细胞法检测酶替代疗法中细胞吸收的抗体

人的矩阵是从商业来源购买的, 经其机构审查委员会批准, 但应视为潜在的传染性。确保实验室环境使用维护安全文化12。 1. 在开始化验之前 根据制造商的说明, 准备链亲和素磁性微珠13。 准备质量控制样品 (QCs): 在特定物种的基质 (例如, 汇集脑脊液或血清) 中, 将阳性控制抗体 (如, a) (例如, a) 钉在一起。注: FDA 和均线指导建议准备一个高和低 QC 的化验验证和例行测试1,14。 例如, 要获得10µg/毫升的 QC, 将10µL 1 毫克/毫升的股票阳性控制量增加到990µL 的相关基质 (如CSF), 总容积为1000µL。 整除在一个适合单一用途的体积 (例如, 50 µL) 的 QC 样品, 并冻结整除数在-60 到-80 摄氏度1。 整除一个切点控制 (CC), 物种特异矩阵没有处理的测试文章 (如汇集脑脊液或血清) 为单一用途 (例如, 50 µL) 和冻结整除数在-60 到-80 摄氏度1。 根据制造商的15号协议, 使用蛋白质标签试剂盒, 在荧光和反应器之间进行共轭响应。整除在一个适合单一用途的体积 (例如, 50 µL) 和冻结整除数在-60 到-80 摄氏度。 2. 1 天: 细胞电镀和样品制备 细胞板制备 使用组织培养罩, 并保持无菌环境的以下步骤。喷雾每一个对象, 将放置在引擎盖与70% 乙醇和保持一个干净的环境16,17,18。 温暖细胞生长培养基 (例如, RPMI-1640 与10% 胎牛血清和1% 青霉素-链霉素) 在水或珠浴在37摄氏度19。 将人 T 淋巴细胞 Jurkat 细胞和板100µL 每井在 7.5 x 105细胞/毫升的 96-井圆底细胞培养板, 适合使用的流动细胞仪配备了板式装载机。 例如, 使用 hemocytometer 或自动单元格计数器计算单元格20、21。 确保细胞在进行实验前至少有70% 的生存能力 (例如, 评估与台盼蓝染色的可行性)17。 在一个37°c 孵化室孵化的细胞与 5% CO2和95% 湿度过夜 14–20 h。 筛选样品准备 使用无血清的培养基 (如RPMI-1640) 稀释实验对象或测定对照样品。在这里的例子方法, 稀释样品 1:2. 5 在 RPMI-1640 通过增加60µL 样品到90µL 无血清的媒介。(例如, 8 条带管)。继续步骤3.1 以进行化验, 准备荧光标记的治疗方法。注: 1:2. 5 的稀释是经过实验确定的, 对于这里提出的方法是最佳的。应为每个开发的方法确定最佳样品稀释。 确认珠和样品制备 计算验证样品所需的微球共轭珠的数量。 例如, 对于10个样本, 请使用10个样本 x 100 µL, 每个样本 + 30% 额外的共轭珠, 以弥补在洗涤步骤中的任何损失 = 1300 µL-共轭珠。 把珠子彻底涡旋。将计算出的珠子数添加到15毫升锥形管中进行洗涤。 通过添加1300µL 的耦合缓冲器或由制造商建议的 (例如, 磷酸盐缓冲盐水与0.1% 吐温 20), 在13以下的步骤洗涤。 彻底涡流管。将管置于磁性管架中2分钟。在不干扰珠子的情况下, 小心地吸入并丢弃上清。注意: 当珠子被拉到磁铁上时, 溶液将从暗褐色变成透明。 并用重悬1300µL 耦合缓冲器的珠子。重复洗涤步骤, 共四洗涤。 最后一次清洗后, 将珠子悬浮在1300µL 的耦合缓冲器中 (以前在步骤2.3.1.1 中计算)。根据板材图 (例如, 每个样品或 QC 的一个证实的好, 每井加100µL 到一个96井, 白色, 圆底, 无粘结聚丙烯板材). 当与荧光标记的应急检测表一起孵化时, 该样本将被分割为重复项。 把盘子放在96井边的磁铁上, 让珠子形成小球。小心地吸清清液并丢弃。注: 解决方案将从暗褐色转到清除后, 在侧面掠过磁铁约最小。得到的珠子被称为 “干” 珠。 如果样品筛选阳性, 并被确认, 添加100µL 的每个样品与和没有反应反应-共轭珠进入适当/分配好。用塑料薄膜封住盘子, 在室温 (RT) 大约 800 rpm 的旋转振动筛上晃动至少60分钟。注: 以前准备和冻结的积极和负 QCs 和 CC 应包括在每一个板块。 孵化后, 将验证板放在96井侧掠过的磁铁上, 允许珠子形成小球。 滴度稀释系列制剂 要准备一个效价系列, 连续稀释样品在汇集的矩阵足够的次数, 以跨越预定的效价削减点1。 例如, 将30µL 的样本混合到1:3 稀释系列中60µL 的共用矩阵, 总共为8稀释 (例如, 8 条带管)。继续步骤3.1 以进行化验, 准备荧光标记的治疗方法。 3. 1 天: 化验程序 在无血清培养基 (例如, 60 µL, 或大约6毫升/盘) 中制备荧光标记的酶。 例如, 要准备10毫升1µg/毫升荧光标记的酶, 添加10µL 的股票1毫克/毫升荧光标记为9.99 毫升无血清介质 (例如, RPMI-1640)。 在一个新的孵化板 (例如, 96 井, 白色, 圆底, 无粘结聚丙烯板), 添加从步骤 2.2, 2.3, 或2.4 和一个荧光标记的, 在一个1:1 混合物中的重复井 (例如, 每个µL 转移60的样本) 的准备样品准备样品, 并添加60µL 的荧光标记的每井)。注:图 1提供了一个示例实验板图。 图 1: 实验板布局的示例.样品和一个荧光标记的应急检测在2–8°c 过夜。对 HQC、低质量控制 (LQC) 和负质量控制 (NQC) 等控制进行了筛选, 并在板的相对角上进行了确认, 以评估板材的均匀性。请单击此处查看此图的较大版本. 用多通道吸管将样品和荧光标记的吹打进行多次混合。包装在箔板和孵化他们过夜在2–8°c 为 14–20 h。 4. 2 天: 将准备好的样品添加到单元格中 从2–8°c 的孵化处取出样品孵化板, 并将其放在37摄氏度的珠浴中, 加热盘子, 10–15分钟。 从 CO2孵化器中取出单元格。使用倒置显微镜对所镀细胞进行目视检查, 以确保细胞看起来健康, 并均匀分布在水井17,19。 根据实验板图, 将先前混合样品的100µL 和荧光标记的应急传感器添加到细胞板上。 将电池板与添加的样品放回 CO2孵化器在37°c。将盘子孵化3小时, 15 分钟。注: 这一次是在实验室建立的, 作为最佳的信号-噪声反应的检测。 在14–18°c 的台式离心机中, 将电池板离心6分钟, 在 320 x g处。确认在板井底部有一个细胞颗粒的存在。 用30–45°的角度握住盘子。小心地从每个井中取出上清, 不干扰细胞颗粒。在每个井中添加200µL 1x DPBS 到细胞颗粒中并用重悬细胞。 重复细胞洗涤步骤, 共3洗涤。立即对步骤5进行细胞活力染色。 5. 2 天: 细胞活力染色 使用多通道吸管, 添加100µL 的工作溶液的1x 活/死染色的每一个井, 选择的发射波长不同的荧光标记的应急和准备根据制造商的指令22。 在黑暗中在 RT 中孵化出15分钟的盘子。在14–18°c 的台式离心机上, 将板材离心6分钟, 在 320 x g处。 小心地从每个井中取出上清, 不干扰细胞颗粒。用 1x DPBS 清洗细胞1x。 6. 2 天: 用1% 多聚甲醛固定细胞 使用多通道吸管, 在每个井中分配100µL (在2–8°c) 1% 多聚甲醛 (粉煤灰)。 密封板, 轻轻脉冲涡混合。把盘子裹在铝箔上, 放在2–8°c 至少10分钟, 以便固定。注意: 小心避免溅到印版上。 在分析之前, 使用多通道吸管在每个井中添加50µL 1x DPBS。 7. 流式细胞仪 将盘子放在流式细胞仪上, 并将其运行。 使用流式细胞仪软件获取和记录测量的中值荧光强度 (多边基金会) (见材料表)。注: 请参见图 2作为加载程序设置的示例。本试验优化了样品流速、试样体积、混合体积、混合速度和混合数量。这些标准可以用 “向上箭头” 或 “向下” 按钮在每个标准的数字旁边调整, 具体取决于流式细胞仪采集软件23。 图 2: 流式细胞仪加载器设置的示例.加载器设置应针对每个已开发的检测进行优化。请单击此处查看此图的较大版本. 创建一个细胞仪分析/闸门/地块, 如图 3所示。注: 每个流式细胞术软件23的门的创建和应用可能会有所不同。 图 3: 流式细胞术门策略.Jurkat 细胞与总事件分离, 通过绘制正散射 (FSC)与侧向散射 (SSC) 通道并在目标种群周围绘制一个门来收集。汗衫 (单细胞) 与双峰或更大的细胞聚集使用 fsc 区域 (fsc A) 和 fsc 高度 (fsc H) 通道分离。活细胞被选择的门对单线细胞阴性的活性染色。在单、活 Jurkat 细胞中测定了中值荧光强度, 并绘制成直方图。用药物吸收阻断的细胞 (如HQC) 和具有控制摄取量的细胞 (分别为红色和蓝色) 的多药电池值显示。请单击此处查看此图的较大版本. 从分析中排除死细胞, 并记录大约1万事件23。 8. 数据分析 将数据 (原始的多边化) 导出到分析软件 (见材料表)。注意: 根据所需的分析, 可以使用分析软件执行以下数据分析。 计算重复井 (QCs 和样本) 的平均多边化和变异系数 (%CV), 以评估重复值的分布变异性。 对于在检测中筛选的样品和 QCs, 计算出相对于 QCs 池矩阵 CC 的平均%SI 的百分比信号抑制。 如果需要, 请计算已确认的 QCs 和相对于相应屏幕值的示例的恢复比率 (rr)。