Beurteilung der Nierenfunktion in Mausmodellen der glomerulären Erkrankung

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der Gesetzgebung des Vereinigten Königreichs und lokale Ethikkommission Genehmigung durchgeführt. Tierexperimentellen Studien wurden von der Universität von Bristol Research Ethics Committee genehmigt. (1) Harn Albumin-Kreatinin-Verhältnis (uACR) Hinweis: Die uACR wird verwendet, um die Durchlässigkeit der GFB an Albumin zu beurteilen. Das Vorhandensein von Albumin im Urin weist erhöhten Durchlässigkeit in der GFB, die auf Kreatinin zu steuern für Variationen im Urin Durchflussmenge normalisiert ist. Albuminurie ist eine gemeinsame Marke für chronische Nierenerkrankungen. Sammeln Sie Urin auf der experimentellen Grundlinie und in regelmäßigen Abständen (einmal wöchentlich, einmal monatlich) bis zu den experimentellen Endpunkt. Richten Sie Maus metabolische Käfige mit Wasser und Bereicherung Ernährung. Mäuse (männlich, im Alter von 6-8 Wochen) in einzelne Käfige für 6 h in einem ruhigen Raum zu platzieren. Rückkehr Mäuse, um regelmäßige Gehäuse und sammeln Urin aus den leeren Käfigen. Ein Minimum von 50 µL ist erforderlich.Hinweis: Wenn die Maus in der vorgegebenen Zeit nicht Urin produzieren, an einem anderen Tag in einem wärmeren Raum wiederholen. Zentrifugieren der Urin bei 500 X g für 10 min. sammeln die Urin und behalten Sediment um hemolytic Verlust zu beurteilen. Speichern Sie den Urin bei-20 ° C kurzfristig an dieser Stelle. Verdünnen Sie den Urin in 1 % Rinderserumalbumin (BSA) in 1 X Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS pH 7,5) bei einer 1: 500, Verdünnung 1: 10000, je nach Schweregrad der Albuminurie.Hinweis: Das Ende-Laufwerk sollte > 400 µL optimieren, um festzustellen, die richtige Verdünnung zu jeder Zeit zeigen. Der Harn albumingehalt mithilfe eines Maus Albumin Enzym verknüpften Immunosorbentprobe Assays (ELISA) gemäß den Herstellerangaben zu quantifizieren. Kurz Mantel der ELISA-Platte, die für die Proteinbindung mit 100 µL Anti-Maus-Albumin Primärantikörper (10 µg/mL 0,5 M Karbonat-Bicarbonat pH 9,6) für 1 h bei Raumtemperatur optimiert ist. Wash überschüssige Antikörper aus dem Brunnen fünfmal mit 1 X TBS plus 0,05 % Tween (pH 8,0), und fügen Sie 200 µL Lösung (1 X TBS mit 1 % BSA pH 8.0) über Nacht bei Raumtemperatur zu blockieren. Waschen Platte fünfmal und 100 µL der Standards (serielle Verdünnung: 2000 µg/mL 15,63 µg/ml in 1 X TBS mit 1 % BSA, pH 8,0), die leer sind und die verdünnten Proben in dreifacher Ausfertigung. Lassen Sie für 1 h bei Raumtemperatur, dann waschen Sie Platte fünfmal. Fügen Sie 100 µL HRP detektionsantikörper in jede Vertiefung (10 ng/mL im 1xTBS mit 1 % BSA, pH 8,0 hinzu) und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 1 h. Waschen der Plattenrandes fünfmal und 100 µL der Enzym-Substrat-Lösung in jede Vertiefung. Lassen Sie die Platte in der Dunkelheit zu entwickeln für 15 min und stoppen die Reaktion durch Zugabe von 100 µL von 0,18 M Schwefelsäure (H2SO4).Achtung: H2SO4 ätzend ist. Bestimmen der albumingehalt jeder Probe durch die Lektüre der Platte an eine Extinktion von 450 nm. Verwenden der Standardkurve, um in jeder Probe Albumin zu quantifizieren. Haben wiederholt der technischen einen CV-Wert größer als 5 %, wiederholen Sie den Test für die Proben. Alternativ, bewerten Sie die Harn Albumin-Konzentration mit Elektrophorese. 15 µL Urin 5 µL 4 x Probenpuffer laden Eiweiß hinzufügen. Erwärmen Sie Proben zu 95 ° C für 10 min. und laden Sie zu einem 4-12 % Tris Fertigteile Gel. Führen Sie das Gel bei 100 V und Fleck über Nacht in Coomassie blau pro des Herstellers Protokoll. Verwenden Sie nachdem das Gel imaging Densitometrie um Falte Änderung albumingehalt relativ zum Steuerelement zu beurteilen.Hinweis: Wenn keine Bands für Albumin als erwartet beobachtet werden, bewerten die Proteinkonzentration des Urins und die Lautstärke des Urins hinzugefügt, um das Gel. Verdünnen Sie die rohen Urinprobe in dH2O am 01:10, 1:1 und 1:5.Hinweis: Das Ende-Laufwerk sollte > 70 µL. optimieren, um die richtige Verdünnung jeder Probe zu bestimmen. Der Harn Kreatininkonzentration mit einer chemischen Assay pro Kit Anweisungen zu quantifizieren. Kurz, laden Sie 20 µL Kreatinin Normen, leer oder verdünnter Urin zu einer 96-well-Platte in dreifacher Ausfertigung. Die Kreatininkonzentration von jeder Probe zu bestimmen, durch das Lesen der Platte an eine Extinktion von 490 nm vor und nach der Zugabe der sauren Lösung (Vorsicht, ätzend; Hautkontakt vermeiden).Hinweis: Der Unterschied zwischen den Werten der Absorption ist direkt proportional zu der Kreatininkonzentration in jeder Probe. Eine Standardkurve ist Generation von Standards. Haben wiederholt der technischen einen CV-Wert größer als 5 %, wiederholen Sie den Test für die Proben. Die uACR (µg/mg) zu generieren. Die Daten auf den Ausgangswert von jeder Maus für grafische Darstellung zu normalisieren. (2) Gewebe und Blutentnahme Hinweis: Die Niere und glomerulären Gewebe lässt sich beurteilen, Struktur-, Protein- und mRNA Ausdruck Marker für Nierenerkrankungen. Das Blut kann verwendet werden, um Marker der Nierenfunktion, wie z.B. Kreatinin, beurteilen die in Nierenerkrankungen, zeigt einen Rückgang der Filterkapazität der Glomeruli bis geregelt werden können. Bereiten Sie die folgenden Lösungen: frische 2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M Natrium Cacodylate (pH 7,3), 4 % Paraformaldehyd in 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), Säugetier-Ringer-Lösung (115 mM Natriumchlorid (NaCl), 10 mM Natriumacetat (CH3COONa) 1,2 mM Natriumphosphat (Na2HPO4), 25 MM Natriumbicarbonat (Nahco33), 1,2 mM Magnesium-Sulfat (MgSO4), 1 mM-Kalzium-Chlorid (CaCl2), 5,5 mM D (+) Glucose, pH 7.4) mit 1 % BSA und 1 X PBS.Achtung: 2,5 % Glutaraldehyd: giftig, sensibilisierend, reizend; Verwenden Sie in einem Schrank Rauch. 0,1 M Natrium Cacodylate: giftig, Einsatz in einem Rauch-Schrank. 4 % PFA: Fixiermittel, Einsatz in Rauch Schrank Bereiten Sie die folgenden Materialien: Isofluran, kleine Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA)-beschichtete Röhrchen Blut, 23-25G-Nadeln, 5 mL EDTA beschichtet Spritzen, 10 mL Glasfläschchen, Kunststoff 10 mL Fläschchen, 0,5 mL-Kunststoff-Rohre, Einweg-Gewebe Formen, Trockeneis, Flüssigkeit N 2, chirurgische mauswerkzeuge und optimale schneidmedium (OCT). Platzieren Sie den Mauszeiger in tiefen Narkose, die von der Maus nicht mehr reagiert, eine Nadel stechen um die Fußauflage mit einer Isofluran-Kammer oder gleichwertigen Routen der terminal Anästhesie wie injizierbare Anästhetika (Pentobarbital, 50 mg/kg wird überprüft intraperitoneal [IP]; Avertin, 240 mg/kg IP) oder Kohlendioxid (CO2) Exposition (75 % CO225 % O2). Keulen Sie Maus über Herzpunktion in den linken Ventrikel zu und sammeln Sie so viel Blut wie möglich. Übertragen Sie auf das Rohr beschichtet, EDTA Blut für bis zu 4 h. Falls gewünscht, können Mäuse durch zervikale Dislokation mit Sorgfalt nicht an der Halsschlagader platzen gekeult werden. Sezieren Sie, die Nieren durch den Bauch und Waschen mit Eis kalt 1 X PBS-Puffer. Prüfung der kortikalen Glomeruli, einen Pol der Niere Kortex zu entfernen und in 1 mm3 Stücke schneiden. Um die tief Juxta medulläre Glomeruli zu untersuchen, wiederholen Sie die gleiche Technik mit Gewebe aus der Medulla. Legen Sie in 5 mL 2,5 % Glutaraldehyd Lösung in ein Glas EM Fläschchen. Shop bei 4 ° C.Achtung: 2,5 % Glutaraldehyd Lösung: giftig, sensibilisierend, reizend; Verwenden Sie in einem Schrank RauchHinweis: Prozess innerhalb von 1 Monat für die besten Ergebnisse. Für Histologie, entfernen Sie das obere Drittel einer Niere, um sicherzustellen, kortikale und Juxta medulläre Glomeruli werden anwesend sein, und Fix in 5 mL 4 % Paraformaldehyd bei 4 ° C für 24 h Transfer bis 5 mL 70 % EtOH 24 Stunden vor dem Einbetten in Paraffin.Achtung: 4 % PFA: Fixiermittel, Einsatz in Rauch Schrank Platz für Immunfluoreszenz, ein Drittel der Niere, um sicherzustellen, kortikale und medulläre Glomeruli werden anwesend sein, in das Gewebe Schimmel und Mantel im Oktober auf Trockeneis, Einfrieren und lagern bei-80 ° C. Für Proteine und RNA Einfrieren Platz 3 x 2 mm3 Stücke der Niere Kortex in 0,5 mL-Kunststoff-Rohre und Snap in Flüssigkeit N2. Shop bei-80 ° C. Für die Langzeitlagerung Gewebe für RNA Gewebe in 5 Bänden der RNA-Stabilisierung-Lösung und bei-80 ° c Lagern Zur Isolierung der Glomeruli die restlichen nierengewebe zerschneiden und in 5 mL Säugetier-Ringer-Lösung mit 1 % BSA auf Eis legen. Bereiten Sie die Glomeruli sofort durch ein Sieb. 3. Plasma Kreatinin Hinweis: Plasma Kreatinin kann bis in Nierenerkrankungen, zeigt einen Rückgang der Filterkapazität der Glomeruli geregelt werden. Die Blutspiegel für Harnstoff-Stickstoff (BUN) können auch beurteilt werden, obwohl das Protokoll hier nicht beschrieben ist. Zentrifugieren der Blutprobe bei 500 X g für 15 min bei 4 ° C. Sammeln Sie das Plasma, das bei-20 ° C kurzfristig an dieser Stelle gespeichert werden kann. Die Plasmakonzentration Kreatinin mit einem chemischen Kreatinin-Assay gemäß der Anleitung oben für Harn Kreatinin im Protokoll 1.11 zu quantifizieren. Die Kreatininkonzentration von jeder Probe zu bestimmen, durch das Lesen der Platte an eine Extinktion von 490 nm vor und nach der Zugabe der sauren Lösung.Hinweis: Der Unterschied zwischen diesen Werten Absorption ist direkt proportional zu der Kreatininkonzentration in jeder Probe. Eine Standardkurve ist Generation von Standards. Haben wiederholt der technischen einen CV-Wert größer als 5 %, wiederholen Sie den Test für die Proben. 4. Isolierung der Glomeruli Hinweis: Glomeruli können isoliert werden, um die Durchlässigkeit der einzelnen Glomeruli ex Vivo, sowie der Ausdruck von spezifischen Proteins und mRNA-Marker der glomerulären Erkrankung zu bewerten. Nehmen Sie das nierengewebe in Säugetieren Ringer-Lösung mit 1 % BSA platziert und sezieren Sie die Glomeruli mit einem Standard-Siebung Technik13. Kurz, stapeln Sie 70 µm (unten), 100 µm, 125 µm, 175 µm, 250 µm und 425 µm (oben) Siebe auf ein Becherglas. Zerdrücken der Niere, mit einem Spritzenkolben in 425 µm Sieb und mit Eis kalt Säugetier-Ringer Lösung mit 1 % BSA durchzusetzen. Da die Bits der Niere durchgesetzt werden, anschließend das obere Sieb und dasselbe am nächsten. Wiederholen, bis nur die 100 µm und 70 µm Siebe bleiben. Übertragen die glomeruläre Ernte behielt die 100 µm bis 70 µm Siebe auf 10 mL frisches Säugetier-Ringer-Lösung mit 1 % BSA auf Eis.Hinweis: Ist die Anzahl der Glomeruli pro mL Ringer-Lösung einigen, reduzieren Sie die Lautstärke des Ringer Lösung verwendet, um die Glomeruli aus den letzten beiden Siebe zu sammeln. 5 mL der Lösung mit Glomeruli in zwei getrennten Röhren (2,5 mL) und Zentrifuge bei 1.000 x g für 10 min bei 4 ° c zu entfernen Entfernen des Überstands und Snap Einfrieren der Glomeruli in Flüssigkeit N2 vor der Lagerung bei-80 ° C für Proteine und RNA-Extraktion zu einem späteren Zeitpunkt. Legen Sie die restliche Lösung mit Glomeruli in einem Wasserbad bei 37 ° C für die Messung der glomerulären LpA / Vichex Vivo. Füllen Sie innerhalb von 3 h die Niere zu entfernen. (5) glomeruläre Wasserdurchlässigkeit (LpA / Vich) Hinweis: Die glomeruläre LpA / Vich Test ermöglicht es, die ex Vivo Messung der Durchlässigkeit der einzelnen Glomeruli in einem schnellen reproduzierbar. Eine Erhöhung der glomerulären LpA / Vich zeigt Störung der GFB ist suggestiv von Nierenerkrankungen. Richten Sie die glomeruläre LpA / Vich rig wie Lachs Et Al10beschrieben. Eine detaillierte Darstellung der Einrichtung finden Sie in Abbildung 1 . Bereiten Sie die folgenden Lösungen: Säugetier-Ringer-Lösung mit 1 % BSA (pH 7,4) und Säugetieren Ringer-Lösung mit 8 % BSA (pH 7,4). Beide auf 37 ° c warm Ziehen Sie Mikropipetten aus Glas-Kapillarröhrchen (optische Dichte: 1,2 mm). Generieren Sie ein 5-8 µm Blende Tipp durch Schneiden der Mikropipette unter dem Mikroskop. Verwenden Sie die glomeruläre LpA / Vich rig intakt einzelne Glomeruli zu fangen, die frei von Bowman’s Kapsel und röhrenförmigen Fragmente auf die Mikropipette mit Absaugung. Ein detaillierter Überblick über die Oncometric-Assay ist in Lachs Et Al10gefunden. Kurz gesagt, sobald ein Glomerulus abgefangen und sich am Sauger Mikropipette sicherte, beginnen Sie die Videoaufnahme des Glomerulus unter dem Mikroskop. Erstens equilibrate der Glomerulus in der 1 % BSA Ringer-Lösung für 30 s vor der Umstellung der Perifusate auf die konzentrierte 8 % BSA Ringer Lösung für 10 s. Dann die Perifusate wieder auf 1 % BSA Ringer-Lösung und beenden Sie die Aufzeichnung. Waschen Sie der Glomerulus Weg, und wiederholen Sie den Vorgang für 10-15 Glomeruli per Mausklick. Sicherzustellen, dass die Perifusate Durchflussmengen sind identisch und nicht zu schnell (10 mL/min), um nicht die glomeruläre Struktur zu verzerren. Messen Sie die erste Rate der glomerulären Schrumpfung der glomerulären Wasserdurchlässigkeit (LpA) normiert auf die glomeruläre Volumen (Vich) zu berechnen. In Salmon Et Al10finden Sie detaillierte Informationen über die Analyse. 6. Perjodsäure Schiff (PAS) Fleck Hinweis: Der PAS Fleck markiert den Keller Membranen der glomerulären Kapillaren Schleifen und das röhrenförmige Epithel. Es ermöglicht die detaillierte Visualisierung der glomerulären Zellen, Erweiterung der mesangialen Matrix und Potenzial und mögliche Veränderungen der GBM (d.h., Verdickung und Unregelmäßigkeiten). Abschnitt 5 µm Dicke auf Poly-L-Lysin beschichtete Folien ein Mikrotom mit Paraffin-eingebetteten, PFA-behoben: Niere Kortex. Trocken bei 37 ° C für 1 h Vergewissern Sie sich im Abschnitt enthält keine keine Falten oder Löcher, die die Morphologie unter dem Mikroskop verzerren können. Deparaffinize Folien durch Inkubation zweimal in Xylol (Vorsicht, reizend; Einsatz in Rauch Schrank) für 3 min, zweimal in 100 % EtOH 3 min und dann einmal in 95 %, 70 % und 50 % EtOH 3 min jeweils alle bei Raumtemperatur. Re-Hydrat Folien in dH2O. Inkubieren Sie die Folien in Perjodsäure Lösung (Vorsicht, reizend; Einsatz in Rauch Schrank) (1 g/dL) für 5 min und dann spülen verwenden Sie die Folien in mehreren Änderungen von dH2O. einen Behälter mit 100 mL dH2O bei Raumtemperatur.Achtung: Perjodsäure Lösung: reizend; Verwenden Sie im Rauch Schrank Inkubieren Sie Folien in Schiff’s Reagenz (Parasoaniline HCl 6 g/L und Natrium Metabisulfite 4 % HCl 0,25 Mol/L) für 15 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie Objektträger in fließendem Leitungswasser für 5 min. Gegenfärbung mit Hämatoxylin für 3 s vor dem Rutschen in fließendem Leitungswasser für 15 min gründlich spülen.Hinweis: Einige Optimierungen müssen die optimale Zeit für Färbung Hämatoxylin bestimmen. Folien mit der Rückseite des Protokolls 4.Wenn in Schritt 6.2 zu entwässern. Finish mit Xylol. Luft trocken Folien und Mount mit Xylol-basierte Montage Medien. Bild auf einem Lichtmikroskop bei 400 X Vergrößerung glomeruläre Strukturen zu beurteilen. Folgendes zu bewerten: Verdickung und Unregelmäßigkeiten der GBM, einstürzenden Kapillare Schlingen, fibrotische Gewebe, Sklerose, Zellproliferation (Endothelzellen, hemolytic und mesangialen oder Entzündungszellen infiltriert die Büschel).Hinweis: Für eine umfassende Bewertung der glomerulären Pathophysiologie Läsionen an anderer Stelle in der Niere sollte bewertet, wie z. B. die Tubuli. 7. die Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) Hinweis: TEM ermöglicht die Auseinandersetzung mit der Ultra-strukturelle Anomalien in der Niere, z. B. die GBM hemolytic Fuß Prozesse und endotheliale Fenestrationen, die nicht mit Lichtmikroskopie sichtbar sind. Dies ist wichtig bei Modellen wo Nierenschädigung nicht so (d. h., keine Albuminurie und strukturellen Fehlbildungen) ausgeprägt ist. Nehmen Sie die 2,5 % Gluteraldehdye – feste gewürfelte Niere und Post-fix in 1 % Osmium ausgefällt für 1 h Waschen in 50 mL 0,1 M Cacodylate-Puffer (pH 7,3) und dann 50 mL dH2O (3 x 15 min Änderungen).Achtung: 2,5 % Glutaraldehyd: giftig, sensibilisierend, reizend; Verwenden Sie in einem Schrank Rauch. 0,1 M Natrium Cacodylate: giftig, Einsatz in einem Rauch-Schrank Mit EtOH entwässern und in Harz Araldite einbetten. Abschnitten bei 50-100 nm Dicke schneiden und Färben mit 3 % (wässrigen) Uranyl Acetat und Reynolds’ Lead Citrat-Lösung. Mehrere Bereiche des Glomerulus bei 940 X digitale mikrographen übernehmen, 1250 X und 6200 X um sicher zu sein Podocytes, GEnCs, GBM und Mesangium können identifiziert werden. Verwenden Sie ImageJ verblindeten Glomeruli zu analysieren. Legen Sie den Maßstab für jede 6200 X Schliffbild durch Ziehen einer Linie zwischen zwei Punkten des bekannten Abstand, z. B. ein Lineal. Gehen Sie um zu analysieren, und dann Maßstab, wo wird die Länge der Linie in Pixel angezeigt werden. Geben Sie in der bekannten Abstand und Maßeinheiten. Verwenden Sie die Protokolle für die Messung der einzelnen Parameter aufgeführt.Hinweis: Diese Analyse erfordert ca. 1 Tag pro Maus. Verwenden Sie für angemessene statistische Aussagekraft die durchschnittlichen Messwerte aus 3 Glomeruli aus 3 Mäuse. Legen Sie für GBM einen festen digitale Raster (10 x 10) über 6200 X Schliffbild und Messen Sie die Dicke der GBM an der Stelle, wo die Gitterlinien der GBM kreuzen. Messen Sie von der Basalmembran der endothelialen Zellen an der Zellmembran von basalen hemolytic Fuß Prozess in eine senkrechte Tangente an der endothelialen Zellmembran mit geraden Linien-Werkzeug. Bestimmen Sie das mittlere Maß für jede Glomerulus aus 10 Einzelmessungen. Messen Sie für die Anzahl der Endothelzellen Fenestration die Länge der GBM in 6200 X mikrograph vorhanden und die Anzahl der Endothelzellen Fenestrationen pro Längeneinheit der GBM. Nehmen Sie einen Durchschnitt von mindestens 4 mikrographen pro Glomerulus. Für die hemolytic Fuß breite Prozess, legen Sie einen festen digitale Raster (10 x 10) über 6200 X Schliffbild. Messen Sie die Breite der hemolytic Fuß Prozesse, die die Rasterlinien kreuzen. Messen Sie die Breite an der breitesten Stelle des Fußes Prozesses es die GBM trifft; sicherstellen Sie, dass die Linie senkrecht zu der Tangente von der Basalmembran hemolytic ist. Bestimmen Sie das mittlere Maß für jede Glomerulus aus 10 Einzelmessungen. Hemolytic Schnittbreite legen Sie in einem festen digitale Raster (10 x 10) über 6200 X Schliffbild. Messen Sie die Breite der hemolytic Schlitz Membranen, die die Rasterlinien kreuzen. Dies ist der Punkt, wo der Fuß Prozesse zusammen, an der breitesten Stelle jedes Prozesses Fuß aus hemolytic Membran zu Membran am nächsten sind. Sicherstellen Sie, dass die Messung senkrecht zu der Tangente von der Basalmembran hemolytic ist. Bestimmen Sie das mittlere Maß für jede Glomerulus aus 10 Einzelmessungen. Für die Anzahl der hemolytic Fuß Prozesse, Messen Sie die Länge der GBM in 6200 X mikrograph vorhanden und die Anzahl der hemolytic Fuß Prozesse pro Längeneinheit der GBM. Nehmen Sie einen Durchschnitt von mindestens 4 mikrographen pro Glomerulus. Für die Sub-hemolytic Raum Abdeckung siehe detaillierte Methode in Neal Et Al. 14. Anhand der 940 X mikrographen, untersuchen Sie Glomeruli auf das Vorhandensein von abnormen Struktur, Einlagen und Infiltrate vom Auge. 8. die Immunfluoreszenz für Hemolytic und endotheliale Marker Hinweis: Immunostaining erlaubt Visualisierung der Ausdruck Proteinmuster wie endotheliale Kapillare Schlaufen, welche in glomerulären Erkrankung zusammenbrechen können. Legen Sie die OCT-Form mit gefrorenen Niere bei-20 ° C für 2 h vor dem Schneiden. Stellen Sie sicher, daß die Schnittfläche der Niere sorgfältig gegen den Boden der OCT-Form gut ausgerichteten Gewebeschnitte ermöglichen. Mit einem Kryostaten, beschichtet Abschnitt Gewebe bei einer 5 µm Dicke auf Poly-L-Lysin Folien.Hinweis: Stellen Sie sicher, es gibt keine Falten oder Löcher in die Gewebe, die die Morphologie verfälschen können. Bei der Entnahme aus der Kryostat, fix Folien PFA für 10 min. Wash Folien in 4 % 3 x 5 min in einem Behälter mit 100 mL dH2O.Achtung: 4 % PFA: Fixiermittel, Einsatz in Rauch Schrank Zeichnen Sie zur Minimierung des Antikörpers verwendet, um Abschnitte mit einem hydrophoben Stift. Lassen Sie sich nicht in den Abschnitten zu trocknen. In blocking-Lösung (3 % BSA und 5 % normalem Serum mit 1 X PBS-Puffer) für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie die blockierende Lösung mit einer Absauganlage und inkubieren Sie Abschnitte mit Primärantikörper (Nephrin, Podocin oder PECAM-1) verdünnt 1: 250 (3 % BSA mit 1 X PBS-Puffer). Legen Sie Folien in eine Feuchte Kammer bei 4 ° C über Nacht. Wenn eine Feuchte Kammer nicht verfügbar ist, legen Sie einen schmaler Streifen Parafilm leicht über der Antikörper-beschichtete Folie. Vorsicht beim Entfernen von am nächsten Tages, den Abschnitt nicht zu stören. Waschen Sie Objektträger 3 x 5 min in 1 X PBS. Mit entsprechenden fluoreszierende Sekundärantikörper Verdünnung 1: 1000 (3 % BSA mit 1 X PBS-Puffer) für 2 h bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Waschen Sie Objektträger 3 x 5 min in 1 X PBS. Mit Leuchtstofflampen mit DAPI Montage montieren. Bildfolien mit einem fluoreszierenden Mikroskop bei 400 X Vergrößerung der Glomeruli anzeigen. Sicherzustellen Sie, dass diese geblendet wird, um Verzerrungen zu vermeiden. Verwendung ImageJ zu analysieren, die Färbung Intensität, normiert auf die glomeruläre Bereich und das Muster der Färbung, d. h., die Anzahl der Kapillare Schlingen normalisiert zum Bereich glomerulären in gewissem Sinne geblendet. 9. Proteingewinnung und Western Blotting Hinweis: Western blotting ermöglicht uns, die Ausdruck-Proteine bekannt Dysregulated Nierenerkrankungen zu beurteilen. Zum Beispiel zeigt ein Rückgang der Podocin und Nephrin Ausdruck hemolytic Verlust. Extrahieren Sie Protein aus Niere Kortex und gesiebten Glomeruli; das Protokoll ist für jeden gleich und die Lautstärke der Lyse Puffer ist für die Menge der Gewebe. Tauen Sie Niere/Glomeruli auf dem Eis vor dem Hinzufügen von NP-40 Lyse Puffer (150 mM NaCl, 1 % NP-40, 50 mM Tris pH 8) enthaltenden Protease und Phosphatase-Inhibitoren. Homogenisieren die Probe für 30 s. Inkubieren Sie die homogenisierten Proben für 30 min, Vortexen in regelmäßigen Abständen auf Eis. Zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 x g für 15 min bei 4 ° C. Den überstand zu einem frischen Schlauch auf dem Eis zu entfernen.Hinweis: voraussichtlich ca. 1 mg Protein pro Probe zu erholen. Denaturieren Sie die Proteine, die mit dem standard 4 X Laemmli-Puffer. Kochen Sie die Mischung bei 95-100 ° C für 5 min. Bewerten der Ausdruck der glomerulären Zelle Marker-Proteine (Nephrin, Podocin, PECAM-1)und der Phosphorylierung und Expression von Proteinen bekannt/Hypothese in der Niere/Glomeruli der das Krankheitsmodell mit Western Blot () geändert werden Standard-Methode; Mahmood und Yang (15).Hinweis: Das Protokoll variiert je nach Größe und Fülle des Proteins des Interesses. 10. RNA-Extraktion und Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Hinweis: mRNA Ausdruck Analyse lässt sich bestimmen, wie Gene bei Nierenerkrankungen, wie Veränderungen in der Genexpression und alternatives Spleißen reguliert werden. Während die Nieren Rinde noch gefroren ist, mahlen Sie gründlich in 3 mL Phenol-Reagenz mit einem Stößel und Mörser. Wenn glomerulären Extrakte zu verwenden, fügen Sie 1 mL der Phenol-Reagenz und homogenisieren die Probe für 30 s.Achtung: TRIzol Reagenz: reizend; Verwenden Sie im Rauch Schrank Führen Sie eine RNA-Extraktion mit der Methode von Chomczynski und Sacchi16beschrieben.Hinweis: Kommerzielle RNA Extraktion Kits sind erhältlich als Alternative zu dieser Methode. Beurteilen Sie die Quantität und Qualität der RNA unter Verwendung eines der verschiedenen Methoden zur Verfügung. RNA ist an dieser Stelle regelmäñig und bei-80 ° C gelagert. Vermeidung von Wiederholung Einfrieren, Auftauen.Hinweis: Wenn Sie neu in diese Methode, überprüfen Sie die Qualität der RNA bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren durch Ausführen der RNS auf ein Agarosegel um einen klaren 28 s und 18 s ribosomalen Band. Erwarten Sie zwischen 2 bis 5 µg RNA mit dieser Methode zu erholen. DNase behandeln 1 µg RNA (machen Volumen bis zu 10 µL mit RNase-freies Wasser plus 1 µL DNase und 1 µL Puffer DNase) für 1 h bei 37 ° C. Die Reaktion mit 1 µL DNase-Stopp-Lösung bei 65 ° C für 10 min zu stoppen. Fügen Sie 0,5 µL Oligo (dT) und zufällige Primer. Bei 70 ° C für 10 min inkubieren. Sofort für 5 min auf Eis zu stillen. Fügen Sie die folgenden; MMLV Reverse-Transkriptase-Enzym (400 U; ersetzen mit DEPC H2O in der RT – Kontrollprobe), MMLV-Puffer (1 X), dNTP-Mix (0,5 mM) und Ribonuklease-Inhibitor (40 U); machen Sie bis zu 50 µL mit DEPC-Wasser. Inkubieren Sie Reaktion Mischung bei 37 ° C für 1 h, gefolgt von 95 ° C für 5 min um das Enzym zu deaktivieren.Hinweis: Um eine höhere Ausbeute der cDNA zu generieren, Inkubation bei 37 ° C für bis zu 3 h. Beurteilen Sie die Quantität und Qualität der cDNA mit den verschiedenen Methoden zur Verfügung. Verwendung PCR zu beurteilen, die mRNA Ausdruck und Spleißen Muster der Gene Hypothese Dysregulated in der glomerulären Krankheitsmodell sein. Das Protokoll ist das Gen des Interesses abhängig.