Oprichting van een klonale cultuur van eencellige Conjugating algen

1. verzameling van een watermonster met algen Opmerking: Eencellige conjugatophytes groeien in stilstaand zoet water gebieden, zoals moerassen, meren en rijstvelden. Een watermonster algen-bevattende wordt verzameld uit een van deze omgevingen tot een cultuur-stam. De volgende items nodig zijn voordat het proces: een netto plankton, een wegwerp Pipet, en een fles of een tube van 50 mL voor het verzamelen van watermonsters. Gebruik een net in een omgeving met meer plankton voor het verzamelen van algen uit het water. Gebruik maken van een juiste netto, afhankelijk van het doel.Opmerking: Het bovenste deel van het net is permeabel voor water. De algen die gevangen door het net zijn geconcentreerd in de container van de onderkant van de netto plankton. Een grof gaas kunt kleine algen te passeren. Een fijn gaas krijgt gemakkelijk verstopt. Het water (ongeveer 50 mL) overbrengen op de tube van 50 mL of een plastic fles van 100 mL. De geconcentreerde watermonster naar het laboratorium brengen. Eencellige conjugatophytes groeien ook in moerassen of rijstvelden. Op deze gebieden ondiep water kan watermonster met algen rechtstreeks worden bemonsterd met een druppelaar. Vervolgens overbrengen in het water (30-50 mL) de tube van 50 mL of een 50 mL plastic fles.Opmerking: Het water is zorgvuldig bemonsterd boven het bodemoppervlak zodat het monster geen bodem bevat. 2. bevestiging van algen Opmerking: De volgende items zijn vereist: een loep of Verplaatsbaar Microscoop en een 60 mm schotel voor observatie. Controleer de aanwezigheid van algen in de steekproef terwijl het in de Wegwerp pipet, gebruiken de loupe te nemen van het monster rechtstreeksOpmerking: Grotere cellen van ongeveer 400-1000 µm lang (b.v. Closterium ehrenbergii) kan gemakkelijk worden waargenomen met behulp van deze methode. Giet het watermonster in een schotel van plastic laboratorium om te bevestigen algen onder de draagbare Microscoop. Het monster (ongeveer 3 mL) zetten het binnenste deel van de bovenste helft (deksel) van de 60 mm petrischaal, plaats dan de onderste helft, met de onderste gedeelte tegenover het binnenste deel van het deksel, op de top.Opmerking: Deze methode houdt het monster verplaatsen en de observatie vergemakkelijkt. 3. bereiding van een glazen capillaire Pipet van Pasteur Pipetteer voor de isolatie Opmerking: Voordat u begint het proces, zijn de volgende items nodig: gesteriliseerd Pasteur pipetten, een rek voor de Pasteur pipetten, handschoenen, een rubber lamp, een geest-lamp, methanol voor de geest-lamp, een aansteker, pincet, een prullenbak voor glas, en een schone kamer of laminaire flow hood (indien nodig). Ontsteken van de brander van een alcohol. Voor de productie van een mooie glazen capillaire pipet voor de isolatie, door ervoor te zorgen dat de vlam is niet flikkeren. Verscherpen van de vlam en smelten van de Pipet van Pasteur op de tip. Verwarm een steriele glazen pipet van Pasteur op de vlam, ondersteund aan de zijkant van de rubber lamp met de hand en aan de kant van het uiteinde met behulp van de verlostang. De Pipet van Pasteur van het vuur nemen en uitrekken. Wanneer het glas smelt, snel het verwijderen van de Pipet van Pasteur van de vlam en trek.Opmerking: In dit experiment, de Pipet van Pasteur werd uitgebreid door 15-20 cm. Maak zeker dat de pipet buiten de vlam tijdens het trekken. Het puntje van de glazen capillaire pipet met de juiste lengte verbreken. Omdat het deel buigen de beste is, is het ideaal voor naar de wenk.Opmerking: In deze studie, een glazen capillaire pipet met een tip van 5-10 cm opgesteld. Zorg ervoor dat het capillair negeren na het smelten, en bevestigen dat de vlam is stak. De bubbels vrijgelaten uit de glazen capillaire pipet geven de grootte van de tip openen. Selecteer de juiste grootte voor de cel worden geïsoleerd. Ongeveer 1 mm van bubbels is goed voor de isolatie van de Closterium soorten, met celbreedten van 10-20 µm. 4. eencellige isolatie door een glazen capillaire pipet Opmerking: De volgende items nodig zijn voordat u begint: een omgekeerde licht microscope, horloge glazen, een kunststof schotel en steriele schroefdraad reageerbuisjes bevatten CA medium (tabel 1) of geconditioneerd CA middellange7. Bereid een paar horloge glazen (22 mm in diameter en 1 mm in diepte), elk met 1 mL steriele CA voedingsbodem. Isoleren van een doelcel uit het watermonster verzameld in het veld. Giet het watermonster (ongeveer 30-40 mL) met de doelcellen in de kunststof schotel. Met inachtneming van het monster in de kunststof schotel onder een omgekeerde lichte Microscoop, pick-up enkele cellen met behulp van de glazen capillaire pipet. Breng de glazen capillaire pipet in de buurt van de cel om het streven van de cel door capillaire werking. Breng de cellen in een horlogeglas met 1 mL steriele CA voedingsbodem (Figuur 1a). Pak de cellen weer met behulp van een nieuwe glazen capillaire Pipet uit het steriele CA medium en overbrengen naar een tweede horlogeglas met steriele CA medium (Figuur 1b).Opmerking: Dit proces wordt herhaald totdat een eencellige is geïsoleerd in de plek plaat (Figuur 1 c). Een enkele cel met behulp van een nieuwe glazen capillaire pipet halen, en ten slotte het overbrengen in een reageerbuis met 14 mL CA medium of geconditioneerde CA medium (Figuur 1 d). Incubeer het monster bij 23 ° C onder een licht: 8 van de 16-h-h donker cyclus voor 2 weken.Opmerking: De onbekende factor(en) voor celproliferatie, die worden uitgescheiden door de groeiende cellen in de omgeving, zijn opgenomen in de geconditioneerde middellange tot celdeling4vergemakkelijken. Als een klonale cultuur is ontstaan, voor te bereiden het geconditioneerde CA medium van het kweekmedium4. De cultuur zal groen worden als succesvol.