek neden ve bu nedenle, ölüm oranı artırmak, daha fazla nauplii, eklemek emin olun. 3 gün sonra barnacle nauplii 90 µm elek üzerinde toplamak. Sonra temiz (75 ° C ile tatlı su), kova ile filtre uygulanmış deniz suyu doldurun, yeni diatom veri kaynağı (olarak aynı miktarda başında) ekleyin ve sonunda nauplii tekrar ekleyin. Cyprids yaklaşık 6 gün (± 1 gün) sonra görünmeye başlar. Cyprids ilk (4.2 yukarıda noktası olduğu gibi tasarlanmış) bir 90 µm elek ile toplamak. Sonra 320 µm elek üstünde tepe-in 160 µm elek ile barnacle sigara moulted nauplii ve cyprids ayrı. B. improvisus nauplii 320 µm elek ve cyprids 160 µm elek içinde toplayacaktır.Not: Cyprid larva crystallizing bir tabak içinde 10 ° C’de cakadar daha sonra kullanmak için karanlığın içinde depolanabilir. 6 gün. Ancak, farklı tedaviler karşılaştırmak deneyler ideal larva karıştırıcı etkileri16önlemek için aynı toplu iş (ve benzer saklama süresi) kullanmanız gerekir böylece depolama kalite ve barnacle larva performansını etkileyebilir. 5. kültür mikroalg Barnacle Nauplius larva yem olarak Not: 3 farklı kültürler içinde yosun yetiştirilmiştir: (i) uzun vadeli bakım ölçekleme-up; aşılama için kullanılmaya başlandı suşları için olan kültürler, stok (II) ölçek-up ilk adımdır başlangıç kültürler; ve son olarak (III) barnacle olarak nihai üretim ölçektir yosun büyük miktarlarda üretim kültür yem. Sipariş diatom türlerden kültür koleksiyonu yosun ve tek hücreli (CCAP) barnacle nauplius larva için yem kullanılacak. 2 tür Skeletonema marinoi (CCAP zorlanma 1077/5) ve Chaetoceros simplex var. gracilis (CCAP zorlanma 1085/3) yem iyi sonuçlar verir. Nominal gözenek boyutu olarak 0.2 µm (filtre uygulanmış deniz suyu da A. salina yumurta hatching ve barnacle nauplius larva kültür için kullanılacak var.). bir kartuş filtre sistemi kullanarak yosun kültürler kullanılmak üzere tüm deniz suyu filtre Otoklav (105 ° C’de 5 min için) yosun kültürler için filtre uygulanmış deniz suyu. Mikroalg autoclaved deniz suyu içeren inorganik besinler, izleme metaller ve vitaminler (bkz. Guillard 197517 ayrıntılı tarif için) Guillard’ın f/2 çözüm ile zenginleştirilmiş kullanarak, kültür için bir ortam hazırlayın. Buna ek olarak, silikat (Na2SiO3) çözeltisi hazırlamak, ama bu sağlam bir yağış önlemek için f/2 zenginleştirme ayrı tutun.Not: Zenginleştirme hisse senedi çözüm ve silikat hisse senedi çözüm konsantrasyonları her deniz suyu 1 L 1 mL ilavesi olarak kullanılmak üzere hazırlanmıştır. Otoklav 20 dk. vidalı kepli otoklav test tüpleri ile 1 mL f/2 zenginleştirme ve 1 mL silikat çözüm için 120 ° C’de yosun kültüründe tüm cihazları used. Autoclaved Züccaciye Mağazaları ve sıvı oda sıcaklığında soğuduktan zenginleştirme ve silikat çözümleri için theseawater ekleyin. Mikroalg 40 mL test tüpleri vidalı kapakları içinde hisse senedi kültürleri büyümek. Test tüpleri zenginleştirilmiş deniz suyu yaklaşık 30 mL ile doldurun. Kültürler yaklaşık 1 mL 2 hafta eski bir hisse senedi kültürün kullanarak steril Pasteur pipet ile aşılamak. Vidalı kapak sonra monte ama, bazı gaz değişimine izin ver için sıkılır değil. Varsa, laminar akış bulaşma riskini azaltmak için kabine aşılama yapılmalıdır.Not: Stok kültürler amacı kültürler yosun kültürler uzun vadeli olarak ve inoculum için görevi başlatmak muhafaza etmektir. Hisse senedi kültürler 2 haftada yeniden aşılamaya. Beyaz bir ışık için yeni hisse senedi kültür cabir yoğunluk ile ortaya çıkarmak. 25-50 µmole m-2s-1 (ile koyu döngüsü 16:8 h). Eski hisse senedi kültürler bir düşük ışık şiddeti bir yedekleme olarak taşıyın. 2 hafta eski herhangi bir hisse senedi kültürler atmak. Yosun üretim kültür ölçekleme başlangıç kültürleri ile hisse senedi kültür aşılamak ve onları 500 mL Erlenmeyerflasks büyümek. Otoklav 4 Erlenmeyer şişeler, Pipetler ve 300 mL filtre uygulanmış (0.2 µm) deniz suyu ile pamuk stoper ve f/2 zenginleştirme 0.3 mL ile 4 test tüpleri ve silikat çözümleri ile 4. F/2 zenginleştirme ve oda sıcaklığına silikat sakin ve çözümler Erlenmeyer şişeler için ekleyin. Onları caile aşılamak. 2 – eski hafta hisse senedi kültür 1 mL.Not: S. marinoi ile 2 şişeler ve 2 C. simplexile hazırlayın. Şişeler 50 µmole m-2s-1bir ışık şiddeti titreyen bir masanın üzerine koydu. Başlangıç kültürler yoğun yosun nüfus (sarı-kahverengi renkte) elde etmiş, onlar inoculum yapışkan kardeşin gıda ile larva sağlayacak üretim kültürler için kullanılmak üzere hazır. 4 L Polikarbonat şişe silikon stoper ile üretim kültürlerde cam tüpleri ile donatılmış 2 açılmış bağlantı noktası ile büyümek. Bir silikon tüp 0.2 µm Hava filtre ile donatılmış bir hava pompası ile biberondan dibine ulaşan 1 cam tüp takın. Emin olun ikinci cam tüp sadece Silikon tıpa altında biter ve enjekte hava çıkış sağlamak için pamuk ile doldurulur. Her hafta, dolgu dört 4 L süzülmüş deniz suyu ve otoklav ile onları stoper ile birlikte şişe. Buna ek olarak, otoklav 4 test f/2 zenginleştirme ve silikat çözümleri ile 4 mL tüpler. Soğutma sonra f/2 zenginleştirme ve silikat çözümleri için şişe ekleyin ve sonra onları Erlenmeyer şişeler start-up kültürlerde birimin ile aşılamak. Dört 4 L şişe 50-100 µmole m-2s-1bir hafif yoğunlukta yerleştirin. Üretim kültürler casonra hasat. 1 hafta; Onlar sonra yapışkan kardeşin nauplius larvaların beslenmesi için kullanılmak üzere yeteri kadar yoğun.Not: Herhangi bir zamanda 8 etkin üretim şişe demektir bir kullanım ömrü yaklaşık 2 hafta, üretim kültürleri var. 6. deneysel çalışmalar kıskaç kullanarak tasarlama Çocuk ya da yetişkin kıskaç panellerle kontrollü aquaria nerede identicalconditions altında yetiştirilen olabilir yerleştirin. Buna örnek olarak, yerel adaptasyonlar ya da fenotipik plastisite18anlamak veya gen ifade değişiklikler dış faktörler (Örneğin, tuzluluk, sıcaklık veya pH) ile ilgili olarak çalışma için kullanılabilir bir ortak Bahçe deneme denir.Not: Doğrudan panellerinde alandan toplanan kıskaç kullanmak mümkündür. Laboratuvar yetiştirilmiş bireyler kullanmanın bir yararı çoluk çocuk nesil kullanırken anne etkileri önlenebilir olduğunu. Yetişkin (Örneğin, gen ekspresyonu araştırmalar) hasat tarafından takip bir chosentime aralýðý kıskaç belirli çevre koşullarına maruz2. Gen ifade3çalışmaya cyprid larvaları ile deneyler için kontrollü aquaria nerede larva aynı koşullar altında ekili cyprids koyun. Cyprids sonra belirtilen süreler (4.7 adımda anlatıldığı gibi) elek ile süzerek hasat ve RNA protokolleri göre aşağıda (adım 8) ayıklayın. 7. kaya midyeleri diseksiyon Diseksiyon ve DNA örnekleme yapıldığı, laboratuvar alanı bothbefore temizlik ve bireyler arasında tüm diseksiyon araçları gibi. Bu yapılır klor tezgah (veya % 96 etanol forseps için) kullanarak.Not: etiketli tüpler fiksasyon ortamı (etanol veya RNA sabitleme çözümünü) içeren önceden hazırlanır. Büyük ve kısa vadeli aç bireyler (onları iki gün önce diseksiyon için yem yok) seçin. Barnacle kabuk (Örneğin, bakteri, alg) diğer türlerden bulaşma riskini en aza indirmek ve su ile durulayın bir diş fırçası ile temizleyin.Not: Bireylerin diseksiyon önce kısa süreli açlık için (Örneğin, Artemia kisti gut üzerinden) herhangi bir DNA kirlenmesini önlemek için nedenidir. Bireysel kıskaç bile bir yüzeyi, ekli bir paneli ya da gevşek bir tabak koyun. Yetişkin ilgili dokulardan incelemek. Kıskaç, çalışma amacına bağlı olarak incelemek için birkaç yolu vardır. Diseksiyon Yöntem A: mümkün olduğunca hızlı bir şekilde tüm barnacle sabitleme. Bütün barnacle panelinden panel yüzeyine yakın yapışkan kardeşin altında eklemede bir neşter kullanarak kaldırın.Not: çoğu durumda, bazal plaka bu manipülasyonu neredeyse olduğu gibi böylece içinde barnacle etkileyen değil bırakır. Dikkatli bir tarafta dış kabuk forseps (Şekil 3) ekleyerek çatlamak. Bu fixating orta kabuk içine izinsiz giriş kolaylaştırmak için yapılır.Not: kabuk hiç bir test tüpü içinde yapışkan kardeşin yerleştirmeden önce kırık değil, o daha yavaş bir fiksasyon işlemi ve daha sonra DNA bir düşük kaliteli yol açabilir. Kırık barnacle bir RNA depolama çözümü veya etanol içeren test tüpünde koymak. Yapışkan kardeşin en az 24 saat onun fiksasyon için çözüm bırakın. Yapışkan kardeşin düzeltildiğinde, hayvan fiksasyon medyadan alınır ve bir diseksiyon tepsiye yerleştirilir. Cirri, manto ve soma (vücut) birbirinden ayrılmış ve daha fazla çekimi DNA veya RNA ayrı borular yerleştirilir.Not: Döllenmiş yumurta ile yumurta lamellae barnacle içinde mevcut olup olmadığını gözlemlemek önemlidir. Varsa, bunlar birden fazla genotip örnek bulma önlemek için DNA çekimi işlemine devam etmeden önce kaldırılması gerekir. Diseksiyon Yöntem B: kabuk onun fiksasyon önce yapışkan kardeşin kaldırılıyor.Not: Bu yöntem her zaman calcareousshell içeriye doğru bağlanmış olduğu bu yana örnek manto neden olabilir değil. Ama bu bireysel DNA örnekleme için hızlı bir yöntem olabilir. Dikkatle, diseksiyon forseps, anlamlar ve scutal tabak (Şekil 3) anlamlar ve scutal plaka arasındaki pens ucu ekleme, bir tabak tutmak kapma ve çekerek yavaşça bunları kaldırmak için kullanarak kaldırın. Kapmak cirri ile forseps ve çekme yapışkan kardeşin ile doğrudan dışarı tutun ve doğrudan % 96 etanol veya fiksasyon için çözüm sabitleme RNA yerleştirebilirsiniz.Not: Bazen, manto da aynı anda görüldüğü gibi örnek ( B. improvisusiçinde) karanlık pigmentasyon ile ince bir epitel olarak. Aksi takdirde, manto olabilir bir neşter kullanarak kabuk içeriden kaldırıldı ve, bundan sonra etanol veya çözüm sabitleme RNA yerleştirilir.Not: Eğer (sağlam) anlamlar ve scutal tabak kurutulmuş ve onlar için türün kimlik10yararlı olduğundan kurtardı. Türler, herhangi bir şüphe varsa genel bir öneri de diseksiyon başlatılıyor önce bütün barnacle fotoğraf etmektir. 8. RNA ayıklama kantitatif PCR Çözüm sabitleme bir RNA içine RNA çekimi için kullanılmak üzere yetişkin koymak, onları gecede (en fazla 24 s) 4 ° C’de kuluçkaya ve sonra onları-80 ° C’de depolayınNot: Cyprid larva cryotubes içinde yerleştirerek ve tüpler kısaca batış tercihen kuru-dondurulmuş, RNA-80 ° C, daha sonra doğrudan olarak olmadan (30 s) bunları-80 ° C’de saklamak önce sıvı azot RNA ayıklama zamanda kıskaç buz çözme ve onları olduğu gibi kullanın veya kullanılmak üzere belgili tanımlık doku teşrih (bkz. Adım 7).Not: yüksek genetik çeşitlilik nedeniyle bireyler (Kodlayıcı bölgeler; içinde ≈ % 3-5 varyasyon arasındaki ALM Rosenblad vd., yayınlanmamış veri) daha sonra qPCR adımda bireyler arasındaki sıra varyasyon etkisini en aza indirir poola yetişkin bireyler, dizi için önerilir. RNAextraction için 2.8 mm Seramik Boncuklar içeren homojenizasyon tüpler içine bir RNA hazırlık kit ile sağlanan lizis arabelleği 350 µL ekleyin.Not: Seramik Boncuklar RNA (Temsilcisi sonuçları) sonication için kıyasla daha iyi bir verim sağlar. Bir yetişkin barnacle (bütün veya doku) veya en az 20 cyprid larva forseps kullanarak toplamak alıp homojenizasyon tüpler içine koy. Bozulma ve homojenizasyon doğrudan bir boncuk fabrikası ile devam edin. Homojenizasyon tüpleri ile örnek ve Boncuk Boncuk Değirmen tutucu içinde koymak. Onları buz üzerinde 1 dk. için örnek için 20 s. Cool 4.0 m/s bir frekans ile sallamak. 2 x tekrarlayın. Piyasada bulunan RNA izolasyon kit protokolüne göre RNA hazırlayın.Not: bir duman başlık ve eldiven (Örneğin, dahil olmak üzere diğer koruyucu giysiler, kullanımını gerektiren tehlikeli kimyasalların tanımlamak için RNA çıkarma yöntemleri, kullanılmadan önce (güvenlik bilgi formları bir okuma dahil olmak üzere) bir risk değerlendirmesi yapılmalıdır β-mercaptoethanol lizis arabelleğine ek RNA ayıklama sırasında bir duman mahallede yapılmalıdır). RNA ölçmek. Çalışan bir çözüm hazırlamak ve bir standart ve örnekler için 200 µL. birim toplam ekleme girdap 2-3 sn için onlara ve onları bir yer tüpler 2 dk. Ekle kuluçkaya ve okumalar alıp. Her türlü protein kirlilik için RNA örnekleri ile spektrofotometre denetleyin ve bir otomatik elektroforez sistemi (Temsilcisi sonuçları) ile kendi RNA bütünlük denetimi.Not: kaliteli hazırlıkları RNA 260/280 oranında olması önerilir 2-2.2 ve yaklaşık 1.8 DNA nm. Daha düşük değerler protein contaminations ve çıkarma yordamı optimize edilmiş olması gerektiğini gösterir. 9. gen ekspresyonu: cDNA sentezi ve qPCR DNaz elde edilen RNAwith qPCR için cDNA yapmadan önce herhangi bir remainingDNA kaldırmak için tedavi. CDNA hazırlarken bir RNA örnek ama hiçbir ters transkriptaz ekleyerek genomik DNA kirletici için kontrol edin. Ters transkriptaz yapılan cDNA üzerinde seçili gen PCR amplifikasyon ise RNA DNA bulaşma olur.Not: RNA-seq (RNA-sıralama yeni nesil sıralama teknolojisi kullanılarak) için kullanılacak örnekleri için DNaz adım daha az önemlidir. Özellikle, RNA düşük düzeyde örnekler için DNaz adım kaybetmek değil sırayla ihmal çok fazla RNA sürecinde. CDNA sentez DNaz tedavi RNA RNA bir miktarda ticari cDNA sentez kiti, ama kullanımı en az 50 ng genellikle, belirtilen Aralık içinde kullanarak gerçekleştirin. Onlar nerede sıra kimlik bireyler arasında mümkün olduğu kadar yüksek, ama sıra kimlik gen paralogs arasında mümkün olduğunca düşük faiz gen bölümlerine tavlama qPCR astar tasarlayın. Lütfen ilgili yayınları’Na+gen ifade çalışmaları için kullanılan belirli astar çifti bakın /K+ ATPaz3 ve aquaporins2 (Şekil 5).Not: Bu amaçla, cyprids yüzlerce veya birkaç yetişkin RNA-seq sıra verilerden kullanılabilir. Tasarım astar ifade düzeyleri (Örneğin, aktin) normalleştirme için kullanılmak üzere bir gen için. Başarıyla aktin için kullanılan astar are, ön: 5′-CATCAAGATCAAGATCATCGC-3′ ve geriye doğru: 5′-ATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′.Not: Sık kullanılan denetim gen aktin var. Ancak, diğerleri de edilmiş bir referans olarak önerilen ve dışarı kıskaç19üzerinde test edilmiştir. Aktin yanı sıra, RPL8, 36B4, EF1 ve NADHd1 kullanımı bir referans olarak test edilmiş3olmuştur. Soma, cirri, yetişkin veya cyprids arasında ilgili başvuru genlerin ifade düzeylerinde hiçbir büyük farkı vardır sonucuna varıldı. Tavlama sıcaklığı için tasarlanmış astar cDNA (genellikle, 0,25-50 ng aralığı) miktarda artan SYBR yeşil, dNTP, polimeraz ve ileriye ve geriye doğru astar her 0.3 µM içeren bir karışıma ekleyerek optimize edin. QPCR protokolleri farklı tavlama sıcaklıklarda aşağıdaki gibi çalıştırın: bir ilk denatürasyon sıcaklığı 95 ° C 3 dk, denatürasyon adım 20 95 ° C’de 55-63 ° C sıcaklığa 20 tavlama s, s ve bir uzama 30 72 ° C’de s. Toplamda 40 PCR döngüleri çalıştırın.Not: Astar verimliliği % 90 – 105 aralığında yalan gerektiğini ve E hesaplanır (10^(-1/slope)-1) yamaç cDNA konsantrasyonları döngüsü eşik (Ct) değerlerine karşı günlük değerini komplo elde eğrinin eğimini nerede x 100. = QPCR cDNA, genellikle 1-10 ng bulundu optimum tavlama sıcaklığı ile adım 3’te açıklanan PCR protokolü kullanarak, uygun bir miktarda kullanarak gerçekleştirin.Not: CDNA yüksek miktar yalnızca son derece düşük miktarlarda ifade edilir genler için kullanılır.

Representative Results

B. improvisusyetişkin kıskaç kültür açıklanan yordamı ile haftalık larva nauplius dört toplu işlemleri kadar üretilebilir. Nauplius larvaları hemen hemen her gece toplamak mümkün olurdu, ama bu daha fazla kişi ve altyapı gerektirir (broodstock içinde birçok kıskaç ile bir kültür larva sürekli yayınlayacak). Larva üretim için ek bir sınırlayıcı faktör yem kaliteli, durumu özellikle diatom Skeletonemaile ilgili gibi görünüyor. Sonuna kadar her toplu kodlamayla sisteminden haftada 50. 000’nauplii kadar kültürlü böylece yaklaşık 12.000 nauplii oluşur. Ancak, birkaç hafta üretilen on kat daha az sayıda larva kadar olabilir. Tek bir yetişkin başına gün141-2 Yetişkin larva her toplu iş için yeniliyor anlamına gelir, ilâ 7,000 larva üretebilir. Bir hafta içinde toplanan nauplii yaklaşık % 70-90 yerleşim deneyleri ve Moleküler çalışmalar için kullanılabilir (kabaca 30.000 cyprids her hafta, sonuna kadar verimli) cyprids içine gelişecektir. Bu cyprid Özellikler toplu işlemleri arasındaki farklılığı olan vurguladı ve genel olarak, daha büyük varyasyonları arasında gruplar içinde gruplar halinde daha vardır. Örneğin, yerleşim deneyleri dispersiyon başarısında 30 ve farklı toplu işlemler için % 70 arasında değişir. Büyük olasılıkla bu larvaların farklı örnekleme dönemleri sırasında serbest yetişkin belirli çiftleri arasındaki bireysel genetik varyasyon kaynaklanır. Bu tabii ki, Eğer sonuçları hakkında daha genel ifadeler yapılması için tekrarlanan deneyler (biyolojik çoğaltır) cyprids toplu işlemler bir dizi içermelidir tavsiye edilir. Toplu iş toplu iş değişim talepleri uygun denetimleri ve normalizations gen ifade çalışmalarda uygulanacağı yeri deneysel tasarım, koyar. Ancak, hatta birkaç istatistik normalleştirme prosedürler uygulandıktan sonra bu toplu iş iş arasında varyasyon önemli ölçüde azaltmak, bazı etkileri toplu genellikle hala belirgin (yayınlanmamış veri). Sağlanan iletişim kuralı elde etmek, ortalama 500 mümkündür ng bakılmaksızın barnacle yerleşim (Tablo 1) aşaması olduğu kadar az 20 cyprids üzerinden yüksek kaliteli RNA’ın. RNA kalitesi genellikle (iki doruklarına beklenen konumunu Şekil 4′ te belirtilir) 18S ve 28S tepeler arasındaki oran olarak ölçülür. Ancak, kıskaç ve birçok diğer eklembacaklılar, söz konusu olduğunda 28S rRNA (analiz yönteminin bir parçası) ısıtıldığında yıkar ve birlikte 18S tepe20geçirir. İşte, prensip olarak, bir tek rRNA tepe bu tür bir analiz için kıskaç bu yüzden. Bu bir homojenizasyon Seramik Boncuklar tarafından RNA ile en yüksek bütünlük sağlar ve olduğunu, bu nedenle, seçtiğiniz yöntemi bu testten (Şekil 4) açıktır. RNA ortalama 70 milyon okur (okuma, sayısı, tabii ki, nasıl yapılacağını sırasında çoğullama düzeyini bağlıdır) örnek başına sonuçlanan tutarı ve kalite için sıralama, yüksek kaliteli sıralama kitaplıkları oluşturmak için yeterlidir. RNA miktarı da cDNA sentezi ve qPCR ifade analizi çok sayıda gen için yeterlidir. Şekil 5 aquaporins ve na+qPCR analizleri sonucu /K+ (NAK1) ATPaz değişik, splice gösterir nerede ifade değişiklik değişiklikler çevre ipuçları2,3′ te araştırıldı. Uzun ve kısa göreli ifade karşılaştırılması splice değişik-in bir iki kat uzun NAK1 mRNA için artış ile ilgili olarak kısa NAK (Şekil 5A) düşük tuzluluk NAK1 gösterir. Böylece, verileri alternatif işlenim uzun formu düşük tuzluluk koşullar altında baskın yapar olduğunu gösterir. Aquaporins söz konusu olduğunda, iki su taşıma paralogs AQP1 ve AQP2 fark ifade (Şekil 5B) görüntülemek belirgindir. Özellikle, manto dokusunda belirgin AQP1 hangi AQP2 için görülmez önemli ölçüde daha düşük salinities aşağı düzenlenmiş olduğunu. Bunun yerine, AQP2 alt salinities at ama soma biraz artan ifade gösterir. Bu bulgular farklı fonksiyonel rolleri soruşturmalar için bir temel sağlar B. improvisus iyon taşıyıcılar ve barnacle ozmoregülasyon aquaporins. Resim 1 : Yordam ve RNA ayıklama yetişkin gen ifade araştırmaları bütün bakış. Yeni bir kültür başlatmak için panelleri bir çerçeveye bağlı ve denizin 1-3 m derinlik, dağıtılabilir. Birkaç hafta sonra yetişkin/gençlere panellerle dikey raflar laboratuvarda kasetlerine yerleştirilir. Her tepsisi yaklaşık 40 yetişkin panellerle taşıyabilir. Panel başına yaklaşık 100 yetişkin ile toplam ≈ tepsi 4.000 yetişkin bireyler kültürlenir. Yetişkin kıskaç Artemia ile beslenir ve tutulabilir yıl-çevresinde. Nauplius larva birkaç kez haftada bir bir elek ile filtreleme tepsileri üzerinden toplanır. Toplanan nauplii 26 ° c su banyosunda tutulur ve mikroalg ile beslenen bölümler için transfer edilir. Süzme yoluyla toplanan besleme cyprids içine tüy dökme kadar nauplii yetiştirilen. Yeni paneller cyprids paneller, ya yeni paneller için yıl sağlamak için yerleşme tarafından laboratuvar olarak kurulabilir-kültür çevresinde veya değiştirilmiş dış koşullara sahip belirli deneysel set-up için kullanılacak. RNA sonra genç/yetişkin deneme sonunda veya belirli zaman noktalarda üzerinden elde edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Resim 2 : Bazı önemli adımlar kodlamayla yordamdaki görüntülerini. (A) Bu görüntü gösterir yeni nüfus alandan toplamak için panelleri çerçevelerle. (B) Bu görüntü B. improvisus yetişkin kıskaç panellerle tepsilerde yerleştirilen raflar gösterir. Paneller yaklaşık 2 cm arayla yerleştirilir. (C) Bu görüntü ile yapışkan kardeşin tepsiler panelleri ve soldaki besleme tankı gösterir. Her tepsiden elekler nauplius larva toplamalarında yerleştirildiği bir çıkış vardır. (D) bu yem Artemia üretimi için yetişkin kıskaç gösterilir. (E) nauplii 26 ° C’ye ayarla bir su banyosu yerleştirilen kovalar yetiştirme bu görüntü gösterir Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3 : Yetişkin kıskaç ilk diseksiyon adımlardan açıklaması: vücut onun kabuğundan kaldırma. (A)bir forseps diyafram üzerinden yavaşça ekleyerek opercular plakaların kapmak. Plaka kaldırmak ve hayvan ortaya çıkarmak için yavaşça çekin. (B) hemen altında cirri soma bölümü kapma tarafından hayvan dışarı çekin. (C) Bu panel meşe palamudu kıskaç Genel anatomi gösterir. Vücut çekildiğinde manto ve potansiyel olarak döllenmiş yumurta (yumurtalık içinde) kabuk boşluğunda kal. Barnacle anatomisiyle ilgili bir not (daha ayrıntılı bir hesabı için bkz: Anderson)9: bir barnacle duvar plakaları içe doğru eğimlidir ve birlikte, onlar bir volkan gibi koni oluşturur. Bir açılış, diyafram, bir kapı veya diyafram kapatmak için operculum, oluşturan iki opercular tabak tarafından kaplıdır. Meşe palamudu kıskaç genellikle için terkedilemeyen sıkıca yapıştırılmış kalkerli bir bazal plaka var; Ancak, bazı türlerin kıskaç bu kalkerli plaka (Örneğin, S. balanoides) eksikliği. Kıskaç Koyu pigmentli manto (kabuk) üzerinden exoskeleton salgılar. Çift katmanlı manto dış yüzey süre manto iç yüzeyine değil kireçlenme ve bu nedenle esnek rijit, olmak kireçlenme. Diyafram içinde cirri retrakte bir konumda bulunur. Bu süspansiyon beslenmesi için kıskaç kullanmak torasik ekleri vardır. Testis içinde soma yalan ise yumurtalık barnacle Bankası yakın yer almaktadır. Bu rakam Panova vd. kabul edilmiştir 21 ve Springer izniyle yayınladı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4 : RRNA bütünlük kapiller jel elektroforez tarafından belirlenmesi. RNA iki farklı homojenizasyon yöntemine göre hazırlanmıştır:(a)sonication ve (B) Seramik Boncuklar. Y ekseni, FU, biriminde floresans birimleri için duruyor. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 5 : Gen ifadesi sonuçlar genlerin ozmoregülasyon içinde çok önemli iki farklı çalışmalar B. improvisus. (A) Bu panel gösterir fark ifade qPCR na+ek yeri versiyonlarının göre ölçülen /K+ ATPaz NAK1 çeşitli salinities ve pCO2 yanıt3düzeyleri. Düşük tuzluluk tedavisinde uzun izoformu (NAK1-L) ifadesi göreceli olarak kısa artırılır (ANOVA, P < 0.001). (B) Bu panel aquaporins ifade sırasında çeşitli salinities2maruz kaldıkları B. improvisus erişkinlerde gösterir. qPCR göre aktin aquaporin ifade düzeylerini belirlemek için kullanıldı. Yetişkin bireyler 3 farklı salinities (3, 20 ve 33 güç kaynağı) 14 gün boyunca inkübe. İçin RNA hazırlık, soma, cirri ve yetişkin manto ayrı kaldık. Hem rakamlar hata çubukları standart sapma gösterir. ** Ve *** düzeyi ve önemi (ANOVA), belirtmek 0,01 ve 0,001, anılan sıraya göre. Bu rakamlar Lind vd. modifiye edilmiş 2 , 3. hem rakamlar PLoS bir izniyle yayınlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Yerleşim faz Toplam RNA (ng) miktarı Ücretsiz yüzme 512 Keşif: Yakın arama 518 Ekli cyprid 550 Yeni çocuk başkalaşıma 832 Tablo 1: verimleri RNA’ın. Bu tablo farklı aşamalarında kapatma işlemi sırasında toplanan 20 cyprid bireyler takımlık bir RNA hazırlık seti ile çıkarılan RNA miktarı gösterir.

Discussion

Barnacle kültür Tjärnö deniz Araştırma Laboratuvarı (İsveç) 20 yılı aşkın süredir çalışmakta olduğu ve birçok farklı araştırma alanda çalışmalar için kullanılır. 30’dan fazla bilimsel makale kodlamayla sistem çalışmaları da dahil olmak üzere zehirli13,22, hidrodinamik23, kimyasal ekoloji24son yıl içinde kullanılan yayınlanmıştır, iklim değişikliği16 , Evrimsel biyoloji5ve moleküler biyoloji2.

Laboratuar ortamında (vahşi nüfus temsilcisi olmayabilir bireyler) daha adapte olmuşlardır belirli kişilerin seçimine önlemek için yeni bir broodstock alandan her yıl toplamak için önerilir. Buna ek olarak, Ayrıca bu yana yaklaşık yetişkin mortalite % 50-80 normal bir yıl boyunca her yıl, kültür gençleştirmek için iyi bir yöntemdir. Ancak, amaç doğuştan hatları üretmeye veya deneysel evrim çalışmalar ayarlamak için ise, sadece Laboratuvar yetiştirilen aileler kullanılmak üzere vardır.

Çünkü o zaman, cyprid larva denizin içinde iyi bir kaynağı B. improvisus Tjärnö deniz araştırma laboratuvarı panelleri üzerinde toplamak için iyi bir zaman Haziran-Ağustos ayında var. Kontrol panelleri haftalık barnacle kapatma başladığında görmek ve diğer el ile kaldırmak için yerleşmiş türler B. improvisus (Örneğin, midye, tunicates, bryozoans, hydroids, nemerteans/tubeworms ve diğer barnacle türler) daha–dan paneller (Örneğin, bir diş fırçası ile). Tjärnö var üç sığ su barnacle tür mevcut (B. improvisus, Semibalanus balanoidesve Balanus crenatus). Ancak, B. improvisus Temmuz – Ağustos sırasında yumuşak sert yüzeylerin Orklar’dan baskın olduğunu. S. balanoides erken bahar sırasında onun kapanış dönemi vardır ve çoğunlukla doğal yüzeylerde (Örneğin, taş) tercih ediyor. B. crenatus yaz aylarında panellerinde düşük numaralarından oluşabilir.

Bazı linages belirli özellikleri ile kurulmuş varsa gerekli olacaktır, kültürlü cyprids veya deneysel evrim çalışmalarda yeni yetişkin barnacle nesiller başlatmak mümkündür. Yetişkin yeni nesil başlatmak için en uygun cyprids laboratuvarda termoplastik paneller üzerine yerleşmek için yoludur. Bu paneller yeni kapatılan cyprids ile de deneysel tedaviler veya maruz alanında kullanılabilir. Acil durumlarda, bir de yakın bir sitede (Örneğin, Idefjorden Tjärnö deniz araştırma laboratuvarı durumunda) B. improvisus ortak nerede gelen kayalar üzerinde yetişkin kullanabilirsiniz. Zaten kurulmuş bu yetişkinlerin böylece tepsilerde konuyor panellerinde, yetişkin olarak aynı şekilde tedavi ve sistem üzerinden akış yoluyla beslenir. Akış hücreleri panelleri kıskaç25ile kurmak için de kullanılabilir. Bu akış yoluyla chambers ile plankton net üzerinde cyprids, panel larvaların için tek yerleşim yüzey olarak ile razı değil tarafta vardır.

Tüm yaşam evreleri de dahil olmak üzere bir uzun vadeli işleyen barnacle kültürünü ayarlamak için kritik olan birkaç adım vardır. Kültür B. improvisus kullanılan yöntemleri muhtemelen, büyük ölçüde, free-swimming, planktotrophic larvaları ile deniz diğer omurgasız için de geçerli bulunmaktadır. Kodlamayla yordamlar için bazı türler zaten iyi açıklanan (Örneğin, mavi midye ve istiridye ve farklı türler için)26, diğer deniz omurgasızlar iken için sadece birkaç örnek hayatı boyunca yayılan uzun vadeli kültürlerin vardır döngüsü. İlk başarılı deneme kültür kıskaç (d. amphitrite) için birini Rittschof vd tarafından yapıldı 15. uzun vadeli finansal ve kişisel kaynakları barnacle kültür tesis kurma düşünmeden önce yerde olmalı. Yılın bu tür bakım-barnacle kültür en az bir kişi çalışma yarı süresi gerektirir. Bazı adımlar mikroalg27kültür ağırlıklı üretim hattında gelecekteki otomasyon için bazı potansiyel olabilir. Buna ek olarak, başarılı olmak adına, büyük miktarda yüksek kaliteli deniz suyu için erişim olması esastır. Mikroalg, Artemia ve kaya midyeleri kültür herhangi bir belirli güvenlik prosedürleri anlamına gelmez. Ancak, bazı zehirli maddeler veya toksik kimyasallar testleri özel önlemler gerekebilir.

Paneller contaminations için haftada birkaç kez kontrol edildi. Kültürde kullanılan deniz suyu Tjärnö deniz araştırma laboratuvarı dışında Koster fiyort 40 m derinlemesine dan pompalanır oldu ve iki kum filtreleri yoluyla Laboratuvar su sistemi girmeden önce kabul edildi. Filtre yok sudan yapılmış eğer çok daha fazla kirlenme kültür olur. Düzenli olarak döküntü ve deniz suyu temini sisteminden alandan girin (Örneğin, stolon-bina hydroids ve yırtıcı nemerteans) diğer omurgasızlar kültüründen panellerinde temizlemek için esastır. Hiçbir larva rağmen üretilen Eğer örneğin, kültür iyi beslenmiş ve aksi halde olmuştur aslında iyi durumda gibi görünüyor sorun çiftleşme etkisizleştirmek için görünür nemerteans varlığı olabilir. Doğal olarak, birçok bulaşıcı canlılar kültür Tjärnö deniz araştırma laboratuvarı arasında İsveç Batı kıyısında belirli ve organizmaların bulaşıcı başka türleri yaygın ve diğer coğrafi alanlarda bir sorun daha olabilir. İsveç’in Batı kıyısında kirlenme panellerinde diğer barnacle türler tarafından bulmak olağandışı bir durum. Bazen, S. balanoides kurulması bulundu, ama çok marjinal sorun (en azından, bir balanoides S. kirletici 10.000 B. improvisus örnekleri için) bu. Türler kirletici eksikliği büyük olasılıkla yeni kültürler larvaefrom B. improvisus son derece hakim olduğu zaman yaz aylarında kurmak için rejim bağımlı. Buna ek olarak, ayrıca oldu B. improvisus açık bir zenginleştirme panellerinde bu tür pürüzsüz yüzeylerde13için seçime bağlı olduğu için.

Ölü yetişkin kıskaç kaldırmak gereklidir. Boş kabukları panelleri üzerinde kalması durumunda, hem Artemia nauplii yanı sıra çeşitli bulaşıcı türler için bir sığınak haline gelebilir. Buna ek olarak, bu ölü bireylerin bireylerle, ayrışma sırasında toksik bileşikler sürümü muhtemelen komşu iyi olmak etkilemek fark edilmiştir. Bir ek, yetişkin ölüm bazı kişilerin rahat ve çok uzakta çiftleşme (kaya midyeleri en uzun penis büyüklüğü ile ilgili olarak hayvan dünyada olsa bile) izin vermek için herhangi bir yetişkin gelen kalır ki sonucudur28. Bu kişilerin hayatta kalacak ama larva için sigara-üretken. Ancak, bu yalnız yetişkin bireyler yavaşça Bankası-plaka zarar vermeden kaldırılabilir ve diğerlerine yakın çiftleşme etkinleştirmek için yatay olarak yerleştirilmiş. Kıskaç da üstünde her-paneller bir yetişkin ile yerleştirerek şeklindeki ama böylece karşılıklı etkileşimlere oluşabilir yeterince yakın. Bu şekilde, genetik satırları üretilen14olabilir.

Bir yem kaliteli üretmek için ve hemen hemen her gün kültürler beslemek için önemlidir. Hatta bir kaç gün yiyeceksiz larva azalan bir sürümde neden olabilir. Diyet kompozisyon önceki testler Diyatomlarla barnacle nauplii hayatta kalma ve büyüme için gerekli olan göstermiştir. Birçok diatom türü olarak yeterli gibi görünüyor besleme, her ne kadar küçük ya da soliter hücreleri (çapı 10 µm) nauplii’nın sindirim için gerekli olabilir. S. marinoi, C. simplexve T. pseudonana türlerin hepsi B. improvisus nauplii, yanı sıra kolay yetiştirmek için yeterli yem olduğu kanıtlanmıştır. Buna ek olarak, yem kalitesi genellikle yosun katlanarak büyüyen için yüksektir. Ayrıca Diyatomlarla B. amphitrite15üretken kültürleri kurmak için gerekli olan bildirilmiştir. Bir teori Diyatomlarla önemini bir benzersiz yağ asidi profile sahip ve özellikle son derece çoklu doymamış 20:5 yağ asidi29zengindir. Bu, bazı yağ asitleri istiridye larva30başarılı gelişimi için önemlidir gösterilmiştir.

Yıllar içinde barnacle kültüründe zararlı hastalıkları yok olaylar olmuştur. İstiridye ve midye gibi birçok ticari omurgasız aquacultures hastalıklar oldukça yaygındır ve çok zararlı olabilir. Virüsler zararlı etkileri de vahşi nüfus bildirilmistir. Fransa’da yerli istiridye 1925 yılında Portekizli istiridye Crassostrea angulata tarafından değiştirildi, ancak bu tür bir iridovirus 197031çevresinde tarafından yok olmuş. Daha yakın zamanlarda, Pasifik istiridye ostreid herpesvirus 132ile ilişkili gibi görünüyor Crassostrea gigas kültürlerde dünya çapında, içinde büyük ölüm hadise olmuştur. Patojenler, bakteri veya virüsler kıskaç üzerinde hiçbir rapor defa yayınlanmıştır. Ancak, devam eden genom-devam eden proje B. improvisus, virüs sıraları bulunmuştur (Alm Rosenblad vd., yayınlanmamış veri) ama hastalıklarının belirtileri belirgin bir bağlantı ile. Karışımlar antibiyotik bakteriyel enfeksiyonlar riskini en aza indirmek için kültürler daha önce uygulanmış olan; Ancak, bu yordamı Şu anda durdurulmuş ve şimdiye kadar bu herhangi bir kirlenme sorunları neden oldu değil.

Deniz suyu (yukarıda açıklandığı gibi) ısıtılır, aşırı ısınma kültür üretim hattı en ciddi tehlikede olabilir. Bu, tabii ki, sensörler ve uygun uyarı sistemleri (sorumlu kişilere e-posta veya metin mesajları gönderme kullanılanÖrneğin,) olabilir, ancak aşırı ısınma karşı korumak zordur. Olaylar geçmişte bu tür yetişkin kültüründe önemli öldürülmesi sonuçlandı. Bu, tabii ki, yıkıcı ve zaman ve para uzun vadeli yatırımlar berbat. Özellikle, bu doğuştan genetik çizgiler kurulmuş varsa felaket olabilir. Bu satırları uzun ömür sağlamak ve onları kayıplara karşı güvence altına almak için kıskaç bir dondurma metodoloji geliştirmeye arzu olurdu. Bu larvalar Pasifik İstiridye üzerinden aşağı donmuş ve kısmi başarı33ile canlanan bildirilmiştir. Cryobanking da çok çeşitli türler34genetik kaynakları korumak için değerli bir araç olmuştur. B. amphitrite üzerinden bile nauplii dondurucu35hayatta kalmak için rapor edilen ve dondurulmuş aşağı bireylerin % 20’si başarılı bir şekilde cyprids36başkalaşıma bulundu. Ancak, donma kültürlerin uzun vadeli sürdürülebilirlik için uygulama defa değil kabul edilmiştir, ama bu gerçekten seçili satırları bakımı için gerekli olacaktır; Bu sıkıca B. improvisus güçlü bir deniz modelsystem kurulması için önemli bir adım olacaktır.

Burada, bir protokol B. improvisus (yani, cirri, soma ve şömine) yetişkinlerden çeşitli dokularda diseksiyon için sunuldu. Ancak, diğer dokularda da çıkarılan stres. Örneğin, yumuşak doku Bankası membranöz türler Tetraclita japonica formosana dış ve iç manto arasında edilmiş dikkatli bir şekilde izole ve bir RNA çıkarma ve gen ifade37RNA-seq analizi için kullanılır. Burada açıklanan Seviyelendirilmiş en iyi duruma getirilmiş ayıklama Protokolü malzeme başlayan en az bir miktar üzerinden sıralama için yeterli miktarda yüksek kaliteli RNA sağlar. İlk olarak, bireysel larva koleksiyonu homojenizasyon tüpler içine doğrudan herhangi bir kayıp bir tüp transfer sırasında en aza indirir. Ayrıca, farklı yöntemler arasında test, Seramik Boncuklar RNA açısından en verimli verim olduğunu kanıtladı ve dürüst sonication veya havaneli homojenizasyon için karşılaştırıldığında, homojenizasyon. Gen ifadesinin veya genomik deneyler için planlama yaparken, bir kıskaç, yüksek genetik varyasyon meydan en az B. improvisusiçin unutmayın vardır. Barnacle Kodlayıcı bölgeler (Alm Rosenblad vd., yayınlanmamış veri) içinde bile 3-%5, aralıktaki bir genetik çeşitlilik var. Bu, tabii ki, qPCR analiz için astar tasarım belirli talepleri koyar, nerede daha korunmuş bölge tespit ve tutarlı ifade sonuçları betweenbatches almak için astar için şablon olarak kullanılır. Hedef genlerin, korunmuş bölgelerde gibi aquaporins ve Na +/ K + ATPases, RNA-seq veri bireylerin yüzlerce içeren cyprids gruplarından elde Bu genler sıra değişkenliği inceleyerek belirlenebilir. DNA Genom Analizi için örnek. Ancak, B. improvisus yüksek kaliteli DNA alma21zor olabilir.

Sonuç olarak, kurulan barnacle kültür deneysel çalışmalar farklı türde vesile olduğu ispatlanmıştır. Özellikle, larva üretim her yıl çevresinde ezelî varlık mahdut doğal olarak meydana gelen yumurtlama dönemine deneyler için bize izin verir ( B. improvisusiçin yaz aylarında bu). Elde edilen larvaların deneysel çalışmalar, yerleşim deneyleri, davranış deneyleri, belirli genlerin ifade çalışmaları yanı sıra genom-wide transcriptome çalışmaları da dahil olmak üzere geniş bir dizi gerçekleştirmek için kullanılabilir.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu araştırma hibe 2017-04559 İsveçli Araştırma Konseyi (VR) ve AB desteklenen proje SEAFRONT Anders Blomberg tarafından desteklenmiştir. Özellikle, kodlamayla Tesisin kurulması yıllar içinde hibe tarafından başına R. Jonsson aşağıdaki fon acentelerden desteklenmiştir: SSF (İsveç Stratejik Araştırmalar Vakfı) Deniz Bilimleri programı aracılığıyla ve teknoloji ve MISTRA deniz boya programı aracılığıyla. Kent Berntsson culturingfacility kadar ayar erken aşamada vesile oldu. Ek kodlamayla tesisin deniz Evrimsel Biyoloji (www.cemeb.science.gu.se) merkezinden geldi oluşturmak üzere finansman, olduğu İsveçli araştırma konseyleri FORMAS ve VR Linnaeus hibe tarafından desteklenen.

Materials

Plexiglas (poly-methyl methacrylate) panels Plastic produkter, Bromma, Sweden transparent glas
1.5-L PET bottle
Artemia INVE Aquaculture, Belgium We have tested different companies; this is really the best one
Skeletonema marinoi (CCAP strain 1077/5) CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland  strain 1077/5
Chaetoceros simplex var. gracilis (CCAP strain 1085/3) CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland  strain 1085/3
Millipore cartridge filter system Millipore 
cartridge with a nominal pore size of 0.2 µm Millipore  cartridge CWSS01S03 High capacity for large volumes
polycarbonate bottle Nalgene autoclavable
RNA later Qiagen 76106  Fixation solution to preserve RNA
TURBO DNA-free Kit Invitrogen/Thermofisher Scientific   AM1907 DNAse kit to remove DNA from prepared RNA
iScript cDNA Synthesis Kit Biorad 1708890 cDNA synthesis kit
SYBR Green supermix Biorad 1708880 Dye for QPCR
RNeasy minikit Qiagen 74104 RNA extraction of adults or many cyprids
Soft tissue homogenising CK 14, 2 ml tubes Precellys KT03961-1-003.2 Ceramic beads for homogenisation
RNeasy micro kit Qiagen 74004 RNA extraction of few cyprids
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Darwin, C. . A monograph of the sub-class Cirripedia, with figures of all species. The Balanidae (or sessile cirripedes); the Verrucidae, etc., etc., etc. , (1854).
  2. Lind, U., et al. Analysis of aquaporins from the euryhaline barnacle Balanus improvisus reveals differential expression in response to changes in salinity. PLoS ONE. 12 (7), 0181192 (2017).
  3. Lind, U., et al. Molecular characterization of the alpha-subunit of Na+/K+ ATPase from the euryhaline barnacle Balanus improvisus reveals multiple genes and differential expression of alternative splice variants. PLoS ONE. 8, 77069 (2013).
  4. Fyhn, H. J. Holeuryhalinity and its mechanisms in a cirriped crustacean, Balanus improvisus. Comparative Biochemistry and Physiology – Part A: Comparative Physiology. 53 (1), 19-30 (1976).
  5. Wrange, A. L., et al. The story of a hitchhiker: population genetic patterns in the invasive barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus Darwin 1854. PLoS ONE. 11 (1), 0147082 (2016).
  6. Berntsson, K. M., Jonsson, P. R. Temporal and spatial patterns in recruitment and succession of a temperate marine fouling assemblage: a comparison of static panels and boat hulls during the boating season. Biofouling. 19 (3), 187-195 (2003).
  7. Lind, U., et al. Octopamine receptors from the barnacle Balanus improvisus. are activated by the alpha2-adrenoceptor agonist medetomidine. Molecular Pharmacology. 78 (2), 237-248 (2010).
  8. Semmler, H., Hoeg, J. T., Scholtz, G., Wanninger, A. Three-dimensional reconstruction of the naupliar musculature and a scanning electron microscopy atlas of nauplius development of Balanus improvisus (Crustacea: Cirripedia: Thoracica). Arthropod Structure & Development. 38 (2), 135-145 (2009).
  9. Anderson, D. T. . Barnacles – structure, function, development and evolution. , (1994).
  10. Kennedy, V. S., DiCosimo, J. Subtidal distribution of barnacles in Chesapeake Bay, Maryland. Estuaries. 6, 95-101 (1983).
  11. Dreanno, C., Kirby, R. R., Clare, A. S. Locating the barnacle settlement pheromone: spatial and ontogenetic expression of the settlement-inducing protein complex of Balanus amphitrite. Proceedings of the National Academy of Sciences. 273, 2721-2728 (2006).
  12. Rittschoff, D., et al. Cues and context: larval responses to physical and chemical cues. Biofouling. 12 (1-3), 31-44 (1998).
  13. Berntsson, K. M., Jonsson, P. R., Lejhall, M., Gatenholm, P. Analysis of behavioural rejection of micro-textured surfaces and implications for recruitment by the barnacle Balanus improvisus. Journal of Experimental Marine BIology and Ecology. 251 (1), 59-83 (2000).
  14. Gamfeldt, L., Wallén, J., Jonsson, P. R., Berntsson, K. M., Havenhand, J. N. Increasing intraspecific diversity enhances settling success in a marine invertebrate. Ecology. 86, 3219-3224 (2005).
  15. Rittschof, D., Clare, A. S., Gerhart, D. J., Sister Avelin, M., Bonaventura, J. Barnacle in vitro assays for biologically active substances: toxicity and settlement inhibition assays using mass cultured Balanus amphitrite amphitrite Darwin. Biofouling. 6 (2), 115-122 (1992).
  16. Pansch, C., Schaub, I., Havenhand, J., Wahl, M. Habitat traits and food availability determine the response of marine invertebrates to ocean acidification. Global Change Biology. 20 (3), 765-777 (2014).
  17. Guillard, R. R. L., Smith, W. L., Chanley, M. H. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. Culture of marine invertebrate animals. , 22-60 (1975).
  18. Wrange, A. L., et al. Importance of plasticity and local adaptation for coping with changing salinity in coastal areas: a test case with barnacles in the Baltic Sea. BMC Evolutionary Biology. 14, 156 (2014).
  19. Bacchetti De Gregoris, T., et al. Construction of an adult barnacle (Balanus amphitrite) cDNA library and selection of reference genes for quantitative RT-PCR studies. BMC Molecular Biology. 10, 62 (2009).
  20. Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. Why does insect RNA look degraded. Journal of Insect Science. 10, 159 (2010).
  21. Panova, M., et al. DNA extraction protocols for whole-genome sequencing in marine organisms. Methods in Molecular BIology. 1452, 13-44 (2016).
  22. Berglin, M., Larsson, A., Jonsson, P., Paul Gatenholm, P. The adhesion of the barnacle, Balanus improvisus, to poly(dimethylsiloxane) fouling-release coatings and poly(methyl methacrylate) panels: the effect of barnacle size on strength and failure mode. Journal of Adhesion Science and Technology. 15, 1485-1502 (2001).
  23. Larsson, A. I., Granhag, L. M., Jonsson, P. R. Instantaneous flow structures and opportunities for larval settlement: barnacle larvae swim to settle. PLoS ONE. 11, 0158957 (2016).
  24. Toth, G. B., Lindeborg, M. Water-soluble compounds from the breadcrumb sponge Halichondria panicea. deter attachment of the barnacle Balanus improvisus. Marine Ecology Progress Series. 354, 125-132 (2008).
  25. Pansch, C., Jonsson, P. R., Berglin, M., Pinori, E., Wrange, A. L. A new flow-through bioassay for testing low-emission antifouling coatings. Biofouling. 33 (8), 613-623 (2017).
  26. Walne, P. Observation of food value of 7 species of algae to larvae of Ostrea edulis 1. Feeding experiments. Journal of the Marine Biological Associateion of the UK. 43, 767-784 (1963).
  27. Sandnes, J. M., et al. Real-time monitoring and automatic density control of large-scale microalgal cultures using near infrared (NIR) optical density sensors. Journal of Biotechnology. 122 (2), 209-215 (2006).
  28. Neufeldt, C. J., Palmer, A. R. Precisely proportioned: intertidal barnacles alter penis form to suit coastal wave action. Proceedings of the Royal Society B Biological Sciences. 275, 1081-1087 (2008).
  29. Dunstan, G., Volkman, J., Barrett, S., Leroi, J., Jeffrey, S. Essential polyunsaturated fatty acids from 14 species of diatom (Bacillariophyceae). Phytochemistry. 35, 155-161 (1994).
  30. Jonsson, P. R., Berntsson, K., André, C., Wängberg, S. -. &. #. 1. 9. 7. ;. Larval growth and settlement of the European oyster (Ostrea edulis) as a function of food quality measured as fatty acid composition. Marine Biology. 134 (3), 559-570 (1999).
  31. Comps, M., Bonami, J. R., Vago, C. Virus-disease of Portuguese oyster (Crassostrea angulata. lmk). Comptes rendus hebdomadaires des séances de l’Académie des Sciences. Série D, Sciences naturelles. 282, 1991-1993 (1976).
  32. Segarra, A., et al. Detection and description of a particular Ostreid herpesvirus. 1 genotype associated with massive mortality outbreaks of Pacific oysters, Crassostrea gigas, in France in 2008. Virus Research. 153 (1), 92-99 (2010).
  33. Suquet, M., et al. Survival, growth and reproduction of cryopreserved larvae from a marine invertebrate, the Pacific oyster (Crassostrea gigas). PLoS ONE. 9 (4), 93486 (2014).
  34. Martínez-Páramo, S., et al. Cryobanking of aquatic species. Aquaculture. 472, 156-177 (2017).
  35. Anil, A. C., Tulaskar, A. S., Khandeparkar, D. C., Wagh, A. B. Cryopreservation of Balanus amphitrite nauplii. Cryobiology. 34, 131-140 (1997).
  36. Oo, K., et al. Cryopreservation of nauplius larvae of the barnacle, Balanus amphitrite Darwin. Fisheries Science. 64, 857-860 (1998).
  37. Lin, H. C., et al. First study on gene expression of cement proteins and potential adhesion-related genes of a membranous-based barnacle as revealed from next-generation sequencing technology. Biofouling. 30 (2), 169-181 (2014).

Tags

Barnacle Balanus ImprovisusMarine Model OrganismCulturingGene ExpressionLarval EcologyBiofoulingEvolutionary BiologyReceptor-ligand InteractionsAntifouling TechnologiesOsmoregulationRobust ReproductionShort Generation TimeSeawater SupplyFeed ProductionPanel DeploymentJuvenile GrowthSkeletonema MarinoiArtemia Nauplii

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Jonsson, P. R., Wrange, A., Lind, U., Abramova, A., Ogemark, M., Blomberg, A. The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model – Culturing and Gene Expression. J. Vis. Exp. (138), e57825, doi:10.3791/57825 (2018).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image