Tintura de FM ciclismo a sinapse: comparando a despolarização de potássio alto, elétrica e Channelrhodopsin estimulação

O maravilhosamente caracterizado Drosophila larval junção neuromuscular (JNM) glutamatérgico sinapse modelo tem sido usado para estudar a formação de sinapses e função com um vasto espectro de perturbações genéticas¹. O terminal do neurônio motor é composto por várias ramificações do axônio, cada um com muitos boutons sinápticas alargadas. Essas varicosidades espaçosa (até 5 µm de diâmetro) contêm todas a neurotransmissão, incluindo máquinas glutamatérgico uniforme de vesículas sinápticas (SVs; ~ 40 nm de diâmetro) na reserva citosólica e prontamente liberável piscinas². Essas vesículas ancorar na membrana pré-sináptica de plasma fusão local ativo zonas (AZs), onde a exocitose Medeia a liberação do neurotransmissor glutamato para trans-comunicação sináptica. Posteriormente, as SVs são recuperadas da membrana plasmática através do beijo e executar reciclagem ou endocitose mediada por Clatrina (CME) por ciclos repetidos de exo/endocitose. A Drosophila Nicotínico é facilmente acessível e adequado para isolar e caracterizar os mutantes de ciclo SV. Usando telas de genéticas para a frente, mutações romance conduziram à identificação de novos genes críticos para o ciclo SV³. Além disso, abordagens de genéticas reversos começando com genes já conhecidos conduziram para a elucidação de novos mecanismos de ciclo SV através a cuidadosa descrição do mutante ciclismo fenótipos⁴. A Drosophila Nicotínico é quase ideal como uma preparação experimental sináptica para dissecar os mecanismos de endocitose e exocitose SV via métodos de opticamente vesículas de pista de ciclismo durante a neurotransmissão.

Uma gama de marcadores fluorescentes permitem rastreamento visual das vesículas durante a ciclagem dinâmica, mas o mais versátil é análogos de tintura de FM que é sintetizado pela primeira vez Mao, F., et al. ⁵. estruturalmente, FM corantes contêm uma cabeça hidrofílica e uma cauda lipofílica conectado através de um anel aromático, com uma região central, conferindo Propriedades espectrais. Estes styryl corantes particionar reversível em membranas, não ‘perder um combate’ entre membrana folhetos e nunca são tão livre no citosol e são muito mais fluorescente em membranas de água⁵. Inserção reversível em uma bicamada lipídica provoca um 40-fold aumento na fluorescência⁶. Em sinapses neuronais, clássico FM tintura etiquetando as experiências consistem em banhar a preparação sináptica com o corante durante despolarizantes estimulação para carregar corante através de endocitose SV. Tintura externa é então lavada e o ciclo SV é preso em uma solução de ringer livre de cálcio a imagem carregada sinapses⁷. Uma segunda ronda de estimulação em um banho sem corantes provoca a liberação de FM por exocitose, um processo que pode ser seguido por medição a diminuição de intensidade de fluorescência. Populações de SV de uma única vesícula para piscinas contendo centenas de vesículas podem ser monitorada quantitativamente^6,7. Corantes de FM têm sido utilizados para dissecar dependente da atividade de mobilização das piscinas SV funcionalmente distintas e para comparar beijo e executar vs CME ciclismo^8,9. O método foi modificado para separadamente do ensaio evocado, espontânea e miniatura sináptica ciclo de atividades (com equipamento altamente sensível para detectar alterações de fluorescência muito pequenas e reduzir fotobranqueamento)¹⁰. Ensaios podem ser estendidos ao nível ultraestrutural por photoconverting o sinal de FM fluorescente em um rótulo de elétron-densa para transmissão microscopia eletrônica^11,12,13,14 .

Historicamente, banho preparações sináptica em uma alta concentração de potássio (doravante referida como “alta [K⁺]”) tem sido o método de escolha para despolarizar a estimulação para induzir SV ciclismo; que vão desde o sapo colinérgico Nicotínico⁵, a culta neurônios hippocampal cérebro de roedor¹⁵, para a Drosophila glutamatérgico MNJ modelo^16,17. Esta abordagem de [K⁺] alta é simples, exige nenhum equipamento especializado e, portanto, é acessível para a maioria dos laboratórios, mas tem limitações para aplicação e interpretação dos dados. Um método muito mais fisiologicamente apropriado é usar sucção eletrodo de estimulação elétrica do nervo^4,5,12. Essa abordagem conduz a propagação do potencial de ação para estimulação direta do nervo pré-sináptica terminal, e os resultados podem ser directamente comparados a ensaios eletrofisiológicos de neurotransmissão função^{13,14, 15}, mas requer equipamento especializado e é tecnicamente muito mais desafiador. Com o advento da optogenetics, o uso da estimulação neuronal channelrhodopsin tem vantagens adicionais, incluindo controle spatiotemporal apertado de expressão de canal usando o binário Gal4/UAS sistema²⁰. Esta abordagem é tecnicamente muito mais fácil do que a estimulação de sucção eletrodo e requer nada mais do que uma fonte de luz LED muito barata. Aqui, nós empregamos imagem de FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) dibrometo de piridínio) tanto a comparar e contrastar esses três métodos diferentes de estimulação para a Drosophila MNJ: alta simples [K⁺ ], desafiando channelrhodopsin elétricos e novas abordagens.