Визуализация микробиоты в кишки клеща в целом гора в Situ гибридизация

Человека и животных патогенов, передано членистоногих векторов находятся во всем мире и приходится около 20% инфекционных заболеваний во всем мире¹, но эффективный и не доступны безопасные вакцины против большинства этих патогенов. Наше понимание важной роли синантропных, симбиотических и патогенных микроорганизмов, известные как микрофлора², модуляции и формирования здоровья почти всех размером³ расширяется. Теперь уже очевидно, что членистоногих векторами патогенов также гавани кишка микробиоты и эти связанные векторные микробиоты было показано влияние различных возбудителей трансмиссивных^4,5. Членистоногих микрофлора состоит из эубактерии, археи, вирусов и эукариотических микробы как простейшие, нематод и грибов⁶. Однако, преобладающее исследований основное внимание уделялось эубактерии вследствие, в частности, наличия маркерных генов и справочные базы данных для выявления конкретных бактериальных членов.

С акцентом на Черноногий, тик вектор нескольких патогенов человека, включая Borrelia burgdorferi⁷, возбудителя болезни Лайма, оптимизации техники микробного визуализации была направлена на улучшение нашего понимания клеща кишка микробиоты в контексте взаимодействия вектор патогена. Несколько вопросов остаются ответа в поле микрофлора клеща. Кишечник является сайт первого расширенная встреча между клеща и входящие возбудителя в контексте горизонтально передаваемых патогенов; Таким образом понимание роли векторных кишка микробиоты в модуляции вектор возбудитель взаимодействия будет выявить значимые идеи. Клещи имеют уникальный режим переваривания крови еды, где обработка крови еды компонентов занимает место внутриклеточно⁸. В просвет кишки казалось бы служит судно содержать крови еды как тик каналы, и питательных веществ пищеварение и усваивание наступить на протяжении нескольких дней кормления и продолжить после пресыщения. Патогенов, приобретена галочку во время кормления войти в просвет кишки вместе с bloodmeal и таким образом просвет становится основной сайт взаимодействия среди клещей, возбудителя и резидентов микробиоты. Как пищеварение проходит через сытость и иксодовых клещей линьки, кишечнике претерпевает структурные и функциональные изменения⁹. Состав и пространственной организации gut бактерии также может меняться в концерте с меняющейся обстановке кишки. Таким образом, важно понять архитектуру резидентов бактерий в кишечнике клеща в полной мере понять взаимодействие клеща, возбудителя и микрофлору кишечника.

Молекулярные методы для описания связанного узла микробиоты регулярно используют высок объём параллельной последовательности стратегий¹⁰ усилить и последовательность бактериальной 16S рибосомной ДНК (рДНК). Эти стратегии виртуализации обойти необходимость получения стерильных культурах конкретных видов бактерий и предоставить подробное описание всех бактериальных членов, представленных в образце. Тем не менее такие стратегии являются осложняется неспособность различать экологических загрязнений от Бона ФИДЕ жителей. Кроме того при оценке образцов, таких как клещей, которые являются небольшими по размеру и следовательно содержат низкий микрофлору специфических ДНК урожайности, вероятность усиления экологических загрязнителей является увеличение¹¹ и приводит к неоднозначной интерпретации микрофлора композиция. Таким образом, функциональные характеристики в сочетании с визуализацией конкретных жизнеспособных бактерий будет важно определить и различить микрофлора клеща височно и пространственно. К этой цели мы воспользовались целом гора РНК в situ гибридизация. Этот метод обычно используется для оценки картин выражения гена в органах и эмбрионы^12,13,14 и позволяет полуколичественный анализ выражения над всей выборки интерес. Это отличается от традиционных в situ гибридизация методов, которые используют разделов ткани и часто требуют обширный анализ секционного материала с вычислительной Ассамблеей предсказать выражение в целом органов¹⁵. В то время как целое гора обычно относится к весь организмов¹², здесь всего гора относится к весь кишки или органов. Преимущества использования РНК целом гора в situ гибридизация подход для оценки архитектуры клеща кишка микробиоты многократно. Тик кишки состоит из 7 пар дивертикулы, каждая пара разного размера¹⁶. Функциональные различия, если таковые имеются, среди этих дивертикулы, не поняли в контексте биологии тик, тик микробиоту или тик возбудитель взаимодействий. Манипуляции кишечника, которые разрыву кишки дивертикулы будет вытеснять микрофлору в просвете кишки или слабо связанные с кишки и привести к неправильному толкованию пространственной локализации микробиоты. Флуоресцировани обозначенного РНК в situ гибридизация ранее использовались для изучения клеща кишки стенограммы¹⁷ , фиксации и открыв индивидуальный кишку дивертикулы обеспечить зонд гибридизации и локализовать B. burgdorferi стенограммы путем разрезания парафин врезанных всего¹⁸, клещей. Оба эти подходы требуют манипуляций деления тканей до гибридизации, которые могут повлиять на архитектуру микрофлору кишечника.

В настоящем докладе мы подробно описать протокол для изучения жизнеспособных клеща кишка микробиоты с помощью целом гора в situ гибридизация (WMISH). Использование всего гора РНК в situ гибридизация позволяет глобального понимания присутствия и обилие конкретных кишки бактерий в различных регионах кишечник и может стимулировать новые идеи в биологии кишки клеща в контексте возбудителя колонизации и передачи. Кроме того использование РНК зондов, направленных против определенных бактериальных РНК позволяет обнаружение жизнеспособных бактерий в кишечнике клеща.