balane Balanus improvisus comme modèle Marine - culture et l’Expression des gènes

1. collection de balanes adultes dans le domaine de commencer un nouveau stock de géniteurs Déployer des panneaux transparents en thermoplastique (poly-méthacrylate de méthyle) (110 x 110 x 1,5 mm3) à ≈ 1 – 3 m de profondeur en eaux calmes afin de recueillir les balanes adultes du champ. Cadres d’utilisation qui peuvent prendre plusieurs panneaux (Figure 2A), percer 2 trous (d’un diamètre de 6 mm) dans les coins supérieurs de chaque panneau et attachthepanelstotherackusingcableties. Ainsi, thepanelswillhangverticallyin l’eau. Lorsque la colonie de bernaches s’est produite (définis comme des petits points blancs de durs sur les panneaux), laisser les panneaux pendant au moins 2 à 3 semaines pour s’assurer que les balanes sont grandes suffisamment (5 mm) pour être transféré au laboratoire sans avoir séché ou endommagé. Mettre les panneaux en laboratoire lorsqu’elles sont couvertes de sédentaire improvisus b. qui ont atteint une taille de ca. indiameter de 5 mm.NOTE : Le temps pour les adultes à développer à 5 mm dans le champ est fortement tributaire de la disponibilité de nourriture et la température. Normalement, cela prend environ 3 semaines au laboratoire de recherche Marine Tjärnö (58.87 ° N, 11.14 ° E). Le plus souvent, les panneaux pour les nouveaux géniteurs sont généralement déployés à la fin juin et encaissés à la fin du mois d’août. Avant d’introduire les panneaux dans la facilité de culture, nettoyez les autres organismes des panneaux. Il est très important d’enlever les autres espèces de barnacle. Veuillez noter qu’il est important de nettoyer régulièrement les panneaux pour se débarrasser de contamination des espèces au cours de la culture puisque cela augmentera considérablement les chances de survie des géniteurs. Placer les panneaux verticalement sur le bord dans un peuplement avec rainures blanchis dans un plateau en polyéthylène (400 x 400 x 20 mm3) (Figures 2 et 2E). Les rainures dans le peuplement sont distants de 15 mm. Afin de préparer les plateaux, faire un port d’entrée à la base et un port de sortie en haut du côté opposé de chaque plateau. Connectez le port d’entrée de chaque plateau à un réservoir de 100 L, contenant environ 30 L d’eau avec une entrée d’eau de mer ouvert à 20 ° C afin de permettre un cheminement à un taux de ca. 2 L / min.NOTE : Jusqu’à 8 plateaux étaient reliés à un seul réservoir de 100 L. Relier le réservoir de 100 L d’eau de mer à température contrôlée (20 ° C) (p. ex., fournie par une pompe à chaleur échangeant de la chaleur de l’eau de mer entrant).Remarque : La balane improvisus b. peut croître et se reproduire à une salinité de pleine mer (30 à 35 psu) ; Toutefois, réduire la salinité à ca. psu 25 par adjonction d’eau douce dans le réservoir de 100 L augmente la production de larves de la culture. 2. à partir de nouvelles générations d’adultes de cypris cultivées Construire des cubes de panneaux thermoplastiques ouvert sur le dessus de taping 5 panneaux ensemble en utilisant une bande non toxique, résistant à l’eau. Placez le cube dans un petit plateau (en cas de fuite) et remplissez-le avec l’eau de mer (25 psu). Garder l’eau à température ambiante (ca. 20 ° C). Ajouter environ 200 cypris dans la partie supérieure du cube. Nourrir les alevins avec 100 mL de Skeletonema marinoi tous les deux jours (voir étape 5) tandis que dans le cube.NOTE : Balanes juvéniles peuvent avoir des difficultés avec l’ingestion de Artemia salina (voir étape 3) car ils sont gros et, par conséquent, difficiles à avaler pour une balane nouvellement établi. Changer l’eau 1 x par semaine. Après 2 semaines, quand les panneaux contiennent suffisamment établies juvéniles d’au moins 5 mm de diamètre, démonter le cube et déplacez-le avec les juvéniles à plateaux avec écoulement-throughseawater et, par la suite, nourrir les bernaches avec a. salina nauplii. 3. culture de Nauplii d’Artemia salina comme apport pour les balanes adultes Mettre en place un système de culture pour a. salina en utilisant une bouteille en plastique de 1,5 L où le bottomis coupé et la bouteille est placée à l’envers dans un peuplement et éclairée du côté. Monter le goulot d’étranglement dans un tube de silicone avec une pince et l’attacher à une pompe à air (Figure 2D). Afin d’éclore les œufs, ajouter environ 15 mL de sec au repos oeufs d’Artemia à 1 L ofseawater.NOTE : Artemia œufs éclosent en larves nauplius après 24 à 48 h. Pour retarder l’éclosion des nauplies d’a. salina (par exemple, pendant les week-ends), la lumière peut être désactivée pour réduire la température légèrement. Pour récolter les nauplies d’artémias , éteindre l’aération et obscurcir la partie supérieure de la bouteille avec le papier d’aluminium (ou similaires par exemple, une canette)… Allumer que la partie inférieure de la bouteille pour 10 min. Hatched Artemia nauplii nagera vers la lumière. Kystes non éclos vont couler vers le bas, et coquilles de kyste flotteront à la surface. Ouvrez la pince en bas. Recueillir la fraction intermédiaire comme une population dense des natation nauplius.Remarque : Tous les jours (sauf le week-end), 1 L de la suspension de nauplies Artemia dense a été ajouté manuellement dans le réservoir de 100 L connexion aux plateaux avec les balanes adultes. Évitez de nourrir avec les coquilles vides de kyste, car ils ne pas fournir une alimentation et entraîner principalement besoin de nettoyer la culture à intervalles plus fréquents. 4. la collecte et l’élevage de larves Barnacle Nettoyer les panneaux avec balanes adultes par doucement vaporisant d’eau douce et, le cas échéant, retirer tout encrassement de la balane obus et des panneaux à l’aide d’une brosse douce. En outre, nettoyez les plateaux (sans les balanes) et les tubes à chaud (75 ° C) d’eau douce. Placez un tamis constitué d’un plancton-filet 90 µm collé à l’extrémité d’un tuyau de PVC coupé (16 cm de diamètre, 15 cm de haut) dans un bac en polyéthylène (30 x 20 x 10 cm3) doté d’un port de dépassement de capacité. Recueillir les larves de b. improvisus dans le tamis du jour au lendemain (Figure 2C).Remarque : Le tamis était placé juste en dessous de l’orifice de sortie du bac des panneaux barnacle pour recevoir l’eau sortant et de filtrer les nauplies. Les larves sont restés dans le tamis, tandis que l’eau de mer a débordé le petit plateau. Ce petit plateau a assuré que la passoire jamais driedout. Placer un seau de 30 L dans un bain d’eau où la température est maintenue à 26 ° C à l’aide d’appareils de chauffage aquarium poisson réservoir (Figure 2E). Aération et agitation sont assurées par propagation d’air à travers le système. Remplissez le seau de 20 L d’eau de mer filtrée (0,2 µm ; 25 psu). Ajouter 1 L dans le seau d’un mélange 60/40 des microalgues 2 diatomées, S. marinoi et c. gracilis (voir étape 5). Cela vous donnera une densité initiale de diatomées4 environ 5 x 10 / mL dans le seau.Remarque : Les larves nauplius Barnacle sont positivement phototactiques. Les seaux sont faites de plastique blanc opaque avec couvercles qui laissent passer la lumière. Au cours de l’hiver, la pièce était éclairée pendant la journée (08:00 – 17:00), mais sombre pendant la nuit. Au cours de l’été, la lumière extérieure est entré dans la pièce pendant la majeure partie de la journée. Transférer la collecte nauplies d’improvisus b. dans un plat de cristallisation (300 mL ; 90 mm de diamètre 50 mm de hauteur). Illuminer le plat de côté, qui attirera les larves de la source lumineuse. Recueillir les nauplies barnacle qui se rassemblent à la lumière entrante avec une pipette et les transférer sur un autre plat de cristallisation. Supprimer toutes les larves Artemia restants. Transvaser les larves nauplius de b. improvisus dans un bécher avec 1 L d’eau de mer filtrée. Compter le nombre de nauplies en remuant le bécher doucement pour obtenir une suspension même des larves et puis en prenant cinq échantillons de 1 mL de différents endroits dans le bécher. Transférer chaque échantillon dans une microplaque pour une inspection visuelle avec un stéréomicroscope. Compter le nombre de nauplies dans chacun des cinq échantillons et les additionner. Multipliez le nombre compté par 200 (1 000 mL/5 mL) d’estimer combien de milliers de larves est dans le bécher ensemble. S’il y a trop de larves nauplius dans le bécher, diluer l’échantillon jusqu’à ce que la densité est d’au plus 14 000 larves/L (généralement de l’ordre de 11 000 – 12 000 larves/L). Ajouter 1 L de b. improvisus nauplies dans un seau, ajoutant ainsi à peu près 11 000 – 12 000 larves par seau.Remarque : Veillez à ne pas ajouter plus de nauplies, puisque cela sera trop peu de nourriture pour les larves et, par conséquent, augmenter la mortalité. Après 3 jours, recueillir les nauplii barnacle sur un tamis 90 µm. Puis nettoyer le seau (avec 75 ° C d’eau douce), remplissez-le d’eau de mer filtrée, ajouter un nouveau flux de diatomées (le même montant comme au début) et enfin rajouter les nauplies. Cypris commencent à apparaître après 6 jours environ (± 1 jour). Recueillir les cypris tout d’abord avec un tamis 90 µm (conçu comme point 4.2 ci-dessus). Séparer ensuite les nauplies barnacle non mué et cypris avec un tamis de 320 µm sur le dessus de tamis 160 µm. B. improvisus nauplius recueillera dans les 320 µm tamis et cypris dans le tamis de 160 µm.Remarque : La larve cypris peut-être être conservée à 10 ° C dans un plat de cristallisation dans l’obscurité pour un usage ultérieur, jusqu’à ca. 6 jours. Cependant, le stockage peut affecter la qualité et la performance des larves barnacle, donc expériences comparant différents traitements devraient idéalement utiliser des larves du même lot (et les durées de conservation semblables) pour éviter la confusion des effets16. 5. culture de micro-algues comme nourriture pour les larves Nauplius Barnacle Remarque : Les algues ont été cultivés dans 3 différents types de cultures : (i) stock de cultures, qui sont pour le maintien à long terme des souches qui ont été utilisés pour l’inoculation du scaling-up ; (ii) début des cultures, qui constituent la première étape dans l’intensification ; et enfin (iii) la culture de la production, qui est l’échelle de la production finale de grandes quantités d’algues comme barnacle se nourrissent. Espèces de diatomées d’ordre de la Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP) pour servir de nourriture pour les larves nauplius de barnacle. Les 2 espèces Skeletonema marinoi (souche CCAP 1077/5) et Chaetoceros simplex var. gracilis (souche CCAP 1085/3) tous les deux donnent de bons résultats comme aliment pour animaux. Filtrer l’eau de mer tous à utiliser dans les cultures d’algues, en utilisant un système de filtre de cartouche avec une taille de pore nominale de 0,2 µm. (l’eau de mer filtrée est également à utiliser pour l’éclosion des oeufs a. salina et la mise en culture des larves nauplius barnacle.) Stériliser l’eau de mer filtrée pour les cultures d’algues (à 105 ° C pendant 5 min). Préparer un support pour la culture de micro-algues, à l’aide d’autoclavés eau de mer enrichie avec une solution f/2 de Guillard contenant des nutriments inorganiques, oligo-éléments et vitamines (voir Guillard 197517 pour la recette détaillée). En outre, préparer une solution de silicate (Na2SiO3), mais ce séparer de l’enrichissement de f/2 afin d’éviter une précipitation solide.Remarque : Les concentrations de la solution mère de l’enrichissement et la solution de silicate étaient prêts à être utilisés comme une addition de 1 mL de chaque à 1 L d’eau de mer. Autoclave, tout l’équipement utilisé dans la culture d’algues à 120 ° C pour 20 min. Autoclave visse tubes à essai 1 ml d’enrichissement f/2 et 1 mL de solution de silicate. Ajoutez les solutions d’enrichissement et de silicate à theseawater lorsque les verres stérilisés à l’autoclave et les liquides ont refroidi à la température ambiante. Cultiver des cultures mères de microalgues dans des éprouvettes de 40 mL avec bouchons à vis. Remplir les tubes à essai avec environ 30 mL de l’eau de mer enrichie. Ensemencer les cultures avec une pipette Pasteur stérile à l’aide d’environ 1 mL d’une culture de réserve âge de 2 semaine. La capsule à vis est ensuite montée mais pas serrée, afin de permettre des échanges gazeux. Le cas échéant, l’inoculation doit effectuer dans une enceinte à flux laminaire pour réduire le risque de contamination.Remarque : Les cultures mères vise à maintenir les cultures algales sur une base à long terme et pour servir d’inoculum pour démarrer les cultures. Cultures mères ont été re-inoculés toutes les 2 semaines. Exposer la nouvelle culture de réserve à une lumière blanche avec une intensité de ca. 25 – 50 µmol m-2s-1 (avec un cycle lumière-obscurité de 16:8 h). Déplacer les anciennes cultures de stock à une faible intensité lumineuse comme un back-up. Jeter toute cultures mères âgés de 2 semaines. Pour l’intensification de la culture de la production d’algues, ensemencer les cultures de début de la culture de réserve et cultivez-les dans 500 mL Erlenmeyerflasks. Les erlenmeyers autoclave 4, pipettes et bouchons en coton avec 300 mL d’eau de mer filtrée (0,2 µm) et 4 tubes à essai avec 0,3 mL d’enrichissement f/2 et 4 avec des solutions de silicate. Refroidir l’enrichissement de la f/2 et le silicate à température ambiante et ajouter les solutions pour les erlenmeyers. Les inoculer avec ca. 1 mL de la culture 2 – semaine vieux stock.NOTE : Préparez 2 flacons avec S. marinoi et 2 c.simplex. Placer les fioles sur une table vibrante dans une intensité de 50 µmol m-2s-1. Lorsque les cultures de départ ont acquis des populations denses d’algues (brun-jaune en couleur), ils sont prêts à être utilisés comme inoculum pour les cultures de production qui fourniront la balane larves avec de la nourriture. Poussent les cultures de production dans des bouteilles en polycarbonate 4 L avec bouchons en silicone avec 2 port percés et munie de tubes de verre. Se connecter 1 tube en verre pour atteindre jusqu’au fond de la bouteille pour une pompe à air via un tube de silicone équipé d’un filtre à air de 0,2 µm. Assurez-vous que le deuxième tube de verre se termine juste en dessous le bouchon silicone et est rempli avec du coton pour permettre la sortie de l’air injecté. Chaque semaine, remplissage quatre 4 L bouteilles avec autoclave et l’eau de mer filtrée eux ainsi que les bouchons. En outre, le test autoclave 4 tubes avec 4 mL de solutions d’enrichissement et de silicate de f/2. Après refroidissement, ajouter l’enrichissement de f/2 et de la solutions de silicate pour les bouteilles et les ensemencer ensuite avec la moitié du volume des cultures dans les flacons d’Erlenmeyer start-up. Placez les quatre bouteilles de 4 L à une intensité de 50 à 100 µmol m-2s-1. Récolter les cultures de production après ca. 1 semaine ; ils sont alors suffisamment denses pour être utilisée pour alimenter la balane larves nauplius.Remarque : Les cultures de Production ont une durée de vie d’environ 2 semaines, ce qui signifie qu’il y a 8 bouteilles de production active à tout moment. 6. la conception des études expérimentales utilisant des balanes Placer des panneaux avec des balanes adultes ou juvéniles dans les aquariums contrôlés où ils peuvent être cultivés sous identicalconditions. C’est ce qu’on appelle une expérience de jardin, qui, par exemple, peut être utilisée pour comprendre les adaptations locales ou plasticité phénotypique18, ou d’étudier les modifications de l’expression génique par rapport à des facteurs externes (p. ex., salinité, température et pH).Remarque : Il est également possible d’utiliser les balanes directement prélevés sur le terrain sur les panneaux. Un avantage d’utiliser des individus reproducteurs de laboratoire est que les effets maternels pourraient être évités lors de l’utilisation de la prochaine génération de descendants. Exposer les balanes aux conditions environnementales spécifiques pendant un intervalle de chosentime, suivi de la récolte des adultes (par exemple, pour les études sur l’expression génique)2. Pour les expériences larve cypris pour étudier l’ expression de gène3, placez les cypris dans des aquariums contrôlés où des larves peuvent être cultivées dans des conditions identiques. Récolter les cypris après une période de temps spécifiée en filtrant avec des tamis (comme indiqué au point 4.7) et extrayez RNA selon les protocoles ci-dessous (étape 8). 7. dissection des balanes Nettoyer l’espace de laboratoire où la dissection et l’échantillonnage de l’ADN sont exécutées, bothbefore et entre les individus, y compris tous les outils de dissection. Cela se fait à l’aide de chlore pour le banc (ou éthanol à 96 % pour le forceps).NOTE : Les tubes étiquetés contenant des supports de fixation (éthanol ou une solution de stabilisation RNA) sont préparées à l’avance. Sélectionner des personnes affamées grands et à court terme (ne se nourrissent pas eux pendant 2 jours avant la dissection). Nettoyer la coquille de Bernache avec une brosse à dents pour minimiser le risque de contamination des autres espèces (p. ex., bactéries, algues) et rincer avec de l’eau.NOTE : La raison de la famine à court terme des individus avant la dissection consiste à éviter toute contamination de l’ADN (par exemple, d’artémias dans le tube digestif ). Placez les balanes individuels sur une surface plane, soit attachée à un panneau ou en vrac dans un plat. Disséquer les tissus respectifs de l’adulte. Il y a plusieurs façons de disséquer les balanes, selon le but de l’étude. Méthode de dissection A: fixant la balane toute aussi rapidement que possible. Retirez la balane entière du panneau à l’aide d’un scalpel, insérant sous la balane et à proximité de la surface du panneau.Remarque : Dans la plupart des cas, cette manipulation laisse la plaque basale presque intact, n’enlèvent la balane à l’intérieur. Crack soigneusement la coque extérieure d’un côté en insérant des pinces (Figure 3). Ceci est fait pour faciliter l’intrusion d’un support de fixation à l’intérieur de la coquille.Remarque : Si la coquille est cassée pas du tout avant de placer la balane dans un tube à essai, il peut conduire à un processus de fixation plus lent et d’une qualité inférieure de l’ADN par la suite. Mettre la balane cassée dans le tube à essai contenant une solution de stockage de RNA ou l’éthanol. Laissez la balane dans la solution pendant au moins 24 h pour sa fixation. Quand la balane est fixée, l’animal peut être retiré le support de fixation et placé sur un plateau de dissection. Les cirres, manteau et soma (corps) peuvent être séparés les uns des autres et placés dans des tubes distincts pour davantage d’extractions d’ADN ou d’ARN.Remarque : Il est important d’observer si oeuf lamelles avec les œufs fécondés sont présents à l’intérieur de la nonnette. S’il est présent, il doivent être retirés avant de procéder avec les extractions d’ADN pour éviter de trouver plusieurs génotypes dans l’échantillon. Méthode de dissection B: supprimant la balane depuis le shell avant sa fixation.Remarque : Cette méthode peut entraîner pas toujours dans le manteau à échantillonner depuis qu’il est attaché à l’intérieur de la calcareousshell. Mais il peut être une méthode rapide pour prélever l’ADN d’un individu. Retirez soigneusement, en utilisant des pinces de dissection, le tergal et chez les plaques (Figure 3) en insérant la pointe de la pince entre les plaques de tergal et chez, saisissant la main sur une plaque et en tirant doucement pour les supprimer. Grab tenez des cirres avec la pince et tirer la balane directement vers l’extérieur et placez-le directement dans l’éthanol à 96 % ou ARN stabilisant de solution pour la fixation…Remarque : Parfois, le manteau est également échantillonné dans le même temps, comme on le voit comme un épithélium mince avec une pigmentation foncée (en b. improvisus). Sinon, le manteau soit retiré de l’intérieur de la coquille à l’aide d’un scalpel et, par la suite, placé dans l’éthanol ou l’ARN stabilisant de solution.Remarque : Les plaques tergal et chez (si elle est intacte) peuvent être séchés et sauvés car ils sont utiles pour l’ identification de l’espèce10. Une recommandation générale, si il n’y a aucun doute de l’espèce, est aussi photographier la balane entier avant l’initialisation de la dissection. 8. RNA Extraction pour PCR Quantitative Mettre les adultes à utiliser pour les extractions de RNA en un ARN stabilisant de solution, incuber les pendant la nuit (jusqu’à 24h) à 4 ° C et puis les stocker à-80 ° C.NOTE : Larve cypris est préférentiellement sec-congelés, sans RNA plus tard directement à-80 ° C, en les plaçant dans des cryotubes et puis plonger les tubes brièvement (30 s) dans l’azote liquide avant leur stockage à-80 ° C. Au moment de l’extraction de l’ARN, décongeler les balanes sur glace et utilisez-les intact ou disséquer sur les tissus à utiliser (voir étape 7).Remarque : en raison de la forte diversité génétique entre individus (≈ 3 à 5 % de variation dans le codage des régions ; Rosenblad Alm et al., données non publiées), il est conseillé de poola nombre de personnes adultes, ce qui minimise les effets des variations de séquence entre les individus dans l’étape ultérieure de qPCR. Pour la RNAextraction, ajouter 350 µL de tampon de lyse fourni avec un kit de préparation d’ARN dans des tubes d’homogénéisation contenant 2,8 mm de perles en céramique.Nota : Les perles en céramique donnent un meilleur rendement de l’ARN par rapport à sonication (Représentant résultats). Prendre une balane adulte (entières ou en tissus) ou recueillir un minimum de 20 larves cypris avec une pincette et les mettre dans des tubes de l’homogénéisation. Passez directement à la perturbation et l’homogénéisation avec un moulin à billes. Mettre les tubes d’homogénéisation de l’échantillon et de perles dans le porte-Moulin de perle. Agiter les avec une fréquence de 4,0 m/s pendant 20 s. Cool l’échantillon pendant 1 min sur la glace. Répéter 2 x. Préparer l’ARN selon le protocole du kit isolation RNA disponible dans le commerce.NOTE : Une évaluation des risques (y compris une lecture de la fiche de données de sécurité) doit être effectuée avant d’utiliser les méthodes d’extraction d’ARN, d’identifier les substances chimiques dangereuses qui nécessitent l’utilisation d’une hotte aspirante et autres vêtements de protection, y compris les gants (par exemple, l’ajout de β-mercaptoéthanol vers le tampon de lyse pendant l’extraction de l’ARN doit être effectuée sous une hotte). Quantifier l’ARN. Préparer une solution de travail et ajouter une norme et des échantillons à un volume total de 200 µL. Vortex pour 2-3 s et les incuber pendant 2 min. Insérer les tubes dans un fluorimètre et prendre des lectures. Vérifier les échantillons d’ARN pour toute contamination de protéine avec un spectrophotomètre et leur intégrité RNA avec un système d’électrophorèse automatisée (Représentant des résultats).Remarque : Pour les préparations de bonne qualité, RNA est recommandé d’avoir un ratio de 260/280 nm de 2 à 2,2 et un ADN d’environ 1,8. Des valeurs inférieures indiquent des contaminations de protéine et que la procédure d’extraction doit être optimisé. 9. Gene Expression : synthèse de cDNA et qPCR Traiter la RNAwith DNase obtenus pour supprimer toute remainingDNA avant d’effectuer l’ADNc pour qPCR. Vérifiez pour contaminer l’ADN génomique en ajoutant un échantillon de RNA mais aucun transcriptase inverse lors de la préparation de l’ADNc. S’il y a une amplification par PCR du gène sélectionné sur le cDNA fait sans la transcriptase inverse, il y a contamination d’ADN à l’ARN.Remarque : Pour les échantillons à utiliser pour RNA-seq (RNA-ordonnancement à l’aide de la technologie de séquençage de nouvelle génération), l’étape de DNase est moins critique. En particulier, pour les échantillons ayant un faible niveau de l’ARN, l’étape de DNase peut être omise pour ne pas perdre trop de l’ARN dans le processus. Effectuer la synthèse de cDNA sur RNA DNase traités à l’aide d’un montant de l’ARN dans la plage spécifiée dans le kit de synthèse de cDNA commerciale, mais généralement, utilisation au moins 50 ng. Concevoir des amorces de qPCR afin qu’ils recuisent aux parties du gène d’intérêt où l’identité de séquence entre les individus est aussi haute que possible, mais l’identité de séquence entre les gènes paralogues est aussi basses que possible. Veuillez consulter les publications correspondantes pour les paires d’amorces spécifiques utilisées pour les études d’expression de gène de Na+/k+ ATPase3 et aquaporines2 (Figure 5).NOTE : À cette fin, RNA-seq séquence données de centaines de cypris ou plusieurs adultes peuvent être utilisées. Conception des amorces pour un gène à être utilisé pour normaliser les niveaux d’expression (par exemple, l’actine). Les amorces utilisées avec succès pour l’actine sont, vers l’avant : 5′-CATCAAGATCAAGATCATCGC-3′ et vers l’arrière : 5′-ATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′.NOTE : Actine est un gène contrôle couramment utilisés. Cependant, d’autres ont été suggérés comme une référence et testés les balanes19. En plus de l’actine, l’utilisation de RPL8, 36B4, EF1 et NADHd1 comme une référence a été testé3. Il a été conclu qu’il n’y a pas de grandes différences dans les niveaux d’expression des gènes de référence respectifs entre soma, cirres, adulte ou cypris. Optimiser la température de recuit pour les amorces en ajoutant des quantités croissantes d’ADNc (typiquement de l’ordre de 0,25 à 50 ng) à un mélange contenant du SYBR Green, dNTP, polymérase et 0,3 µM de chaque d’apprêt avant et arrière. Exécuter des protocoles de qPCR à différentes températures recuits comme suit : une température de dénaturation initiale de 95 ° C pendant 3 min, une étape de dénaturation à 95 ° C pendant 20 s, recuit des températures de 55 à 63 ° C pendant 20 s et un allongement à 72 ° C pendant 30 s. Au total, effectuez des 40 cycles de PCR.NOTE : Primer efficacité devrait se situer dans une fourchette de 90 à 105 % et sont calculées comme E = (10^(-1/slope)-1) x 100 où la pente est la pente de la courbe obtenue lors du traçage de la valeur de log des concentrations cDNA contre leurs valeurs de seuil (Ct) du cycle. Effectuer qPCR en utilisant une quantité appropriée de l’ADNc, habituellement de 1 à 10 ng, utilisant le protocole PCR décrit à l’étape 3 avec la température de recuit optimale trouvée.Remarque : Le montant le plus élevé de l’ADNc est réservé aux gènes qui sont exprimés en quantités extrêmement faibles.