Optimierung der Capture-Laser Mikrodissektion für die Isolierung der enterischen Ganglien aus menschlichem Gewebe Tiefkühlfrische
Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist, hoher Integrität RNA-Proben von enterischen Ganglien isoliert von fixierten, frisch reseziert menschlichen Darmgewebe mit Laser Capture Microdissection (LCM) zu erhalten. Dieses Protokoll beinhaltet Probenvorbereitung Blitz eingefroren menschlichen Darmgewebe, Kryoschneiden, ethanolische Färbung und Dehydrierung, LCM, und RNA-Extraktion.
Abstract
Der Zweck dieser Methode ist, hoher Integrität RNA-Proben von enterischen Ganglien gesammelt von fixierten, frisch reseziert menschlichen Darmgewebe mit Laser Capture Microdissection (LCM) zu erhalten. Wir haben fünf Schritte im Workflow identifiziert, die entscheidend für den Erhalt der RNA-Isolate aus enterischen Ganglien mit ausreichend hoher Qualität und Quantität für RNA-Seq. Zuerst, muss bei der Vorbereitung von Darmgewebe jede Probe alle überschüssige Flüssigkeit durch Löschpapier vor der Abflachung der Darmhaut so weit wie möglich im unteren Bereich des großen Basis Formen entfernt haben. Proben werden dann schnell auf einen Brei aus Trockeneis und 2-Methylbutane eingefroren. Zweitens, wenn das Gewebe zu schneiden, ist es wichtig, Cryomolds zu positionieren, so dass Darmabschnitte das vollständige Flugzeug den Auerbach-Plexus parallel, damit die größte Fläche des enterischen Ganglien pro Folie nachgeben. Dritte, während LCM, Polyethylen Napthalate (PEN)-Membran Folien bieten die größte Geschwindigkeit und Flexibilität der ungleichmäßigen Formen der enterischen Ganglien zu umreißen, wenn Enterische Ganglien zu sammeln. Viertens, bieten für deutliche Visualisierung der enterischen Ganglien in Abschnitten, Ethanol-kompatiblen Farbstoffe wie Cresyl violett, ausgezeichnete Erhaltung der Integrität der RNA relativ wässrigen Farbstoffe. Zu guter Letzt für die Gewinnung von RNA aus aufgenommenen Ganglien beobachteten wir Unterschiede zwischen kommerziellen RNA-Extraktion-Kits, die überlegene RNA-Menge ergab und Qualität, beim DNA-Kontaminationen zu beseitigen. Optimierung dieser Faktoren in das aktuelle Protokoll stark beschleunigt den Workflow und enterischen Ganglien Proben mit außergewöhnlichen RNS-Qualität und Quantität ergibt.
Introduction
Diese Methode soll qualitativ hochwertige RNA-Proben der enterischen Ganglien aus menschlichen intestinalen Gewebe mit Laser Capture Microdissection (LCM) zu erhalten. Das hier beschriebene Protokoll wurde optimiert, um ausreichende RNS-Qualität und Erträge für RNA Sequenzierung (RNA-Seq) bieten und mit frisch reseziert, fixierten, Blitz eingefroren menschlichen Darmgewebe verwendet werden soll.
Funktionelle Magen-Darm- und Darm-Motilität-Störungen betroffen einer von vier Menschen in den Vereinigten Staaten. Das Enterische Nervensystem (ENS), auch bekannt als die zweite Gehirn1, ist oft in der Mitte dieser Störungen, wie es eine entscheidende Rolle im Darm Homöostase und Motilität spielt. Manipulation von Darm-Motilität wurde in der Regel auf chirurgische Resektion des aganglionären/noncontractile Gewebe, chronische ernährungsumstellung und/oder Medikamente eingeschränkt. Überraschend, bleibt das volle Transkriptom der Erwachsenen ENS sequenziert werden, stark begrenzen unsere Fähigkeit, Moleküle innerhalb der ENS zu identifizieren, die pharmazeutisch ausgerichtet oder in Stammzelltherapien genutzt werden können.
Es gibt relativ wenige Methoden zur Isolierung von RNA aus menschlichen enterischen Ganglien. Der erste Ansatz, Zelle Dissoziation2, erfordert hohe Inkubation Temperaturen und langen Inkubationszeiten; sowohl von denen, die zur Förderung der RNA-Abbau und verändern die Transkriptom-2,–3bekannt sind. Ein alternativer Ansatz, LCM, mehr zuverlässig das Transkriptom bewahrt und schützt die Integrität der RNA. Obwohl mehrere Studien LCM Ganglien von menschlichen Tiefkühlfrische Darmgewebe4,5,6sammeln verwendet haben, diese Ansätze wurden entweder von Armen RNS-Qualität und Quantität behindert, waren sehr arbeitsintensiv, oder notwendige Änderung der Färbung oder RNA Extraktionstechniken in unseren Händen zu arbeiten. Andere LCM Protokolle entwickelt, die für die Erhaltung der RNA, die in LCM Produkt, die Handbücher zur Verfügung gestellt gefunden wurden, weitere Verbesserungen7,8, sondern Anpassung war notwendig, angewandt auf die Isolation der enterischen Ganglien8, 9. aus diesen Gründen entwickelten wir eine optimierte Protokoll basierend auf diese Ressourcen, die erhebliche Mengen an hoher Integrität RNA aus menschlichen enterischen Ganglien ergibt, hat einen relativ schnellen Workflow und konsistente Ergebnisse produziert, über eine große Anzahl der Proben.
In dieser Studie stellen wir Ihnen eine Übersicht über optimierte Abläufe, die die Isolation der RNA hoher Integrität von enterischen Ganglien aus resezierten menschlichen Darmgewebe bezogen zu erleichtern. Unsere Methode beinhaltet fünf wichtige Aspekte. Erste, frisch reseziert, unfixierte Darm Humanproben sollte getrimmt werden, um Größe, haben alle überschüssige Feuchtigkeit mit einem Labor-Gewebe entfernt und in einer großen Basis Form vor dem Blitz-einfrieren auf einer Aufschlämmung von Trockeneis und 2-Methylbutane (2 MB) abgeflacht. Zweite, histologische Abschnitte des Darmes sollte bereit sein, die vollständige Flugzeug Auerbach Plexus auf einer Folie zu erhalten, bietet eine große Nutzlast des enterischen Ganglien. Erfolg mit diesem Schritt ist weitgehend abhängig von der Vorbereitungsprozess Gewebe. Drittens erfordert die uneinheitliche Struktur der Ganglien in der ENS die Verwendung von Polyethylen Napthalate (PEN) Membran Folien6, die die größte Geschwindigkeit und Präzision bei der LCM anbieten. Vierte, Ethanol-kompatible Farbstoffe, wie z. B. Cresyl violett, sollten zur RNA Integrität zu bewahren, während der Färbung enterischen Ganglien. Dauern Sie, die RNA-Extraktion ist entscheidend für ein erfolgreiches Ergebnis mit RNA-Seq. Wir suchten einen RNA-Extraktion-Ansatz, der produziert hohen Integrität der RNA, RNA Erträge maximiert, wenn beginnend mit einer kleinen Sammlung von enterischen Ganglien, DNA-Verunreinigung beseitigt und behält so viele RNA-Spezies wie möglich.
Zusammengenommen, Optimierung dieser Faktoren in der vorliegenden Studie stark beschleunigt den Workflow und Proben der enterischen Ganglien mit außergewöhnlichen RNA Quantität und Qualität liefert. Ergebnisse wurden weitgehend unter eine ansehnliche Gruppe von Proben, die Konsistenz dieses Ansatzes angibt. Darüber hinaus haben wir diese Ansätze verwendet, um Dutzende von RNA-Proben von enterischen Ganglien erfolgreich zu sequenzieren. Die Strategien, die hier hervorgehoben können auch weitgehend angepasst werden, für die Durchführung von LCM von gewünschten Ganglien oder Kerne des peripheren und zentralen Nervensystems und andere Fälle, in denen die Isolierung der RNA von hoher Qualität.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Verfahren ermöglicht die effiziente Sammlung von zahlreichen enterischen Ganglien als Quelle abzuleiten RNA für RNA-Seq. Hier haben wir die Prozesse gemäß bestehender Protokolle gleichzeitig maximal RNA Integrität beschleunigt. Da alle Schritte in diesem Verfahren voneinander abhängig sind, ist es wichtig, dass alle Probleme aus dem Beginn der Studie beseitigt werden und dass alle Proben so ähnlich zueinander wie möglich, bereit sind, zuverlässige RNA-FF zu erhalten
Von Beginn …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar für die Spender und deren Familien, die diese Arbeit möglich gemacht. Wir schätzen auch die Unterstützung des Personals am International Institute of Medicine und Tennessee Spender Dienstleistungen zur Unterstützung koordinieren Sammlung von Gewebe, die in dieser Studie verwendet. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health, NIH OT2-OD023850 EMS2 und Stipendium Unterstützung von NIH T32-DK007673, AMZ. Wir sind dankbar für Mitarbeiter der Vanderbilt translationale Pathologie gemeinsame Ressource für den Zugriff auf die LCM Instrument und Beratung auf Gewebe Vorbereitung. Die Vanderbilt Gewebe Pathologie gemeinsame Ressource wird teilweise von NIH-Stipendien P30-CA068485-14 und 13 / DK059637 / U24 unterstützt. Wir danken der Genom-Technologiezentrum-Zugang in der Abteilung für Genetik an der Washington University School of Medicine für Hilfe bei der Genomanalyse. Die AGB ist teilweise von NCI Cancer Center Support Grant #P30 CA91842, Siteman Cancer Center und IKT/CTSA Grant #UL1TR002345 vom nationalen Zentrum unterstützt für Forschung Ressourcen (NCRR), eine Komponente der National Institutes of Health (NIH) und der NIH Fahrplan für die medizinische Forschung. Diese Publikation ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der NCRR oder NIH.
Materials
| 10% Neutral-buffered formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 3-mL syringe | BD | 309628 | |
| 50-mL conical tubes, polypropylene | Corning | 05-526B | |
| Base molds 37x24x5mm, disposable | Electron Microscopy Sciences | 5025511 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | N.A. | |
| CapSure Macro LCM caps | Arcturus, ThermoFisher | LCM0211 | |
| Cling Wrap, Press’n Seal | Glad | N.A. | |
| Cresyl Violet Acetate | Acros Organics | AC405760025 | |
| Cutting Board | Electron Microscopy Sciences | 63308 | |
| Ethanol, 190-proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol, 200-proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Glass Microscope slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Gloves, extended cuff | Microflex | 19010144 | |
| Gowns, surgical-disposable | Kimberly-Clark | 19-088-2116 | |
| Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan) | Nalgene | 1335920B | |
| Kimwipes (large) | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Kimwipes (small) | Kimberly-Clark | 34133 | |
| Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT) | ThermoFisher | N.A. | |
| Leica Cryostat Chuck, large, 40 mm | Southeast Pathology Instrument Service | N.A. | |
| Light Microscope | Olympus | CX43 | |
| Microscope objective (20X) | Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17 | N.A. | |
| Microscope objective (10X) | Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/- | N.A. | |
| Molecular Sieves | Acros Organics | AC197255000 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PicoPure RNA extraction kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| Pellet Pestle | Kimble Kontes | 4621973 | |
| PEN membrane LCM slides | Arcturus, ThermoFisher | LCM022 | |
| RNase-free tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12400 | |
| RNaseZAP | Sigma | Sigma-R2020 | |
| RNA Extraction Kit "A" (PicoPure) | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| RNA Extraction Kit "B" (RNeasy Micro kit) | Qiagen | 74004 | |
| RNA Extraction Method "C" (TRIzol) | Invitrogen | 15596-026 | |
| RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit) | Qiagen | 74134 | |
| Splash Shield, disposable faceshield | Fisher | 17-310 | |
| Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp" | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm) | Nalgene | 190-2520 | |
| Tissue Freezing Medium | General Data Healthcare | TFM-5 | |
| Xylenes | Fisher | X3P1GAL |
References
- Gershon, M. D. . The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , (1998).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5, 9226 (2015).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17, 36 (2010).
- Bottner, M., et al. Laser microdissection as a new tool to investigate site-specific gene expression in enteric ganglia of the human intestine. Neurogastroenterology and Motility. 22 (2), 168-172 (2010).
- Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Hetz, S., et al. Age-related gene expression analysis in enteric ganglia of human colon after laser microdissection. Front Aging Neurosci. 6, 276 (2014).
- . PALM Protocols – RNA handling Available from: https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf (2011)
- . Workflows & Protocols: How to Use a Leica Laser Microdissection System and Qiagen Kits for Successful RNA Analysis Available from: https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/ (2015)
- . Arcturus HistoGene Frozen Section Staining Kit: User Guide. Biosystems, A. , (2010).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Grover, P. K., Cummins, A. G., Price, T. J., Roberts-Thomson, I. C., Hardingham, J. E. A simple, cost-effective and flexible method for processing of snap-frozen tissue to prepare large amounts of intact RNA using laser microdissection. Biochimie. 94 (12), 2491-2497 (2012).
- Heumuller-Klug, S., et al. Degradation of intestinal mRNA: a matter of treatment. World Journal of Gastroenterolology. 21 (12), 3499-3508 (2015).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Sigurgeirsson, B., Emanuelsson, O., Lundeberg, J. Sequencing degraded RNA addressed by 3′ tag counting. PLoS One. 9 (3), 91851 (2014).
- Potter, S. S., Brunskill, E. W. Laser capture. Methods in Molecular Biology. 886, 211-221 (2012).
- Funke, B. Laser microdissection of intestinal epithelial cells and downstream analysis. Methods in Molecular Biology. 755, 189-196 (2011).
- Kolijn, K., van Leenders, G. J. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Res Notes. 9, 17 (2016).
- Muyal, J. P., Muyal, V., Kaistha, B. P., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).
- Mikulowska-Mennis, A., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
- Pietersen, C. Y., Lim, M. P., Woo, T. U. Obtaining high quality RNA from single cell populations in human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
- Guo, M., Wang, H., Potter, S. S., Whitsett, J. A., Xu, Y. SINCERA: A Pipeline for Single-Cell RNA-Seq Profiling Analysis. PLoS Computational Biololgy. 11 (11), 1004575 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
