JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Génétique

Één molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie (smFISH) analyse in Budding vegetatieve groei van gist en meiose

Published: May 25, 2018
doi:
10.3791/57774
, ,
1Department of Molecular and Cell Biology, Barker Hall,University of California, Berkeley, 2Department of Molecular and Cell Biology, Li Ka Shing Center,University of California, Berkeley

Summary

Dit enkel molecuul fluorescentie in situ hybridisatie protocol is geoptimaliseerd voor het kwantificeren van het aantal molecules van RNA in ontluikende gist tijdens de vegetatieve groei en meiose.

Abstract

Enkel molecuul fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH) is een krachtige techniek om te studeren van genexpressie in afzonderlijke cellen vanwege zijn vermogen op te sporen en het tellen van afzonderlijke molecules van RNA. Aanvulling op diepe sequencing gebaseerde methoden, smFISH biedt informatie over de cel-naar-cel variatie in afschrift overvloed en de subcellular localisatie van een bepaalde RNA. Onlangs hebben we gebruikt smFISH om te bestuderen van de uitdrukking van het gen NDC80 tijdens de meiose in ontluikende gist, in welke twee transcript isoforms bestaan en de isovorm van de korte transcript heeft haar gehele reeks gedeeld met de lange isovorm. U vol vertrouwen kunt identificeren elke transcript isovorm, we bekende smFISH protocollen geoptimaliseerd en behaalde hoge consistentie en kwaliteit van de gegevens van de smFISH voor de ontluikende opgedane monsters gist meiose. Hier beschrijven we dit geoptimaliseerd protocol, de criteria die we gebruiken om te bepalen of de hoge kwaliteit van de gegevens van de smFISH is verkregen, en enkele tips voor de uitvoering van dit protocol in andere giststammen en groei-omstandigheden.

Introduction

Dynamische regulering van de genexpressie rijdt de ontwikkeling van een organisme, evenals haar reactie op de milieudruk, infectie en veranderingen in het metabolisme. Studies die zich op transcriptionele verordening richten is afhankelijk van technologieën die meten van RNA overvloed. Een dergelijke methode, genoemd enkel molecuul fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH), wordt gebruikt voor de detectie van individuele molecules van RNA in afzonderlijke cellen1,2. Met deze methode kunt meting van de variabiliteit van de cel-naar-cel in genexpressie en de bepaling van intracellulaire RNA lokalisatie.

In de meest gebruikte smFISH techniek vereist detectie van een individuele RNA-molecuul meerdere korte DNA sondes (vaak ~ 48 20-mer sondes) die zijn complementair aan de doelgroep RNA en zijn geconjugeerd met de dezelfde fluorescerende kleurstof. Binding van één fluorescente sonde resulteert in een zwak signaal, maar het signaal van het ensemble van alle de sondes is robuust. Deze functie verbetert sterk de signal-to-noise verhouding omdat hoewel één sonde uit doelsoort zijn bindend vertonen kan, zo’n signaal naar verwachting zeer zwak in vergelijking met die van de target RNA molecuul3. Binnen fout van detectie, kan het aantal molecules van RNA worden geteld en vergeleken over verschillende groei-omstandigheden en onder verschillende mutanten.

Sinds de eerste ontwikkeling ervan, is smFISH aangepast om te bestuderen van de verschillende aspecten van gen expressie4, zoals transcriptie rek1,2,5,6, transcriptionele barsten7 splicing , 8 , 9, intracellulaire allèlique expressie10,11,12, en RNA lokalisatie13,14,15. Onlangs, wij hebben gebruikte deze methode om te studeren van de expressie van twee transcript isoforms van hetzelfde gen, waarin de korte transcript-isovorm (NDC80ORF) heeft haar gehele reeks gedeeld met de lange isovorm (NDC80luti )16. Om de twee mRNA isoforms uniek te identificeren, we gebruikten twee sets van de sonde: één set is specifiek voor de unieke reeks NDC80luti, en de andere reeks, geconjugeerd met een ander fluorescente kleurstof, bindt aan de gemeenschappelijke regio van de twee isoforms. De NDC80luti RNA wordt geïdentificeerd als een colocalized plek met beide TL signalen, overwegende dat de NDC80ORF RNA is enerzijds dat slechts het signaal van de gemeenschappelijke set van de sonde bevat. Sinds het nummer van de NDC80ORF afschriften wordt berekend door een “aftrekken” methode, hoge efficiëntie van de kruising van de sonde en een hoge signaal-/ ruisverhouding zijn nodig om vol vertrouwen smFISH plekken identificeren en verminderen fout vermeerdering.

Dit witboek beschrijft een geoptimaliseerde protocol voor het uitvoeren van smFISH in de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae. In dit protocol het celaantal, fixatie tijd, vertering, spijsvertering buffer, sonde concentratie en tijd hybridisatie buffer die wordt gebruikt voor de smFISH-experimenten werden geoptimaliseerd voor de SK1 stam achtergrond van S. cerevisiae ondergaan vegetatieve groei of meiose. We constateren echter ook in dit manuscript: (1) de methode om te controleren de kwaliteit van smFISH gegevens na Beeldacquisitie, en (2) de stappen in het protocol dat moet u mogelijk aanvullende optimalisatie voor verschillende stam achtergronden en groei-omstandigheden.

Protocol

Opmerking: Alle de buffers en de media die worden gebruikt in dit protocol zijn vermeld in tabel 1. De leveranciersinformatie voor de reagentia wordt weergegeven in de Tabel van materialen. 1/dag 1-2: Opmerking: Voor vegetatieve cultuur, groeien cellen tot een OD-600 voor 0.4 tot 0.6 in een aangewezen middel. Voor Meiotische cultuur, induceren cellen ondergaan meiose met behulp van een voorkeursmethode (meestal kweken in een OD600 van 1,85). 1. proef fixatie en spijsvertering Een totaal van ~3.5 OD600 van cellen in 3% formaldehyde vast te stellen. Voeg 5.52 mL cultuur tot 480 µL van 37% formaldehyde in 15 mL conische buisjes voor vegetatieve cultuur. Meiotische cultuur, voegt toe 1840 µL van cultuur aan 160 µL van 37% formaldehyde in 2 mL microcentrifuge buizen. ~ 5 keer omkeren te mengen.Let op: Formaldehyde is giftig. Verwerken en gooi institutionele reglementeringen. Buizen op de trommel van een roller bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten plaats. Meiotische monsters, na vaststelling bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten, blijven ‘s nachts vaststelling op 4 ˚C, roteren.Opmerking: De overnachting fixatie verhoogt de reproduceerbaarheid en de kwaliteit van de gegevens van de smFISH verkregen voor Meiotische monsters. Fixatie tijd moet worden geoptimaliseerd. Terwijl de monsters zijn vaststelling, ontdooi 200 mM Vanadyl Ribonucleoside complexen (VRC) op 65 ˚C voor minstens 10 min. Spijsvertering master mix in een tube van 15 mL bereiden: Meng voor 1 monster, 425 µL van Buffer B met 40 µL van 200 mM VRC (opgewarmd tot 65 ˚C); voor 5 monsters, meng 2125 µL van Buffer B met 200 µL van 200 mM VRC (opgewarmd tot 65 ˚C). Vortex ~ 5 s tot volledig resuspendeer de VRC alvorens toe te voegen aan de master mix, die licht bruin groen na toevoeging van de VRC verschijnen zal.Opmerking: Toevoeging van VRC tijdens de spijsvertering verbetert de consistentie van de resultaten van de smFISH, mogelijk door remming van de verontreiniging van de nuclease geïntroduceerd door het mengsel van zymolyase, die uit ruwe extract is gezuiverd. Het bedrag van de VRC nodig bij deze stap moet worden geoptimaliseerd. Centrifugeer voor vegetatieve monsters, de buizen bij ~ 1057 x g gedurende 3 minuten. Centrifugeer bij 21.000 x g voor 1,5 min. Decant of gecombineerd de bovendrijvende vloeistof met formaldehyde afval voor Meiotische monsters (na overnachting fixatie).Opmerking: Alle centrifugeren stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur. Resuspendeer de cellen in 1,5 mL koude Buffer B door pipetteren op en neer of door het omkeren van de buizen en flicking te mengen. Vegetatieve monsters overbrengen in 2 mL tubes na resuspensie. Centrifugeer bij 21.000 x g gedurende 1,5 min. verwijderen het grootste deel van de vloeistof door vacuüm aspiratie of pipetteren, ~ 100 µL achterlatend. Resuspendeer de cellen in 1,5 mL koude Buffer B. Centrifugeer bij 21.000 x g gedurende 1,5 min. verwijderen het grootste deel van de vloeistof door vacuüm aspiratie of pipetteren, ~ 100 µL achterlatend. Resuspendeer de cellen in 1,5 mL koude Buffer B. Centrifuge op 21.000 x g voor 1,5 min. Aspirate de vloeistof volledig door vacuüm of pipetteren. Resuspendeer de cellen in 425 µL van master mix van de spijsvertering, en kort vortex aan resuspendeer. Voeg 5 µL van 100T 10 mg/mL zymolyase aan elke buis.Opmerking: Vortex de zymolyase telkens voordat toe te voegen aan de buizen. Voeg zymolyase aan elke buis individueel, in plaats van toe te voegen aan de master mix. Beide stappen helpen spijsvertering consistentie tussen buizen gewoon omdat zymolyase snel precipitaten. Vortex 2-3 s te mengen. Plaats de buizen op de trommel van een roller en verteren op 30 ˚C voor 15-30 min. Voor vegetatieve cellen en Meiotische beginfase, duurt meestal ~ 15 min, en voor Meiotische profase en Meiotische divisies, meestal duurt ~ 30 min.Opmerking: Controleer op de Microscoop elke 5 min na 15 min, en stoppen van de spijsvertering, waneer ~ 80% van de cellen niet-transparante en niet-refractieve. Vanaf dit punt op cellen zijn erg kwetsbaar. Voorzichtig behandelen van cellen en Vermijd het gebruik van vacuüm aspiratie of vortexing. Centrifugeer de buizen bij ~ 376 x g gedurende 3 min. verwijderen de vloeistof volledig door pipetteren. Zachtjes resuspendeer cellen met 1 mL Buffer B door pipetteren op en neer 1 – 2 keer te mengen. Centrifugeer de buizen bij ~ 376 x g gedurende 3 min. verwijderen Buffer B vloeistof door pipetteren. Zachtjes resuspendeer de cellen in 1 mL 70% ethanol (verdund met water RNase-gratis). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3,5-4 uur. 2. hybridisatie Breng formamide op kamertemperatuur (voor 50 mL aliquot, duurt ~ 30 min in waterbad).Opmerking: Open de formamide fles niet totdat de fles kamertemperatuur tot Voorkom oxidatie van formamide.Let op: Formamide is giftig. Verwerken en gooi institutionele reglementeringen. 10% formamide was buffer in een conische buis 15 mL voor te bereiden. Centrifugeer de buizen bij ~ 376 x g gedurende 3 min. 500 verwijderen µL van 70% ethanol door pipetteren. Pipet zachtjes op en neer naar resuspendeer de resterende cellen en vervolgens de cellen aan lage wrijvingscoëfficiënt buizen.Opmerking: Met behulp van lage wrijvingscoëfficiënt buizen sterk vermindert cel verlies tijdens alle vervolgwasbeurten kunt. Centrifugeer de buizen weer bij ~ 376 x g gedurende 3 min. verwijderen alle de ethanol door pipetteren. Voeg 1 mL 10% formamide was buffer, en zachtjes Pipetteer op en neer 2 – 3 keer tot resuspendeer de cellen. De cellen om te zitten bij kamertemperatuur gedurende ~ 20 minuten bij de voorbereiding van de kruising oplossing toestaan. Meng 50 µL van hybridisatie Buffer (kamer gebruikstemperatuur), 5 µL van 200 mM VRC (opgewarmd tot 65 ˚C) en 1 µL van elke sonde (200 nM def.) voor 1 monster. Meng 250 µL van hybridisatie Buffer (kamer gebruikstemperatuur), 25 µL van 200 mM VRC (opgewarmd tot 65 ˚C) en 5 µL van elke sonde (200 nM def.) voor 5 monsters. Ontdooi hybridisatie Buffer (bevroren bij-20 ˚C) tot kamertemperatuur alvorens de buis om te voorkomen dat formamide oxidatie te openen. Na het toevoegen van de 200 mM VRC, vortex voor 5-10 s voordat u toevoegt de sondes, die zijn ontworpen commercieel gekocht en gereconstitueerd volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Als twee sondes mede bebroede zijn, voeg 1 µL van de 1:10 verdunning van de sonde #1 voorraad, evenals 1 µL van de 1:10 verdunning van de sonde #2 voorraad, om een uiteindelijke verdunning van ~ 1:500 voor beide sonde. De concentratie die nodig zijn voor de beste signal-to-noise verhouding moet worden geoptimaliseerd (zie discussie voor details). Centrifugeer de monsters bij ~ 376 x g gedurende 3 min. verwijderen het supernatant in gevaarlijke afvalstoffen door pipetteren. Voeg ten minste 50 µL van hybridisatie oplossing aan elke buis. Flick de buizen te mengen. Incubeer bij 30 ˚C op de trommel van een roller gedurende ten minste 16 uur in het donker. 2/dag 3 3. wassen en beeldvorming Breng formamide op kamertemperatuur. 10% formamide was buffer (FWB) in een conische buis 15 mL voor te bereiden. Verwijder de buizen uit de trommel roller en plaats hen in een folie bedekte vak te beschermen tegen licht. Centrifugeer de monsters bij ~ 376 x g gedurende 3 min. verwijderen het supernatant in gevaarlijke afvalstoffen door pipetteren. Resuspendeer in 1 mL 10% FWB door zachtjes op en neer pipetteren 2 – 3 keer. Incubeer bij 30 ˚C gedurende 30 min. (niet draaien) in het vak folie bedekte. De monsters bij ~ 376 x g centrifugeren voor 3 min. Verwijder het supernatant op gevaarlijke afvalstoffen door pipetteren en laat ~ 50 µL. Ondertussen bereiden DAPI/FWB in een conische buis 15 mL: voor 1 monster 1000 µL van 10% formamide was buffer te mengen met 1 µL van 5 mg/mL DAPI. Voor 10 monsters, meng 10 mL 10% formamide was buffer met 10 µL van 5 mg/mL DAPI. Resuspendeer in 1 mL DAPI/FWB door zachtjes op en neer pipetteren 2 – 3 keer. Incubeer bij 30 ˚C gedurende 30 min. (niet draaien) in het vak folie bedekte. Ontdooi anti-bleekmiddel reagentia op ijs. Centrifugeer de monsters bij ~ 376 x g gedurende 3 min. verwijderen het supernatant volledig door pipetteren. Indien nodig, Centrifugeer nogmaals om alle van de bovendrijvende substantie te verwijderen. Voor monsters die zijn niet onmiddellijk beeld, resuspendeer de pellet in 50 µL van GLOX Buffer zonder enzymen. Pipetteer omhoog en omlaag 3 – 4 keer te mengen. Houd alle unimaged monsters in het vak folie bedekte op 4 ˚C totdat u op afbeelding. Als u klaar bent om het imago, centrifugeren van de monsters bij ~ 376 x g gedurende 2 min en verwijder het supernatant volledig door pipetteren. Resuspendeer in GLOX met enzymen zoals hieronder. Voeg voor monsters meteen het image wordt gemaakt, 15-20 µL van GLOX buffer met enzymen. Pipet zachtjes op en neer te mengen.Opmerking: Het volume toegevoegd kan variëren afhankelijk van de grootte van de cel-pellet. Wij adviseren de pellet in 15 µL van GLOX buffer met enzymen resuspending en controleren van de celdichtheid op Microscoop. Als cellen zijn ook dichte (cellen samendoen bovenop elkaar), voegt u extra GLOX buffer met enzymen. Als cellen ook schaars zijn, centrifugeren van het monster en verwijdert ~ 5 µL van buffer. Pipetteer 5 µL op een dekglaasje aan (18 mm x 18 mm, nr. 1), en leg het dekglaasje aan op een dia. Zet een laboratorium veeg op de top van de dia waar het dekglaasje aan is geplaatst. Druk zachtjes op op het laboratorium veeg om dia (moet zien vloeibare vandaan uit alle vier randen van het dekglaasje aan). De dia overzetten naar de Microscoop kamer in een vak vallende aluminiumfolie. Beeld met behulp van een breed-gebied fluorescentie Microscoop met hoge vergroting (60-100 X) en hoog numerieke diafragma.Opmerking: Het verzamelen van het maximale aantal fotonen uitgestoten door de smFISH-sondes, confocal microscopen zijn niet aanbevolen, omdat ze de hoeveelheid licht moeten worden verzameld aanzienlijk kunnen beperken. Hier, de gegevens werden verzameld op een microscoop voorzien van een 100 X, 1.4 nb doelstelling, met behulp van filters CY5 (EX632/22, EM679/34) beeld op 1.3 s, 100% T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, 100% T; en DAPI (EX390/18/EG, EM435/48), 0.05-0.1 s, 32-50% T. Een heldere-veld referentiebeeld moet ook worden verworven. Verwerven van de segmenten van de 15-25 met een stap grootte van 0,1-0,2 µm, van volledig onder de focus van het gezichtsveld volledig hierboven, om ervoor te zorgen dat alle de RNA-plekken worden verantwoord. 4. de beeldanalyse Het analyseren van de gegevens van de smFISH met gepubliceerde smFISH analysetools zoals vis-quant17 en StarSearch2, of met op maat gemaakte programma’s, afhankelijk van de exacte vereisten van het experiment.Opmerking: Een goede analyse pijpleiding moet toestaan de gebruikers om te bepalen van een drempel te scheiden van de ware RNA plekken van de achtergrond, en output van statistieken zoals de X, Y en Z (optioneel) coördinaten en de intensiteit van elke vlek, het aantal plekken in elke cel , en eventueel passend parameters als een manier om het uitfilteren van valse detecties.

Representative Results

Om te evalueren hoe goed het smFISH protocol gewerkt (aangegeven in Figuur 1), we ontwierpen een set van 54 sondes die tegel van het open leesraam van het NDC80 gen (figuur 2A, top). De sonde gelegen aan de meest 5′ einde wordt aangeduid als de sonde 1; de volgende dia, sonde 2; en de derde, Probe 3, enz. De 27 sondes toegewezen een oneven nummer (sonde 1, 3, 5,…) zijn alle geconjugeerd met de fluorescente kleurstof van CAL Fluor 590 (CF590); en de 27 sondes toegewezen een even getal (Probe 2, 4, 6,…), geconjugeerd met de fluorescente kleurstof van Quasar 670 (Q670). Vandaar worden deze afwisselende sonde sets vaak aangeduid als “oneven/zelfs” sondes. Op de kruising, moeten beide sets sonde het dezelfde transcript label. Na detectie van de plek, hebben we een paar metingen gebruikt om de kwaliteit van de smFISH-gegevensset te beoordelen. De eerste was de mate en kwaliteit van colocalization voor de oneven/zelfs sondes. In ons geval colocalized 88% van alle smFISH-spots (figuur 2A en 2B), met meer dan 95% van de vlekken gekoppeld binnen 2 pixels van elkaar bevinden (figuur 2C, gekoppeld), die is binnen de verwachte waarde gegeven elk chromatisch en detectie aberratie tussen de twee fluorescerende kanalen. Ter vergelijking: minder dan 10% van de ongepaarde plekken had een afstand van de dichtstbijzijnde-buurman van minder dan 2 pixels, waaruit blijkt dat de kans op een plek paar misidentifying laag is (figuur 2C). De 12% van de ongepaarde plekken werden gelijkmatig verdeeld tussen de twee kanalen (figuur 2B, vergelijk CF590-alleen met alleen-Q670); en dus we geconcludeerd dat voor dit gen 2.4 kb met een scala aan expressie tussen nul tot 45 afschriften per cel, ~ 94% van de molecules van RNA waren correct gedetecteerd door in elk fluorescerende kanaal. Het smFISH-protocol mochten suboptimaal zijn, zou men (1) een grotere fractie van de smFISH plekken met slechts een van de twee fluorescerende signalen (niet-colocalized), en/of (2) cellen met een zeer lage signaal-/ ruisverhouding of geen signaal helemaal observeren. We vervolgens gevraagd als de opsporing van het signaal van de smFISH was bevooroordeeld ten opzichte van het totale aantal molecules van RNA per cel. In een populatie ligt het totale aantal een bijzondere RNA in elke cel in een verdeling, met sommige cellen herbergen meer molecules van RNA dan anderen. Een goede smFISH-protocol moet krachtig detecteren de RNA ongeacht of een hoog getal of lage aantal molecules van RNA aanwezig in elke cel is. Om dit te testen, voor elke cel, berekend we de Fractie van de smFISH-spots met colocalized signalen en de breuk met slechts een van de twee fluorescerende signalen. Na het groeperen van de cellen die had hetzelfde aantal totale plekken per cel, berekend we het gemiddelde aantal colocalized (gekoppeld) of niet-colocalized (dit is een alleen-CF590 of dit is een alleen-Q670) vlekken in een bepaalde groep, en opgenomen in een grafiek dit gemiddelde als een functie van het totale aantal spots per cel (Figuur 3). Voor elke categorie van vlekken waren de fracties gelijk over het gehele bereik van het totale aantal plekken per cel. Bijvoorbeeld, waren het vergelijken van de cellen met een totaal van 20 fluorescerende vlekken per cel ten opzichte van degenen met een totaal van 30 plekken, de gemiddelde breuken van de colocalized plekken vergelijkbaar. Dit resultaat stelde dat ons protocol een bereik van RNA-moleculen in een cel (tot ten minste 40 ~ moleculen per cel detecteren kon). Als het protocol suboptimally gewerkt, kan men een vooroordeel observeren. Bijvoorbeeld, kan de Fractie van de plekken met slechts één van de twee fluorescerende signalen toenemen als het totale aantal plekken per cel verhoogd. Deze geoptimaliseerde protocol gebruikt, onderzochten we de expressie van het NDC80 -gen, dat codeert voor een eiwit kinetochoor, in verschillende groei omstandigheden. Het NDC80 -gen uitdrukt twee mRNA isoforms: de lange ongecodeerde transcript-isovorm, NDC80luti, heeft de extensie ~ 400 basenparen eind 5′ in vergelijking met de korte NDC80ORF isovorm, maar beide afschriften delen de codering regio van het NDC80 gen (zie schema in figuur 4A). We ontwierpen twee soorten sondes: The CF 590 set bindt aan de regio unieke 5′ van NDC80luti; en de set Q 670 bindt aan de gemeenschappelijke regio van NDC80luti en NDC80ORF. De NDC80luti transcripten werden ontdekt als de smFISH plekken waar de signalen van beide sets colocalized, sonde, overwegende dat de NDC80ORF afschriften waren die met het signaal alleen van Q 670. Vanwege de grootte van het unieke segment van NDC80luti, kunnen we slechts 20 oligonucleotide sondes langs deze regio, die minder dan de aanbevolen 30 tot en met 48 sondes tegel. Dus, we eerst vastgesteld als deze sonde set krachtig RNA in ons geoptimaliseerde protocol kan detecteren. Voor beide TL kanaal, we opgenomen in een grafiek de signaal-ruisverhouding (SNR, gedefinieerd als de variantie van de pixels rond een plek ten opzichte van de plek intensiteit) tegen het signaal gedetecteerd voor elke smFISH plek en wordt gegenereerd een scatterplot voor alle spots in het gehele gezichtsveld (voorbeeldafbeeldingen in figuur 4A ) en percelen in figuur 4Bvastgesteld. Twee verschillende populaties werden duidelijk aangegeven voor beide de Q-670 en de CF-590 sonde wordt ingesteld (geoptimaliseerd, figuur 4B), wat suggereert dat de ware smFISH plekken (in de grijze zone) kunnen worden gescheiden van het signaal van de achtergrond. Merk op dat in de suboptimaal voorwaarde dergelijke scheiding was minder voor de hand liggende (Suboptimal, figuur 4B). We deze twee sonde sets gebruikt bij het bestuderen van de expressie van NDC80luti en NDC80ORFtijdens de vegetatieve groei en meiose. In de vegetatieve cellen, robuuste signaal uit de Q-670 sonde set was, maar niet van de CF-590 sonde ingesteld (figuur 5A, vegetatieve), eens met de constatering door het noordelijke bevlekken die alleen de korte isovorm naar voren tijdens de vegetatieve groei16 gebracht werd . Dit resultaat stelde ook dat de CF 590 sonde set specifiek is, opbrengst van lage achtergrond in ons geoptimaliseerde smFISH protocol. In tegenstelling, robuuste signaal van beide sets sonde werd ontdekt in Meiotische profase, en de meerderheid van de plekken had colocalized signaal (figuur 5A, Meiotische profase). Samen met de noordelijke vlekkenanalyse (figuur 5B) bevestigd deze constatering dat de lange isovorm NDC80luti werd uitgedrukt specifiek in meiose. Deze twee soorten mRNAs werden ontdekt in het cytoplasma (buiten de DAPI-regio), suggereren dat zowel uit de kern, consistent met het ribosoom profilering gegevens18werden uitgevoerd. Om te bepalen als er voldoende gegevens werden verzameld tot nauwkeurig rekening voor de biologische variatie die inherent is aan onze gegevensset, we uitgevoerd bootstrap analyse met behulp van de statistieken van elke cel, waaronder (1) de Fractie van de colocalized plekken per cel en (2) de Fractie van de vlekken met een van de twee fluorescerende signalen (CF 590 alleen en Q 670 alleen). In deze analyse willekeurig een programma één cel uit de 437 gekwantificeerde cellen voor 500 iteraties. Vervolgens werden het gemiddelde en de variantie van de respectieve statistieken die zijn gekoppeld aan deze 500 geselecteerde cellen berekend. Dit proces werd vervolgens herhaald voor het willekeurig selecteren van twee cellen van alle cellen, zonder teruglegging; en dan voor het willekeurig selecteren van drie cellen, enz. tot een helft van de grootte van de totale gegevensverzameling is bereikt. De variantie in de gegevensset plateaued na ~ 40 cellen, suggereert dat na dit punt grootste deel van de variatie in de gemiddelde inherent is aan de gegevens in plaats van een artefact van undersampling is (Figuur 6, inzet). Dit effect werd meer duidelijk als we opgenomen in een grafiek de variantie van de steekproef gedeeld door het gemiddelde van de steekproef, als een functie van het aantal cellen die bemonsterd zijn in elke iteratiecyclus (Figuur 6). Waarin de gegevens worden weergegeven, werd de wijziging in de variantie diminishingly klein na ~ 60 cellen. Het aantal cellen in een smFISH experiment gekwantificeerd moet hoger zijn dan het minimum aantal cellen die nodig zijn om een stabiele gemiddelde en een plateau van de variantie. In ons geval gekwantificeerd we meer dan 95 cellen per monster, per repliceren. Het totale aantal cellen (> 400 cellen) overschreden en het minimum aantal cellen (~ 60 cellen) vereist om na te denken van het populatiegemiddelde. Met een op maat gemaakte Matlab programma16, vegetatieve cellen werden gevonden te hebben een mediaan van 5 NDC80ORF afschriften per cel, terwijl in Meiotische profase cellen, de mediaan aanzienlijk gedaald tot 4 afschriften per cel (tweezijdige Wilcoxon Rank-Sum test, p = 0.026) (Figuur 7). Het mediaan aantal NDC80luti afschriften per cel was 21 afschriften, en 100% van de cellen uitgesproken de NDC80luti transcripten. Wij opgenomen in een de breuk van de cellen met een bepaald aantal afschriften grafiek als een histogram stapsgewijs, relatieve frequentie omdat het aantal mRNA moleculen een discrete hoeveelheid is. De grootste opslaglocatie voor elke histogram was genormaliseerd naar dezelfde hoogte. Figuur 1: Flow-chart voor het protocol smFISH. Cellen worden bevestigd met formaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten of op 4 ˚C’s nachts, voor vegetatieve groei monsters en Meiotische monsters, respectievelijk. Na het wassen in Buffer B driemaal, worden cellen verteerd door zymolyase tot ~ 70-90% van de cellen zijn verteerd. De verteerd monsters worden vervolgens gewassen één keer met Buffer B te verwijderen van de zymolyase, en vervolgens permeabel in 70% ethanol (EtOH) voor ~3.5 uur. Ter voorbereiding van hybridisatie, worden de monsters eerst geïncubeerd in 10% formamide was buffer (FWB) voor ~ 20 min. Hierna sloeg de monsters zijn geresuspendeerde in ~ 50 µL van hybridisatie oplossing, waarin de fluorescerende sondes, voor overnachting incubatie in het donker bij 30 ˚C. Na de kruising, zijn de monsters geïncubeerd in 10% FWB gedurende 30 minuten weg te wassen de overtollige sondes, en vervolgens geïncubeerd in 10% FWB met 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) om het DNA vlek. Voor de steekproef beeld onmiddellijk na de incubatie FWB/DAPI, het monster is geresuspendeerde in de buffer van de GLOX aangevuld met katalase, Trolox en glucose oxidase (GLOX + enz); Overwegende dat, de andere monsters geresuspendeerde in de buffer GLOX zonder enzymen, en opgeslagen bij 4 ˚C tot ~ 3 uur. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2: beoordeling van de kwaliteit van de smFISH met behulp van oneven/zelfs sondes. (A) top: Schema voor de oneven/zelfs sonde sets. Vierenvijftig oligonucleotide sondes tegels van het NDC80 -gen werden ontworpen. De oneven sondes waren gelabeld met één fluorophore (CF590, getoond in magenta) en de even nummers sondes, met een andere fluorophore (Q670, getoond in groen). Bodem: Vertegenwoordiger smFISH beelden van Meiotische profase cellen verkregen met behulp van de oneven/zelfs sonde sets. Monsters werden genomen 6 uur nadat cellen (UB8144) werden overgebracht naar sporevorming medium, een tijd toen deze cellen werden gearresteerd in Meiotische profase. DNA werd gekleurd met de DAPI (afgebeeld in het blauw). Afbeeldingen worden weergegeven als de prognoses van de maximale intensiteit van z-stacks. Schaal bar: 5 µm. (B) Percentage van de gepaarde of ongepaarde smFISH plekken verkregen met behulp van de oneven/zelfs sonde sets. Een totaal van 428 Meiotische profase cellen werden geanalyseerd, bundeling van twee onafhankelijke experimenten. Dit cijfer is aangepast ten opzichte van Figuur 2-figuur supplement 4 van Chen et al. 16 (C) A cumulatieve dichtheid functie (CDF) van de afstand tussen elk paar gekoppelde vlekken en afstand tussen de naaste buur van een ongepaard spot. Voor elke gedetecteerde plek in één fluorescerende kanaal, het “k dichtstbijzijnde buurman” algoritme werd toegepast om het identificeren van de dichtstbijzijnde gedetecteerde plek — en de afstand naar die plek — in de complementaire kanaal. Lokalisaties die wederzijdse dichtstbijzijnde buren waren werden geacht te worden gekoppeld, en een nieuwe lijst is gegenereerd met het opnemen van de gepaarde, dit is een alleen-CF590, en dit is een alleen-Q670 detecties. Voor elke categorie van detecties, was een CDF-histogram van de afstanden die zijn uitgezet in Matlab, bevestigen dat correct gepaarde plekken inderdaad veel dichter in afstand dan mensen zonder een overeenkomstige plek in het andere kanaal waren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3: breuken van gepaarde en ongepaarde spots, als een functie van het totale RNA nummer per cel. Om te testen of de detectie- en koppeling van de smFISH plekken was bevooroordeeld andere expressie niveau, werden afzonderlijke cellen gegroepeerd op totaal RNA expressie. De gemiddelde breuken van gepaarde, dit is een alleen-CF590, en dit is een alleen-Q670 detecties werden berekend voor elke groep van cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 4: Beoordeling van de kwaliteit van de gegevens van de smFISH gegenereerd met behulp van de sondes ontworpen voor NDC80luti en NDC80ORF mRNAs. De Q-670 sondes (afgebeeld in groen) vermengen naar de gemeenschappelijke regio gedeeld tussen NDC80luti en NDC80ORF mRNAs, overwegende dat de CF 590 sondes (getoond in magenta) naar de regio unieke 5′ van NDC80luti vermengen . (A) vertegenwoordiger smFISH beelden van NDC80luti en NDC80ORF in Meiotische profase, verworven onder geoptimaliseerd versus suboptimaal voorwaarden. Stammen van UB8144 (geoptimaliseerd voorwaarde) en UB1337 (suboptimaal voorwaarde) waren geïnduceerde meiose ondergaan en vaste tijdens Meiotische profase. Deze twee soorten haven verschillende synchronisatiescenario systemen voor het opwekken van meiose, maar het gebruik van beide systemen heeft geen invloed op de kwaliteit van de smFISH (gegevens niet worden weergegeven). In de suboptimaal voorwaarde werden cellen vastgesteld bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten (geen overnachting fixatie), verteerd met zymolyase zonder VRC aangevuld en gekruist in een lagere concentratie van VRC. Afbeeldingen worden weergegeven als de prognoses van de maximale intensiteit van z-stacks. DNA werd gekleurd met de DAPI (afgebeeld in het blauw). Schaal bar: 5 µm. (B) Scatterplots weergave van de signaal-ruisverhouding (SNR) en het signaal van elke smFISH plek gevonden in het gezichtsveld gepresenteerd in figuur 4A, voor beide TL kanaal, alsmede voor de geoptimaliseerde of suboptimaal voorwaarden. In de geoptimaliseerde voorwaarde waren twee populaties van de smFISH plekken aanwezig. De plekken waar smFISH werden gevestigd binnen de grijze zone, het scheiden van het signaal van de achtergrond. In de suboptimaal voorwaarde individuele mRNAs waren moeilijk te onderscheiden is met het blote oog, en was de scheiding tussen de ware plekken en achtergrond na het uitvoeren van de software ter plaatse detectie minder duidelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 5: Expressie van NDC80luti en NDC80ORF afschriften zijn stoffelijk gecontroleerd. (A) vertegenwoordiger smFISH beelden van NDC80luti en NDC80ORF tijdens de vegetatieve groei en meiose. Vegetatieve monsters werden genomen wanneer cellen (UB8144) exponentieel in rijke voedingsbodem groeien werden. Meiotische profase monsters werden genomen 6 uur nadat cellen (UB8144) werden overgebracht naar sporevorming medium, een tijd toen deze cellen werden gearresteerd in Meiotische profase. De Q-670 sondes (afgebeeld in groen) vermengen naar de gemeenschappelijke regio gedeeld tussen NDC80luti en NDC80ORF mRNAs, overwegende dat de CF 590 sondes (getoond in magenta) naar de unieke 5′ regio NDC80vermengen luti . DNA werd gekleurd met de DAPI (afgebeeld in het blauw). Elke cel werd georganiseerd door de Zip1-GFP-signaal, een marker voor Meiotische profase. Ons smFISH protocol behoudt sterke GFP signaal verder ongewijzigd. Vegetatieve groei: Zip1-GFP negatief. Meiotische profase: Zip1-GFP positief. Afbeeldingen worden weergegeven als de prognoses van de maximale intensiteit van z-stacks. Schaal bar: 5 µm. Dit cijfer is aangepast ten opzichte van de figuur 2C van Chen et al. 16. (B) NDC80ORF, NDC80lutien Ndc80 eiwit (Ndc80p) niveau tijdens de meiose (UB4074). NDC80luti en NDC80ORF niveaus werden bepaald door de noordelijke vlek en Ndc80p niveau werd bepaald door anti-V5 immunoblot op de aangegeven tijdstippen. Hxk1p, controle voor immunoblot laden. Als stam UB8144, deze spanning ook herbergt de pGAL-NDT80 GAL4-ER synchronisatie systeem19,20. Cellen werden overgebracht naar sporevorming medium op 0 uur en vrijgelaten uit pachytene arrestatie door β-oestradiol toevoeging 6 uur later. Het NDC80luti transcript is krachtig opgetreden in S/Meiotische profase, overwegende dat de NDC80ORF afschriften was voornamelijk aanwezig voordat Meiotische werking (0 uur) en tijdens de Meiotische divisies (7-9 uur). Dit cijfer is uit figuur 6J van Chen et al. gewijzigd 16 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.  Figuur 6: Bootstrap analyse uitgevoerd voor de monsters van de Meiotische profase weergegeven in Figuur 5 . Alle gekwantificeerde cellen werden gebundeld, en een bepaald aantal (n) cellen werden willekeurig bemonsterd 500 keer. Het gemiddelde en de 95%-betrouwbaarheidsinterval werden berekend voor de Fractie van de gepaarde en ongepaarde mRNA per cel. Deze gegevens werden uitgezet voor elke keuze van het getal n (inzet). Het plateau in afwijking werd gevisualiseerd door het uitzetten van de variantie van de steekproef gedeeld door het gemiddelde, als een functie van het aantal cellen (n) bemonsterd. Het totale aantal cellen gemeten (437 cellen) aanzienlijk overschreden het nummer waarop de fout plateaued (~ 60 cellen), die aangeeft dat de aanvullende gegevens niet het vertrouwen in de metingen zou verbeteren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 7: kwantificering van de gegevens van de smFISH weergegeven in Figuur 5 , grafische als de relatieve frequentie histogrammen van de cellen met een bepaald aantal NDC80luti en NDC80ORF afschriften per cel, met behulp van de gegevens uit drie onafhankelijke experimenten gepoold. De stippellijn geeft het gemiddelde aantal NDC80luti en NDC80ORF afschriften per cel. Elke histogram was genormaliseerd zodat de maximale bin hoogte hetzelfde voor alle de histogrammen was. Een totale aantal 637 cellen werden geanalyseerd voor vegetatieve groei en 437 voor Meiotische profase. Tweezijdige Wilcoxon Rank-Sum test werd uitgevoerd voor NDC80luti en NDC80ORF, respectievelijk, vegetatieve en Meiotische profase monsters te vergelijken. Dit cijfer is uit figuur 2D van Chen et al. gewijzigd 16 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.  Buffer B (1 L voorraad: 1.2 M sorbitol; 0,1 M kalium fosfaatbuffer, pH 7.5) 1 x Nuclease-gratis water 500 mL Sorbitol 218.6 g KH2PO4 2.18 g K2HPO4 14.62 g Nuclease-gratis water 1 L eindvolume brengen * Bewaren bij 4 ˚C in 50 mL aliquots na het steriliseren van de filter Zymolyase 100T (10 mg/mL) * Bewaren bij-20 ˚C in porties Los 10 mg zymolyase poeder in 1 mL MilliQ water E. coli tRNA (10 mg/mL) * Bewaren bij-20 ˚C in porties Los 10 mg tRNA poeder in 1 mL MilliQ water 70% ethanol (50 mL) 1 x (mL) Zuiver ethanol 35 Nuclease-gratis water 15 * Bewaren bij kamertemperatuur Hybridisatie Buffer (10 mL) 1 x (mL) 50% dextran sulfaat 2 E. coli tRNA (10 mg/mL) 1 200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) 0.1 BSA, 50 mg/mL 0.04 20 x SSC 1 Formamide 1 Nuclease-gratis water 4,86 * Bewaren bij-20 ˚C in 250-µL of 500-µL aliquots 10% formamide was buffer (10 mL) 1 x (mL) Formamide bij kamertemperatuur 1 20 x SSC 1 Nuclease-gratis water 8 * aanbrengen vers, vortex voor 20-30s mix 10% glucose-oplossing * Bewaren bij 4 ˚C in aliquots na het steriliseren van de filter Los 1 g glucose in 10 mL water nuclease-gratis Glucose-oxidase * Bewaren bij-20 ˚C in porties Ontbinden 3.7 mg glucose-oxidase in 1 mL 50 mM NaOAc, pH 5 Anti-bleekmiddel (GLOX) Buffer, zonder enzymen (1 mL) 1 x (µL) 10% glucose in nuclease-gratis water 40 1 M Tris, pH 8,0 10 20 x SSC 100 Nuclease-gratis water 850 * Maak verse, kunt ook aliquots bij 4 ˚C Anti-bleekmiddel (GLOX) Buffer, met enzymen (50 µL) 1 x (µL) Katalase (vortex mild, het afwikkelt gemakkelijk) 0,5 Glucose-oxidase 0,5 100 mM Trolox (opgelost in ethanol) 1 GLOX buffer 50 * Maak verse elke keer, voor te bereiden op het ijs, kan worden achtergelaten bij 4 ˚C voor 2-3 uur Tabel 1. Buffers en media

Discussion

Het hier gepresenteerde protocol is afgeleid van andere gepubliceerde smFISH protocollen2,3,21,22,23, en specifiek voor de gist stam achtergrond SK1 is geoptimaliseerd. De geoptimaliseerde parameters opgenomen het celaantal, fixatie duur centrifugeren snelheid en duur, spijsvertering duur, spijsvertering buffer, sonde concentratie en kruising buffer. Andere parameters zoals temperatuur hybridisatie en duur waren niet geoptimaliseerd. In deze sectie delen we een paar notities die zou helpen bij het aanpassen van dit protocol geen gist stam achtergrond en de voorwaarden van de groei van belang.

De celwand van ontluikende gist is een belangrijke uitdaging tegen het verkrijgen van hoge kwaliteit smFISH beelden in de ontluikende gist omdat de celwand sonde penetratie voorkomt. Onvolledige vertering van de celwand door zymolyase leidt tot inefficiënte kruising van de sondes en de hoge cel-naar-cel variabiliteit in signaal. Echter kan overmatige spijsvertering cellen te kwetsbaar maken, wat leidt tot aanzienlijke verlies tijdens de stappen wassen cel en cel barsten tijdens het prepareren van objectglaasjes voor imaging. Optimaliseren van de duur van de spijsvertering is dus cruciaal. Het is raadzaam om een pilot smFISH experiment uitvoeren door hetzelfde monster voor verschillende hoeveelheden tijd verteren. In ons geval, we de beste smFISH gegevens als we de spijsvertering gestopt toen ~ 80% van de cellen niet-refractieve werd verkregen. Meestal voor de dezelfde voorwaarde voor groei, kunnen verschillende genetische gemuteerde stammen met soortgelijke timing worden verteerd. De duur van de spijsvertering verschilt echter in vergelijking tussen verschillende groei-omstandigheden en de verschillende stadia van meiose in ontluikende gist. Nadat de timing is vastgesteld, is de kwaliteit van smFISH reproduceerbaar. Opmerking kan dat voor gemuteerde stammen met defecte celwand synthese en/of samenstelling, spijsvertering kan worden afgerond in minder dan 15 min. gebruik van verschillende batches instellen van zymolyase ook enigszins veranderen van de timing van de spijsvertering.

Optimale sonde concentratie is die nodig zijn om een hoge signaal-/ ruisverhouding. We ontworpen en onze smFISH sondes commercieel gekocht. Goede sondes (vaak 20-mers) moet een percentage van GC variërend van 35% naar 45%, met een minimale ruimte van 2 basenparen tussen sondes, en lage Kruisallergie. We gebruikten een sonde web gebaseerde ontwerper van de fabrikant voor het genereren van een lijst van sondes, en als er waren genoeg sondes om uit te kiezen, zouden we de BLAST-algoritme in de Saccharomyces Genome Database gebruiken om te elimineren van de sondes met meer dan 17 basenparen overlapt met andere genomic regio’s. We kozen de meer photostable fluorescerende kleurstof (CAL Fluor 590) voor de sonde set die anneals naar de unieke regio van NDC80luti (CF 590), omdat in deze set, het aantal sondes die voldaan aan alle bovengenoemde criteria (20 sondes) lager dan was de minimum aantal aanbevolen door de fabrikant (~ 25 sondes). Na bereiding van de oplossing van de sonde na instructies van de fabrikant, maakte we een 1:10 verdunning van de stockoplossing en opgeslagen van de verdunde oplossing in 5-µL aliquots bij-20 ˚C. Elk aliquot werd slechts één keer gebruikt. Voor optimalisatie, moet een seriële verdunningen van de 1:10 verdunde oplossing en test welke concentratie de beste signaal-/ ruisverhouding levert. Het is raadzaam om het maken van een verdunningsreeks van 1:250, 1:500, 1:1000 en 1:2000 uit de oorspronkelijke voorraad. In ons geval, een 1:500 verdunningsfactor geresulteerd in de beste signaal-ruisverhouding, voor zowel de CF 590 en Q 670 sonde sets.

Optimale fixatie tijd is ook essentieel voor succesvolle smFISH in ontluikende gist. We vinden dat nachtelijke fixatie op 4 ˚C, in plaats van vaststelling bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten, aanzienlijk verbeterd de consistentie en kwaliteit van de resultaten van de smFISH voor Meiotische monsters. Hoewel we niet hoe ‘s nachts fixatie kan van invloed zijn vegetatieve monsters getest hebben, fixatie bij kamertemperatuur goed gewerkt voor deze groei-voorwaarde. Dus, voor het optimaliseren van het protocol van de smFISH voor nieuwe stammen of groei voorwaarden, raden we beginnen met korte fixatie tijd bij kamertemperatuur en steeds meer fixatie als hoge variabiliteit van signaal wordt aangetroffen.

Vergeleken met andere gepubliceerde protocollen3,22,23, onze protocol gebruikt de RNase remmer VRC tijdens de spijsvertering en een hogere concentratie van VRC tijdens hybridisatie. Toevoeging van VRC in deze twee stappen verbeterd de consistentie van de resultaten van de smFISH, eventueel door beter behoud van de molecules van RNA tegen nuclease activiteit, die kan worden ingevoerd door de mix van de zymolyase (het enzym wordt gezuiverd van grove extracten en RNase kan bevatten verontreinigingen). Dus raden we het bedrag van de VRC zoals vermeld in onze protocol of zelfs hogere concentraties van VRC voor optimalisatie.

Een aanzienlijk deel van de cellen kan worden verloren tijdens de stappen wassen in Buffer B zowel de formamide was buffer. Verklein cel verlies en kon men de centrifugeren-snelheid te verhogen. In ons geval wast met een hoge snelheid (21.000 x g) aan onze stalen pellet tijdens de Buffer B aanzienlijk verminderd cel verlies. Cellen worden echter zeer kwetsbaar na zymolyase de spijsvertering, dus snelheid van centrifugeren wordt aangeraden niet te wijzigen. In plaats daarvan raden we u de lage wrijvingscoëfficiënt buizen van wetenschappelijke USA, die enorm helpen de cellen tijdens de wast in de formamide was buffer pellet. Ons protocol kan over het algemeen consequent een monolayer van cellen dicht genoeg voor efficiënte imaging genereren. Meestal 7 gezichtsveld moet opleveren > 130 cellen geschikt voor kwantificering.

Tot slot is het belangrijk om te bepalen van de optimale parameters voor en de uitgangen van de beeldanalyse nodig. U wilt opsporen smFISH vlekken, gepubliceerde analyse programma’s algemeen filteren van de raw beelden met Gaussiaans kernel te verwijderen van de achtergrond signaal, en vragen de gebruikers om te bepalen van de signaal-/ ruisverhouding te gebruiken voor elke set afbeeldingen2,17. Helaas is er momenteel niet één standaard waaraan de juiste parameters worden bepaald, en dus het aantal empirische testen van deze verschillende instellingen is noodzakelijk. Als u wilt instellen van de parameters die nodig zijn voor elk van deze stappen, moet een iteratief input van verschillende sets van parameters en controleren hoe goed de resultaten verkregen uit elke verzameling overeenkomt met dat van handmatig tellen in een paar representatieve cellen. Zodra een set parameters wordt gevonden, kan het worden gebruikt voor de meeste van de beelden verkregen ondanks verschillende groei omstandigheden en genetische achtergronden.

Daarnaast kan een testen als maximale intensiteit projectie van de beelden van de smFISH kan worden uitgevoerd vóór kwantificering22. Deze stap vereenvoudigt de plek detectie algoritme en vermindert het imaging tijd, maar ten koste van wat potentieel nuttige informatie over individuele plekken, zoals hun subcellular localisatie. In ons geval was het aantal mRNA-moleculen die geproduceerd door de NDC80 -gen laag genoeg dat de plekken goed na deze verwerking (niet ongebruikelijk gescheiden waren voor afschriften in ontluikende3,,7 gist). In gevallen waar colocalization analyse is van cruciaal belang, moet de pijpleiding analyse om te bepalen van de locatie van elke plek van de smFISH in elk kanaal om te beoordelen van de colocalization. Afhankelijk van de specifieke vragen wordt gevraagd, andere informatie zoals de intensiteit van elke vlek wellicht ook moet worden geëxtraheerd vanaf de pijpleiding voor verdere analyse. Optimaliseren van de sleutel stappen in het protocol en de afbeelding analyse pijpleiding is cruciaal bij het verkrijgen van hoge kwaliteit van de smFISH gegevens te onderzoeken van de kwestie van belang.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Anne Dodson en Stephanie Heinrich voor advies over hoe te optimaliseren het protocol smFISH, Xavier Darzacq voor hulp bij de analyse platform, Haiyan Huang voor suggesties over de statistische analyse. Dit werk werd gesteund door middelen uit de maart van dubbeltjes (5-FY15-99), Pew Charitable Trusts (00027344), Damon Runyon Cancer Research Foundation (35-15) en Glenn Foundation naar EÜ en NSF Graduate Research Fellowship Grant Nee. DGE-1106400 naar JC.

Materials

BSA, RNase-free (50 mg/mL) Ambion AM2616 Store at -20 °C.
Catalase Sigma C3515 Store at 4 °C for short-term. Vortex before use.
DAPI Sigma D9564 Store at -20 °C after reconstitution in water. Protect from light.
50% Dextran Sulfate Milli Pore S4030 Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience.
E. coli tRNA Sigma R4251 Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water.
Ethanol (100%, 200 proof) various Flammable.
37% Formaldehyde Fisher F79-500 Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution.
Formamide Ambion AM9342 Store at 4 °C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution. 
Glucose various Store at 4 °C after dissolving in nuclease-free water.
Glucose oxidase Sigma G2133 Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5.
Nuclease-free water Ambion AM9932 Store at room temperature.
Potassium phosphate (monobasic and dibasic) various Store at room temperature.
Probe library, diluted in TE, pH 8.0  Biosearch Technologies Store at -20 °C in aliquots (5 µL) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light. 
Sorbitol various Store at room temperature.
20X SSC Ambion AM9763 Store at room temperature.
TE, pH 8.0 Ambion AM9849 Store at room temperature.
1 M Tris, pH 8.0 Ambion AM9856 Store at room temperature.
Trolox Sigma 238813 Store at -20 °C in aliquots.
200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) NEB S1402S Store at -20 °C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer.
Zymolyase 100T MP Biomedicals 08320932 Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water.
Low-adhesion tubes USA Scientific 1415-2600 Store at room temperature.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
  2. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
  3. Rahman, S., Zenklusen, D. Single-molecule resolution fluorescent in situ hybridization (smFISH) in the yeast S. cerevisiae. Methods Mol Biol. 1042, 33-46 (2013).
  4. Gaspar, I., Ephrussi, A. Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).
  5. Vargas, D. Y., et al. Single-molecule imaging of transcriptionally coupled and uncoupled splicing. Cell. 147 (5), 1054-1065 (2011).
  6. Waks, Z., Klein, A. M., Silver, P. A. Cell-to-cell variability of alternative RNA splicing. Mol Syst Biol. 7, 506 (2011).
  7. Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast. Nat Struct Mol Biol. 15 (12), 1263-1271 (2008).
  8. Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).
  9. Senecal, A., et al. Transcription factors modulate c-Fos transcriptional bursts. Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).
  10. Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells. Nat Methods. 10 (9), 865-867 (2013).
  11. Hansen, C. H., van Oudenaarden, A. Allele-specific detection of single mRNA molecules in situ. Nat Methods. 10 (9), 869-871 (2013).
  12. Ginart, P., et al. Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant. Genes Dev. 30 (5), 567-578 (2016).
  13. Long, R. M., et al. Mating type switching in yeast controlled by asymmetric localization of ASH1 mRNA. Science. 277 (5324), 383-387 (1997).
  14. Park, H. Y., Trcek, T., Wells, A. L., Chao, J. A., Singer, R. H. An unbiased analysis method to quantify mRNA localization reveals its correlation with cell motility. Cell Rep. 1 (2), 179-184 (2012).
  15. Jourdren, L., Delaveau, T., Marquenet, E., Jacq, C., Garcia, M. CORSEN, a new software dedicated to microscope-based 3D distance measurements: mRNA-mitochondria distance, from single-cell to population analyses. RNA. 16 (7), 1301-1307 (2010).
  16. Chen, J., et al. Kinetochore inactivation by expression of a repressive mRNA. eLife. 6, e27417 (2017).
  17. Mueller, F., et al. FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images. Nat Methods. 10 (4), 277-278 (2013).
  18. Brar, G. A., et al. High-resolution view of the yeast meiotic program revealed by ribosome profiling. Science. 335 (6068), 552-557 (2012).
  19. Carlile, T. M., Amon, A. Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin. Cell. 133 (2), 280-291 (2008).
  20. Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2. Genes Dev. 17 (12), 1524-1539 (2003).
  21. Dodson, A. E., Rine, J. Heritable capture of heterochromatin dynamics in Saccharomyces cerevisiae. eLife. 4, e05007 (2015).
  22. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat Protoc. 7 (2), 408-419 (2012).
  23. Youk, H., Raj, A., van Oudenaarden, A. Imaging single mRNA molecules in yeast. Methods Enzymol. 470, 429-446 (2010).

Tags

Single Molecule RNASmFISHBudding YeastVegetative GrowthMeiosisGene ExpressionSubcellular RNA LocalizationFormaldehyde FixationVanadyl Ribonucleoside ComplexesBuffer BZymolyaseDigestion

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Chen, J., McSwiggen, D., Ünal, E. Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis. J. Vis. Exp. (135), e57774, doi:10.3791/57774 (2018).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image