Culture de tissus ovariens pour visualiser les phénomènes dans les ovaires de souris
Summary
Les cultures de tissus ovariens peuvent être utilisés comme modèles de l’atrésie folliculaire développement, ovulation et follicule et indiquer les mécanismes de régulation de processus ovariens dynamiques.
Abstract
Chez les mammifères femelles ovulent périodiquement un nombre d’ovocytes presque constant au cours de chaque cycle oestrus. Pour soutenir cette régularité et la périodicité, la régulation se fait au niveau de l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique et sur le développement de follicules dans l’ovaire. Malgré des études actives, les mécanismes de développement folliculaire ne sont pas claires, en raison des plusieurs étapes de l’activation de dormance follicule primordial à l’ovulation et la complexité de la réglementation qui diffère à chaque phase folliculaire. Afin d’étudier les mécanismes de développement folliculaire et la dynamique des follicules au cours du cycle oestral, nous avons développé un modèle de culture de tissus ovariens de souris qui peut être utilisé pour observer le développement folliculaire à l’aide d’un microscope. Développement systématique de follicule, l’ovulation périodique et l’atrésie folliculaire peuvent être reproduits dans le modèle de l’ovaire cultivées, et les conditions de culture peuvent être modulées de façon expérimentale. Ici, nous démontrons l’utilité de cette méthode dans l’étude des mécanismes de régulation du développement folliculaire et d’autres phénomènes ovariennes.
Introduction
Ovaires de souris femelles contiennent plusieurs milliers de follicules1, et l’ovulation périodique mûrit environ dix ovocytes à chaque cycle oestrus. Follicules sont classées en plusieurs stades de développement : primordial, primaire, secondaire, antre et follicules de Graaf, selon la forme de la couche cellulaire de la granulosa entourant chaque ovocyte. La plupart des follicules primordiaux sont en dormance, et certains d’entre eux sont activent et se développer dans les follicules primaires à chaque cycle oestrus2. Après la phase folliculaire secondaire, le développement folliculaire est principalement régie par gonadotrophines, folliculaires stimulante (FSH) et l’hormone lutéinisante (LH). Cependant, développement du follicule primordial et primaire est indépendant de gonadotrophine et les mécanismes de régulation qui régissent ces étapes restent mal inderstood3,4,5. En plus de facteurs de croissance et les hormones, le follicule primordial et primaire est régi par les interactions entre les follicules6,7. Donc, nous avons effectué des analyses de la dynamique du follicule dans les tissus de souris ovaire et a étudié les mécanismes de régulation associés à l’aide de cultures de tissus ovariens8,9,10.
Ici, nous présentons deux méthodes de modèle de culture de tissu ovarien. Le premier est utilisé pour analyser le développement folliculaire par mesure des zones folliculaires, et le second est utilisé pour étudier le mécanisme de régulation au début du développement folliculaire de primordiale au stade de follicule secondaire avec des souris transgéniques. Pour l’analyse du développement folliculaire, nous avons utilisé principalement ovaires de souris femelles 4 – semaine vieux parce qu’ils permettent de faciliter la visualisation des follicules. Pour induire l’ovulation périodique et élaboration d’un modèle in vivo follicule, nous avons reproduit de LH et l’ovulation observée, l’atrésie folliculaire et la sécrétion d’estradiol dans des conditions de culture de tissus. Images des ovaires cultivées ont été capturés, et les processus de développement du follicule ont été analysées par des changements de traçage dans la région folliculaire. Toutefois, dans les analyses de champ lumineux de la microscopie, la distinction entre les follicules primaires primordiales et au début n’était pas claire. Ainsi, nous avons développé une méthode pour détecter les petits follicules et faire la distinction entre le primordial, principal, et follicule secondaire en culture des tissus ovariens à l’aide de Oogenesin1 pro3 (Oog1). 9 et les ovaires de souris transgéniques R26-H2B-mCherry 0 et 4 jours après la naissance,11. Oog1 expression est détectable dans les ovocytes après l’entrée en méiose et augmente progressivement avec le développement du follicule, permettant l’observation de la transition de primordial à follicules primaires en utilisant des images de Time-lapse du tissu de l’ovaire cultivées11 ,,12. Même si les méthodes morphologiques ont servi à étudier les facteurs qui activent des follicules primordiaux dormants13,14,15,16, développement physiologique de follicules dans les ovaires est difficile à observer, et les effets de divers facteurs restent indéterminés. Les méthodes actuelles de culture ont été conçus pour répondre à cette pénurie en temps réel des analyses de facteurs de la cible.
Dans la présente étude, nous avons suivi le développement folliculaire à l’aide d’une méthode d’imagerie Time-lapse et caractérisé le processus du développement folliculaire. Nos nouvelles méthodes offrent un outil sans précédent pour l’étude de la physiologie des ovaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, nous avons développé deux nouvelles méthodes pour l’étude de développement folliculaire dans les ovaires de souris. La première méthode consiste en l’élevage des tissus en tranches ovarienne chez la souris adulte suivie d’analyses du développement folliculaire, et la seconde implique l’utilisation de Time-lapse d’imagerie afin de visualiser le développement folliculaire précoce pendant la phase de gonadotrophine indépendant. Auparavant, nous avons utilisé la méthode de culture d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Naojiro Minami (Université de Kyoto) pour fournir les souris Oog1pro3.9 . Cette recherche a été financée par la SJPS (KAKENHI # JP15H06275) et la Fondation de Nitto.
Materials
| Follicle stimulating hormone from human pituitary | SIGMA | F4021 | |
| Lutenizing hormone from equine pituitary | SIGMA | L9773 | |
| Penicillin-streptomycin solution | Wako Pure Chemical Industries | 168-23191 | |
| MEM a, GlutaMax, no nucleotides | Thermo Fisher | 32561037 | |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-0-10-C | 35mm dish, No. 0 coverslip, 10mm glass diameter |
| Millicell cell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Diameter: 315 mm, pore size: 0.4 mm, material: hydrophilic PTTE |
| 3.5cm cell culture dishes | greiner bio-one | 627160 | |
| 50ml / centrifuge tube with triple seal cap | IWAKI | 2345-050 | |
| Low-profile disposable blades 819 | Leica | 14035838925 | |
| LSM 710 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
| CellVoyager, CV1000 | Yokogawa Electric Corporation | Time-lapse imaging | |
| BZ-X700 | KEYENCE | Time-lapse imaging |
References
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