Tintura di FM in bicicletta alla sinapsi: confronto tra alto potassio depolarizzazione, elettrica e stimolazione Channelrhodopsin

Il modello splendidamente caratterizzato Drosophila larvale della giunzione neuromuscolare (NMJ) glutamatergic sinapsi è stato utilizzato per studiare la formazione della sinapsi e funzione con un vasto spettro di perturbazioni genetica¹. Il terminale del neurone di motore è costituito da più rami dell’assone, ognuno con molti boutons sinaptici allargata. Queste varicosità capiente (fino a 5 µm di diametro) contengono tutte la macchine di neurotrasmissione, comprese le vescicole sinaptiche glutamatergic uniforme (SVs; ~ 40 nm di diametro) nella riserva citosolico e facilmente rilasciabile piscine². Queste vescicole attraccano a zone attive di sito del fusione di membrana presinaptica (AZs), dove l’esocitosi media il rilascio di neurotrasmettitore glutammato per trans-comunicazione sinaptica. Successivamente, il SVs vengono recuperato dalla membrana plasmatica tramite bacio-and-run riciclaggio o endocytosis clathrin-mediato (CME) per cicli ripetuti exo/endocitosi. La Drosophila NMJ è facilmente accessibile e ben adatto per isolamento e caratterizzazione di mutanti di ciclo SV. Utilizzando schermi genetici avanti, mutazioni novelle hanno portato all’identificazione di nuovi geni critici per il ciclo di SV³. Inoltre, approcci genetici inverso a partire con geni già noti hanno portato alla delucidazione dei meccanismi di ciclo nuovi SV attraverso la descrizione accurata del mutante ciclismo fenotipi⁴. La Drosophila NMJ è quasi ideale come preparazione per dissezione meccanismi di endocitosi ed esocitosi SV tramite metodi di otticamente della vescicola di pista in bicicletta durante la neurotrasmissione sinaptica sperimentale.

Una gamma di marcatori fluorescenti permettono tracking visivo delle vescicole durante la pedalata dinamica, ma il più versatile sono analoghi di tintura di FM che è sintetizzato per la prima volta da Mao, F., et al. ⁵. strutturalmente, FM coloranti contengono una testa idrofila e una coda lipofilica collegato attraverso un anello aromatico, con una regione centrale che conferisce proprietà spettrali. Questi styryl coloranti partizione reversibilmente in membrane, non ‘Flip-flop’ tra membrana volantini e così non sono mai gratuito nel citosol e sono molto più fluorescente in membrane di acqua⁵. Inserimento reversibile in un bilayer del lipido provoca un volta 40 aumento nella fluorescenza⁶. Alle sinapsi neuronali, gli esperimenti d’etichettatura di colorante classici di FM consistono di balneazione la preparazione sinaptica con la tintura durante la depolarizzazione stimolazione per caricare tintura via il endocytosis SV. Tintura esterna viene quindi lavata e il ciclo SV viene arrestato in una soluzione di ringer senza calcio all’immagine caricata sinapsi⁷. Un secondo ciclo di stimolazione in un bagno di tintura-libero innesca il rilascio di FM attraverso l’esocitosi, un processo che può essere seguito misurando la diminuzione di intensità di fluorescenza. Popolazioni di SV da una vescicola singola per piscine contenenti centinaia di vescicole possono essere quantitativamente monitorati^6,7. FM coloranti sono stati utilizzati per sezionare la mobilitazione di attività-dipendente delle piscine SV funzionalmente distinte e per confrontare bacio-and-run vs CME ciclismo^8,9. Il metodo è stato modificato alla separatamente saggio evocato, ciclo sinaptica spontanea e miniatura attività (con attrezzature altamente sensibile per rilevare le variazioni molto piccole di fluorescenza e ridurre photobleaching)¹⁰. Le analisi possono essere estesa a livello ultrastrutturale di photoconverting il segnale FM fluorescente in un’etichetta elettrone-densi per trasmissione microscopia elettronica^11,12,13,14 .

Storicamente, la balneazione preparazioni sinaptiche in un’alta concentrazione di potassio (in appresso denominato “alta [K⁺]”) è stato il metodo di scelta per depolarizzazione stimolazione per indurre SV ciclismo; compreso tra la rana colinergici NMJ⁵, coltivate roditore cervello neuroni ippocampali¹⁵, per il modello^16,di Drosophila glutamatergic NMJ¹⁷. Questo approccio [K⁺] alto è semplice, non richiede nessun attrezzature specializzate e pertanto è accessibile alla maggior parte dei laboratori, ma ha limitazioni per applicazione e interpretazione dei dati. Un metodo molto più fisiologicamente appropriato consiste nell’utilizzare l’aspirazione degli elettrodi di stimolazione elettrica del nervo^4,5,12. Questo approccio unità terminale la propagazione del potenziale d’azione per stimolazione diretta dei nervi presinaptici e risultati possono essere confrontati direttamente per le analisi elettrofisiologiche di neurotrasmissione funzione^{13,14, 15}, ma richiede attrezzature specializzate ed è tecnicamente molto più impegnativo. Con l’avvento di optogenetica, l’uso della stimolazione di un neurone channelrhodopsin ha altri vantaggi, tra cui uno stretto controllo spazio-temporale dell’espressione di canale utilizzando il binario sistema Gal4/UAS²⁰. Questo approccio è tecnicamente molto più facile che la stimolazione di aspirazione elettrodo e non richiede niente di più di una sorgente di luce LED molto a buon Mercata. Qui, ci avvaliamo di formazione immagine della FM1-43 (dibromuro di pyridinium-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl)N) sia e confrontare questi tre metodi di stimolazione diversi presso la drosofila NMJ: semplice alta [K⁺ ], sfidando channelrhodopsin elettrici e nuovi approcci.