Kleinschalige colorimetrische testen van intracellulaire lactaat en pyruvaat in de Nematode Caenorhabditis elegans
Summary
We beschrijven een gemodificeerde kleinschalige extractie en colorimetrische vitrotests van lactaat en pyruvaat in de nematode C. elegans. Bij gebruik van commerciële assay kits, is de technische ontwikkeling van hun gevoeligheid en nauwkeurigheid belangrijk. Eiwit neerslag in extractie is de meest kritische stap voor de kwantitatieve bepaling van intracellulaire metabolieten.
Abstract
Lactaat en pyruvaat zijn belangrijke tussenproducten van intracellulaire energie metabolische routes. Toezicht op de lactaat/pyruvaat ratio in cellen helpt om te bepalen of er een onbalans in de leeftijdsgebonden energiemetabolisme tussen Mitochondriale oxidatieve fosforylatie en aërobe glycolyse. Hier, laten we het gebruik van commerciële colorimetrische bepaling kits voor lactaat en pyruvaat in de model-organisme C. elegans. Onlangs, de gevoeligheid en nauwkeurigheid van de colorimetrische/fluorimetrische assay kits zijn verbeterd sterk door onderzoek en ontwikkeling olv reagens fabrikanten. De verbeterde reagentia hebt ingeschakeld op het gebruik van kleinschalige tests met een 96-wells-plaat in C. elegans. In het algemeen, is een fluorimetrische assay superieur in gevoeligheid aan een colorimetrische bepaling; de colorimetrische benadering is echter meer geschikt voor het gebruik in gemeenschappelijke laboratoria. Een ander belangrijk punt in deze tests voor kwantitatieve bepaling is eiwit precipitatie van gehomogeniseerde C. elegans monsters. In onze eiwit neerslag methode, gemeenschappelijke neerslagmiddelen (bv., trichloorazijnzuur, perchloorzuur en metaphosphoric zuur) worden gebruikt voor de bereiding van de monsters. Een eiwit-gratis test sample wordt bereid door koude neerslaande (eindconcentratie van 5%) tijdens de homogenisering direct toe te voegen.
Introduction
Lactaat en pyruvaat concentraties worden algemeen beschouwd als tussenproducten van de energie-stofwisseling en zijn gerelateerd aan de Staten van de glycolyse, tricarboxylic acid (TCA) cyclus en elektronentransport keten in de cellen van aerobe organismen. Een reeks reacties in de glycolyse oxideren glucose om pyruvaat, die ligt op een kruispunt van metabole en kan worden geconverteerd naar koolhydraten via gluconeogenese, vetzuren en energiemetabolisme door acetyl-CoA en het aminozuur alanine. De TCA cyclus gebeurt onder de aanwezigheid van voldoende opgeloste zuurstof en is essentieel voor de omzetting van glucose naar energie. Vooral de wijziging van de secundaire metabolisme is een interessant fenomeen waarin glycolyse voornamelijk voor de energieproductie gebruikt wordt en aërobe mitochondriale ademhaling, waarbij de TCA cyclus en het elektronentransport keten, werden in zoogdieren kanker cellen1,2. We toonden onlangs dat de niveaus van lactaat en de daaruit voortvloeiende lactaat/pyruvaat (L/P)-ratio tijdens veroudering in de model-organisme Caenorhabditis elegans (C. elegans daalde). We vonden ook dat de zoogdieren tumor suppressor p53 ortholog CEP-1 in C. elegans een belangrijke rol in de leeftijd-gerelateerde veranderingen van energiemetabolisme door de activering van de transcriptionele doelstellingen3 heeft.
In biologische testen, zoals het meten van lactaat en pyruvaat concentraties in cellen, zijn de gevoeligheid, de nauwkeurigheid, de steekproefgrootte, en de incubatietijd van colorimetrische/fluorimetrische assay kits verbeterd drastisch. Als gevolg van technologische innovaties zijn we nu in staat om te analyseren verschillende metabolieten en intermediaire metabolieten zonder de grootschalige cultuur van C. elegans, dat is moeilijk gezien de kleine omvang. In het algemeen, is de gevoeligheid van een colorimetrische bepaling een orde van grootte kleiner dan die van een fluorimetrische assay; de colorimetrische benadering is echter meer geschikt in de instelling van gemeenschappelijke laboratoria. Bovendien, een techniek van de extractie met homogenisering en eiwit neerslag is van cruciaal belang voor de kwantitatieve bepaling van de concentratie van lactaat en pyruvaat in C. elegans cellen omdat deze nematode is ingesloten in een exoskelet genaamd de cuticle, in tegenstelling tot zoogdieren gekweekte cel lijnen4,5. Hier beschrijven we een protocol voor het analyseren van lactaat en pyruvaat concentraties werken met commerciële colorimetrische bepaling kits inclusief tips voor monster extractie van C. elegans.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bij gebruik van deze colorimetrische bepaling kits, is de meest kritische stap in monster extractie te detecteren van cellulaire lactaat en pyruvaat nauwkeurig in C. elegans het proces van eiwit neerslag tijdens homogenisering (Figuur 1). Het is niet strikt noodzakelijk is om het gebruik van een Teflon-homogenizer, als andere homogeniseerders (bijv., Dounce en tapered weefsel slijpmachines, of kraal molens) zijn ook geschikt voor de kleinschalige winning van wormen. We did …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd financieel ondersteund door een speciale subsidie van het onderzoek van de Daito Bunka universiteit naar Sumino Yanase.
Materials
| Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit | BioVision | #K607-100 | colorimetric/fluorimetric 100 assays; Store at -20oC |
| EnzyChrom Pyruvate Assay Kit |
BioAssay Systems |
#EPYR-100 | colorimetric/ fluorometric 100 assays; Store at -20oC |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | colorimetric assay; store at room temperature |
| Trichloroacetic Acid | Wako Pure Chemical | #207-04955 | store at room temperature |
| Teflon homogenizer | Iwaki/Pyrex | #358034 (Wheaton) | Instead of Iwaki/Pyrex, available by Wheaton |
References
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Matoba, S., et al. p53 regulates mitochondrial respiration. Science. 312, 1650-1653 (2006).
- Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans. Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , (2007).
- Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T., Epstein, H. F., Shakes, D. C. Basic culture methods. Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , 3-29 (1995).
- Senoo-Matsuda, N., et al. A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).
- Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants. Aging Cell. 12, 130-138 (2013).
- Marbach, E. P., Weil, M. H. Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant. Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).
- Mishur, R. J., et al. Mitochondrial metabolites extend lifespan. Aging Cell. 15, 336-348 (2016).
