Birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokusundan izole etmek için basit ve etkili bir yöntem
Summary
Burada birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokularının üzerinden verimli bir şekilde ayırmak için bir protokol mevcut. Bu yöntem geleneksel yordamı ROCK inhibitörü Y-27632 aşılama ortamda kendiliğinden dermal hücrelerden epidermal hücrelerin ayırarak basitleştirir.
Abstract
Taze cilt dokularının ve kendi genişleme vitro izole birincil insan Lenfositi yaygın olarak laboratuvar araştırma ve klinik uygulamaları için kullanılmaktadır. İnsan Lenfositi geleneksel yalıtım yöntemi nedeniyle düşük hücre kurtarma hızı ve düşük hücre yetişkin dokulara gelen primer hücre oluşturmak için verimsiz olduğu kanıtlanmış bir iki adım sıralı enzimatik sindirim yordamı içerir canlılığı. Biz son zamanlarda Orta Rho kinaz inhibitörü Y-27632 kullanan insan birincil epidermal progenitör hücrelerin cilt dokularının yalıtmak için gelişmiş bir yöntem bildirdi. Geleneksel iletişim kuralı ile karşılaştırıldığında, bu yeni yöntem daha basit, daha kolay ve daha az zaman alıcı ve epitel kök hücre verim artar ve kök hücre özellikleri geliştirir. Ayrıca, yeni metodoloji dermis epidermis ayrılması does değil istemek ve, bu nedenle, farklı türdeki yetişkin doku hücreleri yalıtmak için uygundur. Bu yeni yalıtım yöntemi geleneksel yöntemlerle önemli eksiklikleri üstesinden gelir ve daha yüksek güç için laboratuar ve klinik uygulamalar için ile çok sayıda epidermal hücre üretmek için uygundur. Burada, yeni yöntem ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
Introduction
Amaç birincil insan keratinositler (HKCs)–dan yetişkin dokular, özellikle klinik uygulamalar için yalıtmak için basit ve etkili bir iletişim kuralı geliştirmekti. Cilt epidermal kök hücreleri, deri, bazal tabaka içinde lokalize çoğalırlar ve ayırt etmek ve cilt1,2,3, fonksiyonlarını korumak için Lenfositi sağlamak için yüksek bir potansiyele sahip 4. deri dokuları yaygın cilt doku mühendisliği ve yenilenme amacıyla kullanılan, özellikle hasarlı cilt onarım ve gen tedavisi için klinik uygulamaları5,6izole HKCs. Önemli HKC tabanlı uygulamalar için etkili bir şekilde izole ve HKCs çok sayıda yüksek potansiyel vitro7,8ile genişletin konudur. Çeşitli araştırma grupları kök benzeri HKCs kültürleri üretmek için yöntemler geliştirdik, bu yöntemler bazen düşük hücre verimleri ve cilt numune türü tarafından sınırlı olmak gibi diğer kısıtlamalar bulunmaktadır ve gerçekleştirmek karmaşık ve zaman alıcı olmakla birlikte 9kullanılır. Örneğin, HKCs cilt dokularının yalıtmak için geleneksel yöntem iki aşamalı enzimatik sindirim epidermis bir ayırma DermIS6ile karıştırmak. Bu yöntem genellikle de yenidoğan dokular için çalışıyor, ama yetişkin doku hücreleri izole etmek için kullanıldığında çok zor olur.
Y-27632, Rho ilişkili protein kinaz (kaya), bir inhibitörü bildirilmiştir önemli ölçüde epidermal kök hücre izolasyon ve koloni büyüme10,11,12verimliliği artırmak için. Bir önceki çalışmada, keşfettiğimiz Y-27632 epidermal hücrelerin klonal büyümesini kolaylaştıran ama differentially adezyon molekülleri13ifade kontrol ederek deri hücreleri verimini azaltır. Ayrıca büyüme ve verim birincil epidermal hücre destekler G-Orta adı verilen yeni bir şartına aşılama orta kurduk. G-Orta Y-27632 ile birleştirerek, bu roman yöntemi kendiliğinden böylece epidermis-DermIS ayrılık13,14adım kaldırma enzim sindirim sonra epidermal ve dermal hücreleri ayırabilirsiniz. Önceki raporlara dayanarak, biz şimdi detaylı HKCs yetişkin cilt dokusundan ayırmak için bu yeni yöntemin açıklayınız.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kültürlü birincil HKCs yaygın olarak fazla üç yıl için klinikler yaraları tedavi etmek için kullanılan ve o zamandan beri her zaman verimli bir şekilde zamanında yeterli sayıda klinik uygulamaları için hücre elde etmek önemli olmuştur. Bu nedenle, uygulamada, dermis epidermis ayrılması gerektirir, geleneksel yalıtım yöntemini hücrelerin ve yetişkin hücreleri geçiş yeteneği düşük düşük verim nedeniyle bu talepleri karşılamak zor olur. Burada, verimli bir şekilde HKCs için laboratuar…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser ulusal anahtar araştırma ve geliştirme programı Çin (2017YFA0104604), Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı, Çin’in (NSFC, 81772093), Genel Program tarafından desteklenmiştir bilim ve Suzhou teknoloji geliştirme programı (ZXL2015128), Jiangsu Eyaleti doğal Bilim Vakfı (BK20161241) ve Shandong Taishan Scholar Ödülü (tshw201502065).
Materials
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| Electronic Scale | Harbin Zhonghui | 1171193 | For tissue weighing |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Epidermal cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HKC dissociation |
| 0.25% Trypsin | Beijing Solarbio Science & Technology | T1350-100 | For HKC dissociation |
| Coating Matrix Kit | Life Technologies | R-011-K | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HKC isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HKC isolation |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | 9003-98-9 | For HKC isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Thermo Scientific | NC9864731 | cell proliferation and cytotoxicity assays |
| Mouse Anti-Human Cytokeratin5 | Hewlett-Packard Development Company | MA-20142 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Rabbit Anti-Human Loricrin | Covance | PRB-145p | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts |
| Integrin α6(GOH3) | Santa Cruz | SC-19622 | flow cytometry analysis of HKCs |
| Rat IgG2a FITC | Santa Cruz | SC-2831 | negative control antibody of α6-integrin in flow cytometry analysis |
References
- Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
- Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C. Development and homeostasis of the skin epidermis. Cold Spring Harbor Perspectives in BIology. 4 (7), a008383 (2012).
- Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. C. Epidermal stem cells – role in normal, wounded and pathological psoriatic and cancer skin. Current Stem Cell Research & Therapy. 3 (2), 146-150 (2008).
- Blanpain, C., Fuchs, E. Epidermal stem cells of the skin. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (22), 339-373 (2006).
- Guo, Z., et al. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (S1), S2 (2013).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Bayati, V., Abbaspour, M. R., Neisi, N., Hashemitabar, M. Skin-derived precursors possess the ability of differentiation into the epidermal progeny and accelerate burn wound healing. Cell Biology International. 41 (2), 187-196 (2017).
- Hirsch, T., et al. Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells. Nature. 551 (7680), 327-332 (2017).
- Hentzer, B., Kobayasi, T. Separation of human epidermal cells from fibroblasts in primary skin culture. Archiv für dermatologische Forschung. 252 (1), 39-46 (1975).
- Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
- Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
- Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), e1251-e1255 (2018).
- Zou, D., Pan, J., Zhang, P., Wu, X. A new method to isolate human epidermal keratinocytes. Journal of Clinical Dermatology (in Chinese). 6, 424-429 (2016).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin). Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
- Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (4), 328-340 (2005).
- Breyer, J., et al. Inhibition of Rho kinases increases directional motility of microvascular endothelial cells. Biochemical Pharmacology. 83 (5), 616-626 (2012).
- Wozniak, M. A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. Focal adhesion regulation of cell behavior. Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).
