操纵活细胞构建稳定的3D 蜂窝组件, 无需人工支架

1. 细胞的制备 维持 NAMRU 小鼠乳腺上皮细胞 (NMuMG 细胞) 与5毫升 d-MEM 包含 10% (v) 胎牛血清 (FBS) 和 1% (v) 青霉素-链霉素 (P/S) 在25厘米3烧瓶。移除杜尔贝科的改良老鹰培养基 (d-MEM), 内含 10% FBS 和 1% m/s。 添加3-5 毫升37摄氏度磷酸盐缓冲盐水 (PBS) (-) 到烧瓶。请注意, PBS 的 pH 值为 7.1-7.3。 使用吸气器从烧瓶中取出所有 PBS。 将1.5 毫升的37摄氏度胰蛋白酶 (0.25%, w/v) 添加到烧瓶中。 在37摄氏度的共2孵化器中孵育烧瓶约1-2 分钟。 添加3.5 毫升 D-MEM 包含 10% FBS 和1% 个/秒到烧瓶。移液器混合。 将细胞悬浮液转移到15毫升离心管中, 在室温下离心3分钟。请注意, 离心机的旋转半径和转速分别为 16.6 cm 和 1500 rpm。在这种情况下, 相对离心力为 417 x g。 在吸入培养基后, 将5毫升新鲜 d-MEM (10% FBS 和1% 个/秒) 添加到烧瓶中 (如有必要, 请按照制造商的指示早期细胞冷冻保存液)。 2. 葡聚糖 (DEX) 的制备 通过混合10毫升 d-MEM (10% FBS, 1%P/秒) 和0.8 克 dex, 准备80毫克/毫升的 dex 溶液。请注意, 在细胞培养足够的时间后, DEX 溶液可以用注射器过滤器 (0.22 µm) 进行过滤。 通过混合200µL 的 dex 溶液和200µL 在2.1 中制备的细胞悬浮液, 制备含有40毫克/毫升 dex 培养基的细胞悬浮液。请注意, 溶液中细胞的数量密度约为 2.3×105细胞/毫升。 3. 激光和显微术的制备 打开激光 (连续波, 1064 nm 波长) (图 1a)。请注意, 在红色到近红外区域中使用波长的激光光束最有效;这个波长区域被称为诊断和治疗窗口10 , 因为它是最小的吸收细胞。 双击 “软件” 图标。 双击①相机、②发光二极管 (LED)、③对焦调整和④移动舞台的图标。将显示对应于①④的显示器 (图 1b)。 4. 使用激光陷印系统进行细胞操作 放置20µL 的样品在步骤2.2 上的底部盖玻片 (0.17 毫米厚度, 尺寸 = 30 毫米 x 40 毫米), 并覆盖它与顶盖玻璃 (0.17 毫米厚度, 尺寸 = 18 毫米 x 18 毫米), 由两个间隔 (0.17 毫米厚度的分离提供, 尺寸 = 10 毫米 x 24 毫米), 如图 2所示。请注意, 这些眼镜不需要特殊涂层。 将在步骤4.1 中准备好的样品单元放置在较低物镜上 (水浸泡与钙10微升, 放大 = 60X, 工作距离 = 0.28 mm, 数值孔径 = 1.2))。 连接上物镜 (水浸泡与约10微升, 放大 = 60X, 工作距离 = 2 毫米, 数值孔径 = 1.0) 在样品单元的顶部。 单击图标 2 (图 1b) 打开 LED 指示灯。 通过单击面板 3 (图 1b) 上的图标, 直到对焦为止, 调整样本与较低物镜之间的距离。 通过单击图标 I、II 和 III (图 1B), 在样品的位置1和位置 2 (图 1B) 上照射激光光束。 通过在图标 IV (图 1b) 输入此值, 将每个激光光束的强度设置为 1500 mW。 通过单击图标4指示方向 (图 1b) 移动采样阶段, 直到单元格被困在位置 1 (图 1b)。 拖动光标, 指示位置 2 (图 1b), 直到另一个单元格被困在位置2。 5. 构建3维 (3D) 细胞结构 操作单个单元格, 使其与另一个单元格保持联系。保持300s 的条件;也就是说,每个细胞都暴露在激光300s 上。 记录图 1b中显示的 x-y 轴。 通过捕获并将另一个单元格传输到单元格来构造任意2D 单元格组件。 通过上下移动舞台来构建3D 蜂窝组件。 确认激光关闭后部件保持稳定。