זיפרגליים Balanus improvisus כמודל ימית - Culturing, ביטוי גנים

1. אוסף של ספחות למבוגרים בשטח כדי להתחיל עם Broodstock החדש פריסת לוחות שקופים תרמופלסטיים (פולי-חומצתי) (110 x 110 x 1.5 מ מ3) ≈ שקטים בתוך 1-3 מ’ עומק כדי לאסוף ספחות למבוגרים מהשדה. משתמשים במסגרות שיכול לקחת מספר פאנלים (איור 2א), לקדוח 2 חורים (בקוטר של 6 מ מ) בפינות העליונה של כל לוח, attachthepanelstotherackusingcableties. לפיכך, thepanelswillhangverticallyin המים. מתי ההתיישבות של ספחות אירעה (שזוהה כנקודות קשיח קטן לבן על הפאנלים), להשאיר הלוחות לפחות 2-3 שבועות לוודא ספחות גדול מספיק (5 מ מ) להעביר למעבדה ללא הגעה יבש או פגום. להביא את הלוחות לתוך המעבדה כאשר הם מכוסים התיישבו improvisus דרב אשר הגיעו בגודל של ca. indiameter 5 מ מ.הערה: הפעם למבוגרים לפתח 5 מ מ בשדה זה תלויים במידה רבה הזמינות של מזון, הטמפרטורה. בדרך כלל זה לוקח כשלושה שבועות במעבדת המחקר הימי Tjärnö (58.87 ° N, 11.14 ° E). הנפוץ ביותר לוחות broodstock החדש בדרך כלל הפרוסות בסוף יוני, שנאספו בסוף אוגוסט. לפני החדרת הלוחות אל המתקן תרבות, לנקות אורגניזמים אחרים בין הפאנלים. חשוב ביותר להסיר מינים אחרים ספחת. אנא שימו לב כי חשוב לנקות לעיתים קרובות הלוחות כדי להיפטר מזהמות מינים במהלך הטיפוח, מאז זה יהיה להגדיל באופן משמעותי את סיכויי ההישרדות של broodstock. במקום הלוחות אנכית על הקצה בדוכן עם חריצים וטוחנים מגש פוליאתילן (400 x 400 x 20 מ מ3) (דמויות 2C ו 2E). החריצים דוכן העדים הם 15 מ מ אחד מהשני. לשם הכנת המגשים, להפוך יציאת הכניסה בבסיס ויציאת יציאה בחלק העליון בצד הנגדי בכל מגש. לחבר את יציאת הכניסה של כל מגש 100 L מאגר המכיל כ 30 לליטר מים עם מעין שקע בחופו של מי ים פתוח ב- 20 ° C כדי לאפשר זרימה דרך בקצב של ca. L 2 לכל מין.הערה: עד 8 מגשי היו מחוברים 100 L מאגר יחיד. להתחבר למאגר 100 L ים מבוקרי טמפרטורה (20 ° C) (למשל, המסופקים על ידי משאבת חום החלפת חום מן המים נכנסות).הערה: הכינוי improvisus דרב יכול גדלים ומתרבים ב מליחות מלא ימית (30 – 35 psu); עם זאת, להפחתת המליחות ל ca. ספק כח 25 על-ידי הוספת מים מתוקים למאגר המים 100 L מגביר את הפלט של הזחלים מתרבות. 2. החל את הדור החדש של מבוגרים מ Cyprids בתרבית לבנות קוביות של לוחות תרמופלסטיים פתוח בחלק העליון על ידי הקלטה 5 פאנלים יחד באמצעות קלטת רעיל, עמיד במים. הכנס את הקוביה מגש קטן (במקרה של דליפה) ולמלא אותו במי ים (25 psu). מאחסנים את המים בטמפרטורת החדר (ca-20 ° C). להוסיף בערך 200 cyprids בחלק העליון של הקוביה. להאכיל את נוער עם 100 מ של Skeletonema marinoi בכל יום אחר (ראה שלב 5) בעוד בקוביה.הערה: ספחות לנוער יכולים להיות קשיים עם בליעת Artemia סאלינה (ראה שלב 3) מכיוון שהן גדול ומכאן שקשה לבלוע במשך ספחת שיוחסו לאחרונה. להחליף את המים 1 x בשבוע. לאחר 2 שבועות, כאשר הלוחות מכילים קטינים מספיק ותיקה לפחות 5 מ מ קוטר, לפרק את הקוביה להעביר את הלוחות עם קטינים המגשים עם זרימה-throughseawater ו, לאחר מכן, להאכיל את ספחות עם הדברים salina א . 3. תרבות של הדברים סאלינה Artemia כמו מזון עבור ספחות למבוגרים להגדיר מערכת culturing עבור salina א באמצעות בקבוק פלסטיק 1.5 ליטר bottomis חתך ואיפה הבקבוק ימוקם הפוך בעמדה, מאוירים מן הצד. להתאים את צוואר הבקבוק צינור סיליקון עם מלחציים ולחבר אותו משאבת לערבב (איור 2D). על מנת בוקעות הביצים, להוסיף כ-15 מיליליטר יבש ביצים מנוחתו של Artemia ofseawater 1 ליטר.הערה: Artemia ביצים הפתח לזחלים nauplius לאחר 24-48 שעות. לעכב את הבקיעה של הדברים salina א (למשל, בסופי שבוע), האור ניתן לבטל כדי להפחית את הטמפרטורה מעט. הקציר Artemia הדברים, לבטל את לערבב, להכהות את החלק העליון של הבקבוק עם רדיד אלומיניום (או דומה למשל, פחית). מאירים שהחלק התחתון של הבקבוק במשך 10 דקות Hatched Artemia הדברים לשחות לכיוון האור. ציסטות סס שאינם ישקעו לתחתית, ציסטה פגזים יצוף על פני השטח. פתח את המלחציים בתחתית. לאסוף את השבר ביניים ככל אוכלוסיה צפופה של הדברים שחייה.הערה: כל יום (למעט בסופי שבוע), 1 ליטר של ההשעיה הדברים Artemia צפופה באופן ידני נוסף למאגר 100 L התחברות המגשים עם ספחות למבוגרים. הימנע כל האכלה עם ציסטה ריק פגזים, מאז הם לא לספק תזונה, בעיקר לגרום צורך לנקות את התרבות במרווחים תכופים יותר. 4. אוסף והגידול של הזחלים זיפרגליים לנקות את הלוחות עם ספחות למבוגרים בהתזה אותם בעדינות עם מים מתוקים, במידת הצורך, הסר כל עכירות ספחת פגזים, לוחות באמצעות מברשת שיניים רכה. כמו כן, לנקות את המגשים (ללא ספחות) ואת צינורות חם (75 ° C) מים מתוקים. מניחים מסננת של 90 מיקרומטר פלנקטון-רשת מודבקים לסוף צינור PVC לחתוך (16 ס”מ בקוטר 15 ס מ גובה) לתוך מגש פוליאתילן (30 x 20 x 10 ס מ3) עם יציאת גלישה. לאסוף את הזחלים improvisus דרב בתוך המסננת למשך הלילה (איור 2C).הערה: המסננת הוצב מתחת היציאה של המגש של הלוחות ספחת כדי לקבל את המים outflowing וכדי לסנן את הדברים. הזחלים נותרו המסננת בזמן ממי הים גלש במגש קטן. מגש קטן זה הבטיחו כי המסננת מעולם לא driedout. הניחו דלי 30 L באמבט מים גדולה שבה הטמפרטורה נשמר בטמפרטורה 26 ° C באמצעות אקווריום דגים טנק תנורים (איור 2E). לערבב ועצבנות מובטח על ידי אוויר-מבעבעים דרך המערכת. למלא את הדלי עם 20 רמות של מי ים מסונן (0.2 µm; כח 25). להוסיף 1 ליטר הדלי של שילוב 60-40 של microalgae צורניות 2, ס marinoi ו ג העדין (ראה שלב 5). זה ייתן של צפיפות הראשונית של בערך 5 x 10 diatoms4 לכל mL בדלי.הערה: ספחת הדברים הזחלים הם phototactic באופן חיובי. הדליים היה עשוי מפלסטיק לבן אטום בשלמותם המאפשרים דרך קצת אור. במהלך החורף, החדר היה מואר בשעות היום (8:00-17:00), אך כהה במהלך הלילה. במהלך הקיץ, האור החיצוני נכנסו לחדר במהלך רוב היום. להעביר את שנאספו improvisus דרב הדברים כדי תבשיל crystallizing (300 מ ל; 90 מ מ בקוטר 50 מ מ גובה). להאיר את המאכל מן הצד, אשר ימשוך את הזחלים למקור אור. לאסוף את הדברים ספחת האוספת את האור הנכנס עם פיפטה להעביר אותם ל תבשיל crystallizing אחר. הסר כל הזחלים Artemia הנותרים. להעביר את הזחלים הדברים improvisus נולד ב- גביע עם 1 ליטר של מי ים מסונן. לספור את מספר הדברים על ידי ערבוב כשהספל בעדינות כדי לקבל על השעיית הזחלים אפילו ולאחר מכן לוקחים את חמש דוגמאות 1 מ”ל ממקומות שונים במיכל. להעביר כל מדגם microplate עבור בדיקה חזותית עם stereomicroscope. לספור את מספר הדברים בכל אחת הדגימות חמש ולהוסיף אותם. הכפילו את המספר שנספרו ב- 200 (1,000 מ של 5 מ”ל) כדי להעריך כמה אלפי הזחלים הם במיכל שלם. אם יש יותר מדי הזחלים nauplius הספל, לדלל את הדגימה עד הצפיפות היא לכל היותר 14,000 הזחלים/L (בדרך כלל בטווח של 11,000 – 12,000 הזחלים/L). להוסיף 1 ליטר של הדברים improvisus דרב דלי אחד, ובכך מוסיף כ- 11,000 – 12,000 הזחלים לכל דלי.הערה: הקפד לא להוסיף עוד הדברים, מאז זה לגרום מזון מעט מדי ביחס הזחלים, לפיכך, להגדיל את התמותה. לאחר 3 ימים, לאסוף את הדברים ספחת על מסננת 90 מיקרומטר. לאחר מכן לנקות את הדלי (עם 75 ° C מים מתוקים) למלא אותו עם מי ים מסונן, להוסיף הזנה צורניות חדשה (אותה כמות כמו בהתחלה), ולבסוף להוסיף את הדברים שוב. Cyprids מתחילים להופיע לאחר כ 6 ימים (± 1 יום). איסוף cyprids קודם עם מסננת 90 מיקרומטר (שתוכנן כמו נקודת 4.2 לעיל). ואז להפריד בין הדברים ספחת moulted ו- cyprids עם מסננת 320 µm על גבי מסננת 160 מיקרומטר. Improvisus דרב הדברים תאסוף 320 µm מסננת, cyprids בתוך המסננת 160 מיקרומטר.הערה: הזחלים cyprid ניתן לאחסן ב 10 ° C בקערה crystallizing בחשכה לשימוש מאוחר יותר, עד ca. 6 ימים. עם זאת, האחסון יכול להשפיע את האיכות והביצועים של הזחלים ספחת, כך ניסויים השוואה בין טיפולים שונים צריך להשתמש באופן אידיאלי הזחלים מאותה אצווה (וזמן דומה אחסון) כדי למנוע תופעות מבלבלים16. 5. תרבות של Microalgae כמו מזון עבור הזחלים Nauplius ספחת הערה: אצות גדלו ב- 3 סוגים שונים של תרבויות: (i) במלאי תרבויות, לתחזוקת לטווח ארוך של זנים היו בשימוש עבור חיסון של שינוי קנה מידה את; (ii) התחל תרבויות, הצעד הראשון הסולם למעלה; סוף סוף (iii) התרבות הפקה, אשר היקף הייצור הסופי כמויות גדולות של אצות כמו ספחת להאכיל. סדר צורניות מינים מן התרבות אוסף של אצות חד-תאיים (CCAP) כדי לשמש להאכיל הזחלים nauplius ספחת. המין 2 Skeletonema marinoi (זן CCAP 1077/5) וגם Chaetoceros סימפלקס var. העדין (CCAP זן 1085/3) לתת תוצאות טובות כמו הזנה. לסנן את כל מי ים כדי לשמש בתרבויות אצה, באמצעות מערכת סינון מחסנית עם גודל הנקבוביות הנומינלי של 0.2 µm. (המים המסוננים הוא גם לשמש את הבקיעה ביצים salina א ולאחר culturing של הזחלים nauplius ספחת). אוטוקלב המים המסוננים על התרבויות אצה (ב 105 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות). היכונו מדיום התרבות של microalgae, שימוש במי ים בלוק מועשר פתרון f/2 של Guillard המכילה חומרים מזינים אורגניים, במתכות, וויטמינים (ראה Guillard 197517 למתכון מפורט). בנוסף, להכין פתרון של סיליקט (נה2SiO3), אבל לשמור את זה לחוד העשרת f/2 כדי למנוע של משקעים מוצק.הערה: ריכוזי הפתרון מניות העשרה הפתרון מניות של סיליקט היו מוכנים לשמש כתוספת 1 מ”ל של כל אחד כדי 1 ליטר של מי ים. אוטוקלב כל הציוד לשימוש בתרבות אצה ב 120 ° C מינימלית 20 אוטוקלב הכתיר בורג מבחנות עם 1 מ”ל של f/2 העשרה, 1 מ”ל של פתרון סיליקט. להוסיף את העשרה ופתרונות סיליקט theseawater כאשר בלוק זכוכית ונוזלים יש התקררה לטמפרטורת החדר. לגדול תרבויות מניות microalgae במבחנות 40 מ”ל עם מזרקי. למלא צינורות הבדיקה כ 30 מ של מי ים מועשר. לחסן את התרבויות עם פיפטה פסטר סטרילי באמצעות כ 1 מ”ל של תרבות מניות 2 בן שבועיים. הכיפה בורג ואז מצויד אך לא התהדקה, כדי לאפשר חילוף הגזים קצת. אם הוא זמין, חיסון צריך להתבצע תוך זרימה שכבתית בארון כדי להפחית את הסיכון של זיהום.הערה: המטרה של התרבויות מניות היא לשמור על תרבויות אצה על בסיס ארוך טווח, כדי לשמש inoculum בשביל להתחיל תרבויות. תרבויות מניות חוסנו מחדש כל שבועיים. לחשוף את התרבות החדשה מניות כדי אור לבן עוצמה של ca. 25-50 µmole ז-2s-1 (עם מחזור בהירה-כהה של h 16:8). להעביר מניות התרבויות הישנות עוצמת אור נמוך כמו גיבוי. למחוק את כל התרבויות מניות 2 בן שבועיים. שינוי קנה מידה לתרבות הייצור של אצות, לחסן את התרבויות התחלה מתרבות מניות, לגדל אותם ב- 500 מ”ל Erlenmeyerflasks. אוטוקלב 4 Erlenmeyer מבחנות, פיפטות פקקים כותנה עם 300 מ של מי ים (0.2 µm) מסוננים ו 4 מבחנות עם mL 0.3 העשרה f/2 ו- 4 עם פתרונות סיליקט. לקרר את העשרת f/2, את סיליקט לטמפרטורת החדר, ולהוסיף את הפתרונות המבחנות Erlenmeyer. לחסן אותם עם ca. 1 מ”ל של התרבות מניות 2 – בן שבועיים.הערה: להכין 2 מבחנות עם ס’ marinoi 2 עם סימפלקס ג. הכניסו המבחנות על שולחן חזק עוצמת האור של 50 µmole m s-2-1. כאשר תרבויות התחלה שרכשו אוכלוסיות צפופות אצה (צהוב-חום בצבע), הם מוכנים לשמש inoculum התרבויות ייצור אשר יספקו שברת את הזחלים עם אוכל. לגדול הייצור תרבויות בבקבוקי פוליקרבונט 4 L עם פקקים סיליקון עם 2 יציאות קדח מצוידים עם צינורות זכוכית. לחבר את מבחנה 1 להגיע לתחתית הבקבוק משאבת אוויר דרך צינור סיליקון מצויד במסנן אוויר 0.2 µm. ודא הקצוות שפופרת זכוכית השנייה מתחת פקק סיליקון מתמלא כותנה כדי לאפשר את יציאת אוויר מוזרקים. בכל שבוע, מילוי 4 4 L בקבוקים עם מי ים מסונן, החיטוי אותם יחד עם פקקים. בנוסף, מבחן אוטוקלב 4 צינורות עם 4 מ”ל של העשרה f/2 פתרונות סיליקט. לאחר קירור, להוסיף את f/2 העשרה והפתרונות סיליקט הבקבוקים, ואז לחסן אותם עם חצי נפח של תרבויות סטארט-אפ המבחנות Erlenmeyer. למקם את הבקבוקים 4 L 4 עוצמת האור של 50 – 100 µmole ז-2s-1. הקציר התרבויות הייצור לאחר ca. שבוע 1; עתה הם צפופים מספיק כדי לשמש להאכיל שברת את הזחלים nauplius.הערה: ייצור התרבויות יש תוחלת חיים כשבועיים, מה שאומר כי ישנם 8 בקבוקים ייצור פעילים בכל עת. 6. עיצוב ניסיוני מחקרים באמצעות ספחות מקום לוחות עם נער או מבוגר ספחות aquaria מבוקרת איפה הם יכולים להיות גדל תחת identicalconditions. זה נקרא ניסוי משותף-גן, אשר, למשל, יכול לשמש כדי להבין adaptions המקומי או פנוטיפית18, או ללמוד שינויים בביטוי גנים ביחס גורמים חיצוניים (למשל, מליחות, טמפרטורה או pH).הערה: זה גם ניתן להשתמש ספחות ישירות שנאספו מהשטח על לוחות. היתרון שבשימוש מעבדה-bred יחידים היא כי ניתן להימנע אפקטים אימהי בעת שימוש הדור הבא של הצאצאים. לחשוף ספחות לתנאים סביבתיים מסוימים במהלך מרווח זמן chosentime, ואחריו קציר של מבוגרים (למשלבמחקרים על ביטוי גנים)2. לניסויים עם הזחלים cyprid ללמוד ביטוי גנים3, מקם את cyprids מבוקרת aquaria איפה הזחלים ניתן לטפח בתנאים זהים. לקצור את cyprids לאחר תקופות זמן שצוין על-ידי סינון עם הנפות (כפי שמתואר בשלב 4.7), ולחלץ RNA לפי הפרוטוקולים להלן (שלב 8). 7. ניתוח ספחות לנקות את המעבדה החלל שבו מתבצעים דיסקציה של דגימת דנ א, bothbefore, בין אנשים, כולל כל כלי ניתוח. פעולה זו מתבצעת באמצעות כלור הספסל (או אתנול 96% עבור המלקחיים).הערה: צינורות שכותרתה המכיל קיבוע מדיה (אתנול או פתרון מייצב RNA) מוכנות מראש. בחר אנשים מורעבים לטווח קצר וגדול (לא להאכיל אותם במשך יומיים לפני הקרע). לנקות את הקליפה ספחת עם מברשת שיניים כדי למזער את הסיכון של זיהום ממינים אחרים (למשל, חיידקים, אצות) ולשטוף עם מים.הערה: הסיבה הרעב לטווח קצר של אנשים לפני הקרע היא כדי למנוע כל זיהום דנ א (למשל, של ציסטות Artemia בבטן). למקם את ספחות בודדים על השטח אפילו, המצורף על פאנל או רופפים בקערה. לנתח את רקמות בהתאמה במבוגר. ישנם מספר דרכים לנתח ספחות, בהתאם למטרת המחקר. שיטת ניתוח ת לתקן את שברת את כל מהר ככל האפשר. הסר את שברת את כל הלוח באמצעות אזמל, הוספתו תחת הכינוי, קרוב לפני השטח לוח.הערה: ברוב המקרים, זו מניפולציה משאיר את הצלחת הבזליים כמעט ללא פגע, ובכך לא משפיע על הכינוי בפנים. בזהירות לפצח את הקליפה החיצונית בצד אחד על-ידי הוספת מלקחיים (איור 3). זה נעשה כדי להקל על החדירה של מדיום fixating בתוך המעטפת.הערה: אם הקליפה לא שבור בכלל לפני הצבת ה”בארנקל במבחנה, זה עלול להוביל תהליך קיבוע איטי יותר ואיכות נחותים של ה-DNA מאוחר יותר. הכניסו ה”בארנקל שבור מבחנה המכילה פתרון אחסון RNA או אתנול. השאירו את שברת את הפתרון עבור פחות 24 שעות ביממה עבור קיבעון שלה. כאשר הכינוי הוא קבוע, החיה ניתן יהיה להוציא את המדיה קיבעון, מניחים על מגש חיתוך. Cirri, מנטל, סומא (גוף) יכולים להיות מופרדים זה מזה, להציב צינורות נפרדת עבור נוסף עקירות של DNA או RNA.הערה: חשוב לבחון אם הביצה lamellae עם הביצים נמצאים בתוך הכינוי. אם היא קיימת, יש להסיר אלה לפני שתמשיך הקוד שיחולץ דנ א כדי להימנע מציאת מרובים אחרים במדגם. דיסקציה שיטה ב’: הסרת את שברת את הקליפה לפני קיבוע שלה.הערה: שיטה זו לא תמיד עלולה להיות שנדגמו מאז שהוא מחובר הפנימי של calcareousshell המעטפת. אבל זה יכול להיות שיטה מהירה עבור דגימת DNA מאדם בודד. הסר בזהירות, באמצעות ניתוח מלקחיים, הלוחות tergal ו- scutal (איור 3) על ידי החדרת הקצה של המלקחיים בין הלוחות tergal, scutal, לתפוס צלחת למשוך בעדינות כדי להסיר אותם. לתפוס החזק של cirri עם מלקחיים, למשוך שברת את ולמקם אותו ישירות ב- 96% אתנול או RNA ייצוב פתרון עבור קיבעון.הערה: לפעמים, המעטפת גם ניתן לטעום בו זמנית, כפי שנראה כמו אפיתל דק עם פיגמנטציה כהה (ב ב improvisus). אחרת, המעטפת יכול להיות הסיר מבפנים של המעטפת באמצעות אזמל והניח, לאחר מכן, אתנול או RNA ייצוב פתרון.הערה: הלוחות tergal ו- scutal (אם שלם) יכול להיות מיובש ונשמר מאז הם שימושיים עבור זיהוי המינים10. המלצה כללית, אם ישנו ספק מינים, היא גם לצלם את שברת את כולו לפני מאתחל את הקרע. 8. RNA חילוץ עבור ה-PCR כמותי מבוגרים במקום שישמש עבור ה-RNA עקירות לתוך RNA ייצוב פתרון, דגירה אותם בן לילה (עד 24 שעות) ב 4 ° C ולאחר מכן לאחסן אותם ב- 80 ° cהערה: Cyprid הזחלים הם מעדיפים יבש קפוא, ללא RNA מאוחר יותר ישירות ב- 80 ° C, על-ידי הצבתם cryotubes ולאחר מכן השוקע הצינורות בקצרה (30 s) בחנקן נוזלי לפני אחסונם ב-80 מעלות צלזיוס. בזמנו את החילוץ RNA, להפשיר את ספחות על קרח, להשתמש בהם ללא פגע או שווייץ הרקמות כדי לשמש (ראה שלב 7).הערה: בשל מגוון גנטי גבוה בין יחידים (≈ 3 – 5% וריאציה של קידוד אזורי; Alm Rosenblad. et al., נתונים שלא פורסמו) רצוי מספר poola של אנשים מבוגרים, אשר מצמצם את ההשפעה של וריאציה רצף בין אנשים בשלב מאוחר יותר qPCR. RNAextraction, הוסיפו µL 350 פירוק המאגר שסופק עם ערכת הכנה RNA לתוך צינורות המגון המכיל 2.8 מ”מ של חרוזים קרמיים.הערה: חרוזי קרמיקה לספק תשואה טובה יותר של RNA בהשוואה sonication (נציג תוצאות). . קח ספחת למבוגרים (כולו או רקמות) או לאסוף מינימום של 20 הזחלים cyprid באמצעות מלקחיים ולשים אותם לתוך צינורות המגון. להמשיך ישירות ההפרעה ואת המגון עם מפעל חרוז. הכניסו הצינורות המגון עם דוגמה, חרוזים בעל טחנת חרוז. לנער אותם עם תדירות של 4.0 m/s מגניב ס’ 20 לדוגמה עבור 1 דקות על קרח. חזור על 2 x. הכינו את הרנ א לפי הפרוטוקול של ערכת זמינים מסחרית של בידוד ה-RNA.הערה: הערכת סיכונים (כולל קריאה של גליונות נתונים בטיחות) צריך להתבצע לפני בשיטות RNA החילוץ, לזיהוי כימיקלים מסוכנים שדורשים שימוש ברדס fume וביגוד מגן אחרים, כולל כפפות (למשל, התוספת של β-mercaptoethanol אל המאגר פירוק במהלך החילוץ RNA צריכה להתבצע בשכונה fume). לכמת את הרנ א. להכין הפתרון עובד, להוסיף תקן ודוגמאות הנפח הכולל של 200 µL. מערבולת אותם עבור 2-3 s דגירה אותם עבור 2 דק הוספה הצינורות לתוך fluorometer ולא את הקרינה. בררו את הדגימות RNA מפושטת חלבון ספקטרופוטומטרים ובדוק תקינות RNA שלהם עם מערכת ממוכנת אלקטרופורזה (נציג תוצאות).הערה: ההכנות באיכות טובה, RNA מומלץ לקיים יחס של 260/280 nm של 2 – 2.2 ו- DNA של 1.8. ערכים נמוכים יותר מצביעים על חלבון מציג כי ההליך החילוץ חייב להיות מותאם. 9. גנים: cDNA סינתזה, qPCR פנקו את RNAwith DNase שהושג כדי להסיר את כל remainingDNA לפני ביצוע של cDNA עבור qPCR. בדוק מזהמות הדנ א על-ידי הוספת דוגמה RNA אבל אין רוורס טרנסקריפטאז בעת הכנת את cDNA. אם יש הגברה PCR של הגן שנבחר על cDNA מבלי רוורס טרנסקריפטאז, אין דנ א מזהמים הרנ א.הערה: לקבלת דוגמאות לשימוש עבור ה-RNA-seq (RNA-רצף באמצעות טכנולוגיית הדור הבא רצפי), השלב DNase הוא פחות קריטי. בפרט, עבור דגימות עם רמות נמוכות של RNA, הצעד DNase עשוי להיות מושמט כדי לא לאבד הרנ א בתהליך יותר מדי. מבצע cDNA סינתזה RNA DNase שטופלו באמצעות כמות של RNA בטווח שצוין cDNA מסחרי סינתזה הערכה, אבל בדרך כלל, שימוש לפחות 50 ng. לעצב תחל qPCR כך הם anneal חלקי הגן עניין שבו זהות רצף בין אנשים לא גבוה ככל האפשר, אך זהות רצף בין גנים paralogs לא נמוך ככל האפשר. ראה את הפרסומים המתאים עבור ספציפיים פריימר-זוגות המשמש ללימודי ביטוי גנים של Na+/K+ ATPase3 ו- aquaporins2 (איור 5).הערה: למטרה זו, ה-RNA-seq רצף נתונים מאות cyprids או מספר מבוגרים יכול לשמש. צבעי יסוד עיצוב גן שישמש עבור נירמול של רמות הביטוי (למשל, אקטין). הן צבעי יסוד משמש בהצלחה אקטין, קדימה: 5′-CATCAAGATCAAGATCATCGC-3′, והוא הפוך: 5′-ATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′.הערה: אקטין הוא גן שליטה בשימוש תכוף. עם זאת, אחרים יש גם כבר הציע כהפניה ובדק את ספחות19. מלבד אקטין, השימוש RPL8, 36B4, EF1 ו NADHd1 כנקודת התייחסות כבר נבדקו3. הוא היה סיכם כי אין הבדלים גדולים של רמות ביטוי של גנים התייחסות בהתאמה בין סומא, cirri, מבוגר או cyprids. למטב את הטמפרטורה מחזק עבור תחל תוכנן על-ידי הוספת כמויות הולכות וגדלות של cDNA (בדרך כלל בטווח של 0.25 – 50 ng) תערובת המכילה SYBR Green, dNTP, פולימראז ו 0.3 מיקרומטר כל של פריימר ואחורה. הפעלת פרוטוקולים qPCR בטמפרטורות שונות מחזק כדלקמן: טמפרטורה דנטורציה הראשונית של 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, צעד דנטורציה ב 95 ° C עבור 20 s, חישול טמפרטורות של 55 – 63 ° C עבור 20 s, על התארכות ב-72 מעלות ל 30 s. בסך הכל, לרוץ 40 מחזורי PCR.הערה: פריימר היעילות שאשקר בטווח של 90-105% ואת מחושבים E = (10^(-1/slope)-1) x 100 שבו השיפוע הוא השיפוע של העקומה המתקבל כאשר התוויית ערך יומן של ריכוז cDNA נגד שלהם ערכי הסף (Ct) של מחזור. לבצע qPCR באמצעות כמות מספקת של cDNA, בדרך כלל 1 – 10 ng, באמצעות פרוטוקול ה-PCR שתוארו בשלב 3 עם הטמפרטורה מחזק אופטימום נמצאו.הערה: הסכום גבוה יותר של cDNA משמש רק עבור גנים באים לידי ביטוי בכמויות נמוכות מאוד.