Establecimiento de una cultura clónica de algas unicelulares de conjugación
Summary
En este artículo, nos demuestran el establecimiento de culturas clonales de especies de algas Conjugación unicelulares recogidas desde un sitio de campo natural.
Abstract
Es indispensable establecer cultivos clonales de microalgas para su uso en estudios de diversos temas, tales como microbiología, fisiología, genética y taxonomía. Por lo tanto, es sumamente importante desarrollar técnicas para establecer cultivos clonales. En este artículo, nos demuestran el establecimiento de cultivos clonales de un alga conjugación. Se recogen muestras de agua del campo. Posteriormente, las células son aisladas con una pipeta capilar de vidrio, coloca en un medio y bajo condiciones adecuadas para generar una cultura clónica.
Introduction
Conjugando las algas (de la orden Zygnematales), también conocido como conjugatophytes, ocupan una posición filogenética clave como los parientes vivos más cercanos de los antepasados inmediatos de tierra plantas1,2. Establecido cultivos clonales de algas han conducido a una amplia variedad de estudios taxonómicos, fisiológicos y genéticos en los últimos años. Las técnicas de aislamiento de microorganismos a partir de un campo natural tienen una larga tradición3,4. En los últimos años, el aislamiento automatizado técnicas mediante citometría de flujo han sido establecido5. El método más común utilizado para obtener una sola celda para el establecimiento de una cultura clónica es unicelular aislamiento utilizando una pipeta capilar de vidrio6. Este método tradicional requiere habilidad y un protocolo experimental precisa.
En este artículo demostramos el muestreo de algas de muestras de campo y el establecimiento de cultivos clonales de algas unicelulares de la conjugación, como la especie de Closterium , utilizando una pipeta capilar de vidrio. Se recoge una muestra de agua que contienen las células vegetativas de un sitio de campo (por ejemplo, un lago, estanque o arrozal). Las células son aisladas de la muestra de agua mediante el uso de una pipeta capilar de vidrio y luego se lava. Las células son cultivadas en un tubo de ensayo que contiene nitrógeno suplido (CA medio) a 24 ° C bajo una luz: 8 de 16-h-h régimen oscuro. Este método también es conveniente para el aislamiento de otras microalgas para generar cultivos clonales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizando el presente método, las cepas 9 cultura clónica de Closterium SP. fueron establecidas de 15 células aisladas de la muestra de agua (Inba1), que representa una tasa de éxito del 60%. Identificación de especies se llevará a cabo en el futuro por la observación morfológica así como el análisis de ADN, tales como análisis filogenética molecular8.
En el presente método, la frescura de la muestra de agua es importante a la tasa de éxito. Es mejor aislar las células de las muestras de agua tan pronto como sea posible después de la recolección de campo. Aunque las células de la especie de Closterium (p. ej., C. ehrenbergii, C. peracerosum-strigosum-littorale complejo) se pueden mantener en la muestra de agua de unos 7 d por almacenar a 4-8 ° C, el aislamiento de las células es deseable en el día de la colección o al día siguiente. También es importante eliminar cualquier contaminante que no sea de las células diana, aumentando así el número de repeticiones de lavado (es decir, > 3 x) puede prevenir una contaminación de los cultivos de microorganismos en el suelo y las células.
Una limitación de esta técnica es que los medios de cultivo utilizados en el presente Protocolo (CA o medio CA condicionado) no siempre son apropiadas para todas las algas conjugación. En algunos casos, puede ser necesario utilizar otro medio, así como condiciones de temperatura y luz diferente. También, como es difícil de probar si un cultivo ha crecido de una sola célula, es necesario recoger con exactitud solo 1 célula al transferir las células a un tubo de ensayo. Por lo tanto, la transferencia debe hacerse con una nueva pipeta capilar de vidrio cada vez.
Establecer un cultivo clonal con esta pipeta método de lavado es un método clásico estándar y es el método más confiable para utilizar para aislar las células deseadas para un estudio. Se establecieron las culturas clonales de conjugar las algas utilizadas en muchos estudios8,9,10,11 utilizando el presente método. Es difícil analizar las algas Conjugación sin una cultura clónica. Además, en los últimos años, secuencias de genoma de novo se convirtió en fáciles de obtener (por ejemplo, utilizando el secuenciador de nanopore súbdito), y establecer cultivos clonales más facilitará la secuenciación de novo . En otras palabras, este método es el primer paso en el futuro el estudio de estas algas para entender mejor su biodiversidad.
Para establecer una tensión estable de la cultura, es necesario realizar algunos pasos críticos con precisión dentro del protocolo. El paso más importante es la preparación de una pipeta capilar de vidrio con una abertura óptima para permitir el paso de sólo una sola celda. La abertura de la pipeta capilar de vidrio debe ser ligeramente mayor que la longitud del eje menor de la célula de interés. La pipeta capilar de vidrio óptimo puede aspirar una sola célula por la acción capilar. Sin embargo, si el diámetro de la abertura es demasiado grande, el capilar también sacarán en inertes los materiales contaminantes o incluso (un) otros microorganismos, además de la célula diana.
Para obtener una pipeta capilar de vidrio con una abertura óptima, los siguientes puntos son importantes tener en cuenta. En primer lugar, el pilar de la llama debe ser estrecho al calentar la pipeta capilar de vidrio. Luego, al retirar la pipeta Pasteur, tiene que ser eliminado de la llama; de lo contrario, la abertura de la pipeta de Pasteur se derrumbará.
El equipo y los recipientes que se muestra en este protocolo son básicas y pueden modificarse. Por ejemplo, usando placas de varios pocillos en lugar de vidrios de reloj con un pozo, el lavado de la celda puede hacerse más eficiente. Además, los contenedores pueden sustituirse por otras similares. Por una sola célula de transferencia al medio de cultivo en el último paso, se puede establecer un cultivo clonal.
Preparar un recipiente esterilizado y trabajar en una campana establecerá axénicos (sin contaminar) cepas. Para evitar la contaminación, es necesario repetir el lavado con alícuotas frescas x más de 3. A veces, las bacterias también son esterilizadas mediante la adición de antibióticos15.
Este método había centrado en desmid (Zygnematales) aislamiento, pero cambiando el tamaño de la abertura de la pipeta capilar de vidrio, puede ser aplicada al aislamiento de plancton diferente tamaño.
Acknowledgements
Agradecemos a Hisayoshi Nozaki (Universidad de Tokio), Takashi Nakada (Universidad de Keio), Yuka Marukawa Hashimoto (Japón Femenil Universidad) y Hiroyuki Sekimoto (Universidad de la mujer de Japón). Queremos agradecer a los revisores por sus comentarios. Este estudio fue apoyado por subvenciones para la investigación científica (no. 26440223 y 15H 04413) de la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia, Japón y por una beca de la Fundación de desarrollo de tecnología nueva de Yuki Tsuchikane.
Materials
| Sampling | |||
| Plankton net | RIGO, Japan | N-NO380T | Mesh size: 32 µm |
| Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE) | Nikon, Japan | JAN: 4960759 206725 | Magnification: 20× |
| Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier) | Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan | 1985-20 | Magnification: 20× |
| Spuit | EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan | Sterile spuit No.4 | |
| 50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps) | Labcon, USA | 3181-345-008 | |
| Bottle (100 mL Polycarbonate bottle) | AS ONE Corporation, Japan | 1-7403-01 | |
| 60 mm dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | 1010-060 | For observation of algae. 60 mm/non-treated dish |
| Preparation of a micropipette | |||
| Pasteur pipettes (cotton plugged 9” Pasteur Pipettes) | Fisher Scientific, USA | 13-678-8B | 7 × 225 mm |
| Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc) | AS ONE Corporation, Japan | 5-5669-01 | 10 × 40 mm |
| Stainless forceps | AS ONE Corporation, Japan | PT-09 | 110 mm |
| Single-cell isolation | |||
| Watch glass (Blood reaction board) | Sekiya Rika Co., Ltd, Japan | F14-155-030 | to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth |
| Threaded test tubes | Fujimotorika, Co., Ltd, Japan | XX142 | 18 Ø × 170 mm |
| Inverted light microscope | Olympus, Tokyo, Japan | CKX41N | for isolation of algae. |
| Plastic dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | SH90-15E | 90 × 15 mm |
References
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