JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurosciences

Краситель FM Велоспорт на синапсе: сравнение деполяризации высоким содержанием калия, электрических и Channelrhodopsin стимуляции

Published: May 24, 2018
doi:
10.3791/57765
,
1Department of Biological Sciences,Vanderbilt University, 2Departments of Biological Sciences, Pharmacology, Cell and Developmental Biology, Kennedy Center for Research on Human Development,Vanderbilt University and Medical Center

Summary

Синаптических пузырьков (SV) Велоспорт-это основной механизм межклеточные связи в нейрональных синапсах. Поглощение красителя FM и выпуска являются основным средством количественно опробование SV эндо – и экзоцитоз. Здесь мы сравниваем все методы стимуляции для привода FM1-43 Велоспорт на синапсы модели нервно-Джанкшен (NMJ) дрозофилы .

Abstract

FM красители используются для изучения цикла синаптических пузырьков (SV). Эти зонды амфифильными есть гидрофильные головы и гидрофобных хвост, делая их водорастворимый с возможностью обратного въезда и выезда из мембраны липидных бислоев. Эти стириловых красителей относительно не флуоресцентные в водной среде, но вызывает вставку в наружный листок плазматической мембраны > 40 X увеличение флуоресценции. В нейрональных синапсах FM красители учитываются во время SV эндоцитоза, ставших предметом торговли, как внутри, так и между SV бассейны и выпущенные с SV экзоцитоз, обеспечивая мощный инструмент для визуализации Пресинаптический этапы синапсах. Основная генетических модель глутаматергические синапсов и функции — дрозофилы нервно-Джанкшен (NMJ), где FM красителя изображений широко используется для количественного определения SV динамика в широком диапазоне условий, мутант. В NMJ синаптических терминал легко доступны, с массивом красивых больших синаптической boutons идеально подходит для визуализации приложений. Здесь, мы сравним и контраст три способа стимулирования дрозофилы NMJ водить зависящих от деятельности FM1-43 краситель поглощения/выпуска: 1) Ванна применение высокого [K+] depolarize нервно-мышечных тканей, 2) всасывания электрода двигательного нерва стимуляция depolarize Пресинаптический нервных терминал и 3) целевых трансгенных выражение channelrhodopsin вариантов для света стимулирует, пространственного управления деполяризации. Каждый из этих методов имеет преимущества и недостатки для изучения генетической мутации воздействия на цикл SV на дрозофилы NMJ. Мы будем обсуждать эти преимущества и недостатки для оказания помощи при выборе стимуляции подхода, а также методологий, специфичные для каждой стратегии. Кроме флуоресцентный изображений, FM красители могут быть photoconverted электронно плотные сигналы визуализируется с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА) для изучения механизмов цикла SV на ультраструктурные уровне. Мы предоставляем сравнения конфокальных и электронной микроскопии изображений из различных методов дрозофилы NMJ стимуляции, чтобы помочь при выборе будущих экспериментальных парадигм.

Introduction

СИНАПС красиво характеризуется глутаматергические дрозофилы личиночной нервно-Джанкшен (NMJ) модель использовалась для изучения формирования синапсов и функции с широкий спектр генетических возмущений1. Мотонейрона терминал состоит из нескольких ветвей аксона, каждый с многими расширенного синаптической boutons. Эти емкие Варикоз (до 5 мкм в диаметре) содержат все синапсах механизма, включая единый глутаматергические синаптических пузырьков (СВС; ~ 40 Нм в диаметре) в цитозольной резерва и легко публикуемой бассейна2. Эти пузырьки док на пресинаптической мембраной плазмы фьюжн сайта активных зон (АЗС), где экзоцитоз опосредует выпуск нейромедиатора глутамата для транс-синаптической связи. Впоследствии СВС извлекаются из плазматической мембраны через поцелуй и побегите рециркуляции или Клатрин опосредованный эндоцитоз (CME) для повторного exo/эндоцитоза циклов. Дрозофилы NMJ легко доступны и хорошо подходит для изоляции и характеризующие SV цикла мутантов. Использование вперед генетических экранов, Роман мутации привели к выявлению новых генов критическое для SV цикла3. Кроме того обратный генетические подходы, начиная с уже известных генов привели к прояснению новых механизмов SV цикла через тщательное описание мутант Велоспорт фенотипов4. Дрозофилы NMJ почти идеально как экспериментальный синаптических подготовка для рассечения SV эндоцитоза и экзоцитоз механизмов через методы для оптически трек везикул Велоспорт в синапсах.

Широкий спектр флуоресцентные маркеры позволяют визуального отслеживания во время Велоспорт динамика пузырьков, но наиболее универсальным являются аналогами краситель FM, которые впервые синтезирован Мао, ф., и др. 5. структурно, FM красители содержат гидрофильные головы и липофильных хвост, подключенных через ароматическое кольцо, с центральным регионом, присвоении спектральных свойств. Эти стириловых красителей обратимо разделов в мембранах, не «триггер» между мембраны листовки и поэтому никогда не бесплатно в цитозоле и гораздо более флуоресцентные в мембранах, чем воды5. Реверсивные вставки липидного бислоя вызывает увеличение разницей флуоресценции6. В нейрональных синапсах Классический FM краска маркировки эксперименты состоят из купания синаптических подготовки с красителем во время расшатывания стимуляции для загрузки краситель через SV эндоцитоз. Внешние краситель затем смыл и SV цикла арестован в растворе кальция бесплатный звонок для изображения загружены синапсы7. Второй раунд стимуляции в бане бесплатно краска триггеров релиз FM через экзоцитоз, процесс, который может следовать путем измерения снижение интенсивности флуоресценции. SV населения из одного везикул в бассейны, содержащих сотни везикулы может быть количественно Мониторим6,7. FM красители были использованы для рассечения зависит от активности мобилизации функционально различных бассейнов SV и сравнить поцелуй и побегите против CME Велоспорт8,9. Этот метод был изменен для отдельно пробирного вызывали, спонтанной и миниатюрные синаптических цикла мероприятия (с весьма чувствительной оборудованием для обнаружения изменения очень маленькие флуоресценции и уменьшить Фотообесцвечивание)10. Анализов могут быть расширены до уровня ультраструктурных photoconverting флуоресцентные FM сигнала в электронно плотные этикетку для передачи электронной микроскопии11,12,13,14 .

Исторически купание синаптических препаратов в высокой концентрации калия (далее именуемые как «high [K+]») был методом выбора для расшатывания стимуляции заставить SV Велоспорт; Начиная от лягушки холинергических NMJ5, культивированный грызунов мозга Нейроны гиппокампа15, до16,модель дрозофилы глутаматергические NMJ17. Этот высокий [K+] подход прост, не требует специализированного оборудования и поэтому доступен для большинства лабораторий, но имеет ограничения для приложений и интерпретации данных. Гораздо более физиологически соответствующий метод заключается в использовании всасывания электрода электростимуляции нервов4,5,12. Этот подход диски действий потенциал распространения для прямой стимуляции Пресинаптический нерва терминала, и результаты можно непосредственно по сравнению с электрофизиологических анализов синапсах функции13,14, 15, но требует специализированного оборудования и технически гораздо более сложной. С появлением Оптогенетика использование channelrhodopsin нейронной стимуляции имеет дополнительные преимущества, включая контроль пространственно-временных канала выражения с использованием двоичной системы Gal4/Уан20. Этот подход является технически гораздо проще, чем всасывания электрод стимуляции и требует не более чем очень дешевые светодиодный источник света. Здесь, мы используем изображения FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) пиридиния дибромид) как сравнить и сопоставить эти три различных стимуляции методы на дрозофилы NMJ: простой средней [K+ ], сложных электрических и новой channelrhodopsin подходы.

Protocol

1. личиночной клей рассечение Тщательно смешайте 10 частей силиконового эластомера базы с 1 частью силиконового эластомера Вулканизирующий агент из эластомера kit (Таблица материалов). Пальто coverslips 22 x 22 мм стекла с эластомера и лечения на горячей плите на 75 градусов на …

Representative Results

Рисунок 1 показывает поток работы для деятельности зависимых FM красителя изображений протокол. Эксперимента всегда начинается с же личиночной клей рассечение, независимо от метода стимуляции впоследствии используется. Рисунок 1a явля?…

Discussion

Высокое [K+] физиологический деполяризующий стимуляция является на сегодняшний день самым простым из трех вариантов для зависящих от деятельности FM краситель Велоспорт, но вероятно наименее физиологических29. Этот простой метод depolarizes каждой доступной клетки тела жи?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим членов Broadie лаборатории за вклад в эту статью. Эта работа была поддержана низ R01s MH096832 и MH084989 к.б. и низ лектор стипендий F31 MH111144 для D.L.K.

Materials

SylGard 184 Silicone Elastomer Kit Fisher Scientific NC9644388 To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22×22-1 Fisherbrand 12-542-B To put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200 Thermolyne HPA2235M To cure the SylGard
Plexi glass dissection chamber N/A N/A Handmade
Borosilicate Glass Capillaries WPI 1B100F-4 To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette Puller Sutter Instrument P-2000 To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory Tubing Component Supply Co. TET-031A For mouth and suction pipette
P2 pipette tip USA Scientific 1111-3700 For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube cap Fisher Scientific 05-408-120 Used to put glue in for dissection
Vetbond 3M WPI vetbond Glue used for dissections
Potassium Chloride Fisher Scientific P-217 Forsaline
Sodium Chloride Millipore Sigma S5886 For saline
Magnesium Chloride Fisher Scientific M35-500 For saline
Calcium Chloride Dihydrate Millipore Sigma C7902 For saline
Sucrose Fisher Scientific S5-3 For saline
HEPES Millipore Sigma H3375 For saline
HRP:Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 123-605-021 To label neuronal membranes
Paintbrush Winsor & Newton 94376864793 To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5 WPI 500233 Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm) WPI 14177 Used during dissection 
FM1-43 Fisher Scientific T35356 Fluorescent styryl dye
Digital Timer VWR 62344-641 For timing FM dye load/unload 
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope Zeiss For imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0 Zeiss Software for imaging on confocal
HeNe 633nm laser Lasos To excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laser Lasos To excite the FM dye during imaging
Micro-Forge WPI MF200 To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip Tip BD 301625 To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base) Narishige MMN-9 To control the suction electrode for electrical stimulation
Stimulator Grass S48 To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop Microscope Zeiss Used during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion Objective Zeiss Used during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans Retinal Millipore Sigma R2500 Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port Zeiss 2000-C Used during channelrhodopsin stimulation
LED 470nm ThorLabs M470L2 Used for ChR activation
T-Cube LED Driver ThorLabs LEDD1B To control the LED
LED Power Supply Cincon Electronics Co. TR15RA150 To power the LED
Optical Power and Energy Meter ThorLabs PM100D To measure LED intensity
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
  2. Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat Rev Neurosci. 6 (1), 57-69 (2005).
  3. Long, A. A., et al. Presynaptic calcium channel localization and calcium-dependent synaptic vesicle exocytosis regulated by the Fuseless protein. J Neurosci. 28 (14), 3668-3682 (2008).
  4. Kopke, D. L., Lima, S. C., Alexandre, C., Broadie, K. Notum coordinates synapse development via extracellular regulation of Wingless trans-synaptic signaling. Development. 144 (19), 3499-3510 (2017).
  5. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
  6. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J Cell Biol. 168 (6), 929-939 (2005).
  7. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
  8. Dickman, D. K., Horne, J. A., Meinertzhagen, I. A., Schwarz, T. L. A Slowed Classical Pathway Rather Than Kiss-and-Run Mediates Endocytosis at Synapses Lacking Synaptojanin and Endophilin. Cell. 123 (3), 521-533 (2005).
  9. Verstreken, P., et al. Endophilin Mutations Block Clathrin-Mediated Endocytosis but Not Neurotransmitter Release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
  10. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. -. Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of synaptic vesicle recycling using FM dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities. J Vis Exp. (85), (2014).
  11. Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36 (5), 555-559 (1988).
  12. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes. J Vis Exp. (36), e1790 (2010).
  13. Sabeva, N. S., Bykhovskaia, M. FM1-43 Photoconversion and Electron Microscopy Analysis at the Drosophila Neuromuscular Junction. Bio-protocol. 7 (17), (2017).
  14. Sabeva, N., Cho, R. W., Vasin, A., Gonzalez, A., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Complexin Mutants Reveal Partial Segregation between Recycling Pathways That Drive Evoked and Spontaneous Neurotransmission. J Neurosci. 37 (2), 383-396 (2017).
  15. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  16. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  17. Trotta, N., Rodesch, C. K., Fergestad, T., Broadie, K. Cellular bases of activity-dependent paralysis in Drosophila stress-sensitive mutants. J Neurobiol. 60 (3), 328-347 (2004).
  18. Long, A. A., et al. The nonsense-mediated decay pathway maintains synapse architecture and synaptic vesicle cycle efficacy. J Cell Sci. 123 (Pt 19), 3303-3315 (2010).
  19. Parkinson, W., Dear, M. L., Rushton, E., Broadie, K. N-glycosylation requirements in neuromuscular synaptogenesis. Development. 140 (24), 4970-4981 (2013).
  20. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), (1993).
  21. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc Natl Acad Sci. 79 (8), (1982).
  22. Paschinger, K., Rendić, D., Wilson, I. B. H. Revealing the anti-HRP epitope in Drosophila and Caenorhabditis. Glycoconj J. 26 (3), 385-395 (2009).
  23. Ramachandran, P., Budnik, V. Fm1-43 labeling of Drosophila larval neuromuscular junctions. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (8), (2010).
  24. Yawo, H., Kandori, H., Koizumi, A. . Optogenetics: light-sensing proteins and their applications. , (2015).
  25. Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J Neurophysiol. 101 (6), 3075-3088 (2009).
  26. Hornstein, N. J., Pulver, S. R., Griffith, L. C. Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions. J Vis Exp. (25), e1133 (2009).
  27. Britt, J. P., McDevitt, R. A., Bonci, A. Use of channelrhodopsin for activation of CNS neurons. Curr Protoc Neurosci. , (2012).
  28. Lin, J. Y. A user’s guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  29. Vijayakrishnan, N., Woodruff, E. A., Broadie, K. Rolling blackout is required for bulk endocytosis in non-neuronal cells and neuronal synapses. J Cell Sci. 122, 114-125 (2009).
  30. Honjo, K., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Optogenetic manipulation of neural circuits and behavior in Drosophila larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1470-1478 (2012).
  31. Dear, M. L., Shilts, J., Broadie, K. Neuronal activity drives FMRP- and HSPG-dependent matrix metalloproteinase function required for rapid synaptogenesis. Sci Signal. 10 (504), (2017).
  32. Baldwin, M. L., Rostas, J. A. P., Sim, A. T. R. Two modes of exocytosis from synaptosomes are differentially regulated by protein phosphatase types 2A and 2B. J Neurochem. 85 (5), 1190-1199 (2003).
  33. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  34. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  35. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  36. Lin, J. Y. A user’s guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  37. Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5942-5947 (2000).
  38. Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. R. Tetrodotoxin Blockage of Sodium Conductance Increase in Lobster Giant Axons. J Gen Physiol. 47 (5), 965-974 (1964).
  39. Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiol Rev. 54 (4), 813-889 (1974).
  40. Kuromi, H., Yoshihara, M., Kidokoro, Y. An inhibitory role of calcineurin in endocytosis of synaptic vesicles at nerve terminals of Drosophila larvae. Neurosci Res. 27 (2), 101-113 (1997).
  41. Seamon, K. B., Daly, J. W. Forskolin, cyclic AMP and cellular physiology. Trends Pharmacol Sci. 4, 120-123 (1983).
  42. Zhang, D., Kuromi, H., Kidokoro, Y. Synaptic Transmission at the Drosophila Neuromuscular Junction: Effects of Metabotropic Glutamate Receptor Activation. Slow Synaptic Responses Modul. , 260-265 (2000).
  43. Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19 (5), 1557-1565 (1999).
  44. Kuromi, H., Kidokoro, Y. Selective Replenishment of Two Vesicle Pools Depends on the Source of Ca2+ at the Drosophila Synapse. Neuron. 35 (2), 333-343 (2002).
  45. Kay, A. R., et al. Imaging Synaptic Activity in Intact Brain and Slices with FM1-43 in C. elegans, Lamprey, and Rat. Neuron. 24 (4), 809-817 (1999).
  46. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of Synaptic Activity in Hippocampal Slices with FM1-43 Enabled by Fluorescence Quenching. Neuron. 24 (4), 803-808 (1999).
  47. Denker, A., Rizzoli, S. O. Synaptic vesicle pools: an update. Front Synaptic Neurosci. 2, 135 (2010).
  48. Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol. 587 (12), 2919-2926 (2009).
  49. Wucherpfennig, T., Wilsch-Bräuninger, M., Gonz ález-Gait án, M. Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release. J Cell Biol. 161 (3), 609-624 (2003).

Tags

FM DyeSynaptic Vesicle CyclingNeuromuscular JunctionDrosophila LarvaeHigh Potassium DepolarizationElectrical StimulationOptogeneticsAnti-HRP AntibodyElastomer-coated CoverslipDissectionGluingMotor NerveCalcium-free SalineSuction PipetteMicroelectrode PullerMicro ForgeMicromanipulator

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation. J. Vis. Exp. (135), e57765, doi:10.3791/57765 (2018).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image