Visualizzazione del Microbiota in Tick budella di intero-monta In Situ di ibridazione

Gli agenti patogeni umani e bestiame, trasmessi da artropodi vettori si trovano in tutto il mondo e rappresentano circa il 20% delle malattie infettive a livello globale¹, ma efficace e sicuro vaccini contro la maggior parte di questi agenti patogeni non sono disponibili. Nostra comprensione dell’importanza del ruolo dei microrganismi commensali, simbiotici e patogeni, conosciuti collettivamente come il microbioma², modulante e plasmare la salute di quasi tutti i metazoi³ si sta espandendo. Ora è evidente che anche Porto di artropodi vettori di agenti patogeni microbiota dell’intestino e questi microbiota vettoriale-collegata hanno dimostrato di influenzare diversi agenti patogeni vettore^4,5. Il microbioma dell’artropodo è composto di eubatteri, archaea, virus e microbi eucarioti come protozoi, nematodi e funghi⁶. Tuttavia, il focus della ricerca predominante è stato il eubatteri dovuta, in parte, alla disponibilità di geni marcatori e banche dati di riferimento per identificare i membri batterici specifici.

Con un focus su Ixodes scapularis, tick vettoriale di agenti patogeni umani multipli compreso Borrelia burgdorferi⁷, l’agente eziologico della malattia di Lyme, l’ottimizzazione di una tecnica di visualizzazione microbica mirava a miglioramento della nostra comprensione del microbiota dell’intestino tick nel contesto delle interazioni di vettore-patogeno. Parecchie domande rimangono da risolvere nel campo microbiome tick. L’intestino è il sito del primo incontro esteso tra il segno di spunta e l’agente patogeno in arrivo nel contesto degli agenti patogeni orizzontalmente trasferiti; Pertanto, la comprensione del ruolo del microbiota dell’intestino vettoriale nel modulare le interazioni di vettore-patogeno rivelerà significativi approfondimenti. Le zecche hanno una modalità unica di digestione del pasto di sangue, dove l’elaborazione del pasto di sangue componenti prende posto intracellulare⁸. Lume dell’intestino apparentemente serve come recipiente per contenere il pasto di sangue come i feed di tick, e assimilazione e digestione nutriente derivarne durante i diversi giorni di alimentazione e continuare post replezione. Gli agenti patogeni acquisiti dal segno di spunta durante l’alimentazione Inserisci lume dell’intestino con le farine di sangue e il lume diventa così un sito primario delle interazioni tra il tick, agente patogeno e microbiota residente. Come digestione procede attraverso la replezione e zecche Ixodidae molting, intestino subisce modificazioni strutturali e funzionali⁹. È anche probabile che variano in concerto con il milieu di intestino cambiando la composizione e l’organizzazione spaziale dei batteri dell’intestino. Pertanto, è importante capire l’architettura di batteri residenti nell’intestino tick per comprendere appieno l’interazione di tick, agente patogeno e microbiota dell’intestino.

Tecniche molecolari per descrivere il microbiota host associato abitualmente utilizzano high throughput sequenziamento parallelo strategie¹⁰ per amplificare e sequenza DNA ribosomal 16S batterica (rDNA). Queste strategie di sequenziamento eludere la necessità di ottenere colture axeniche di batteri specifici e forniscono una descrizione approfondita di tutti i membri batterici rappresentata nel campione. Tuttavia, tali strategie sono confusi dall’incapacità di distinguere contaminazioni ambientali da residenti di bona fide . Ulteriormente, quando valutare i campioni, come le zecche, che sono di piccole dimensioni e quindi contengono DNA microbiota-specific basso cede, la probabilità di amplificazione di contaminanti ambientali è aumentato¹¹ e risultati nell’interpretazione ambigua della microbioma composizione. Caratterizzazione funzionale in combinazione con la visualizzazione di specifici batteri vitali, pertanto, sarà fondamentale per definire e discernere il microbioma del battito temporalmente e spazialmente. Verso questo obiettivo, abbiamo approfittato dell’intero-monta RNA in situ ibridazione. Questa tecnica è usata ordinariamente per valutare il pattern di espressione genica in organi ed embrioni^12,13,14 e permette l’analisi semiquantitativa dell’espressione sopra l’intero campione di interesse. Questo comportamento differisce da tecniche tradizionali in situ di ibridazione che utilizzano sezioni di tessuto e spesso richiedono un’approfondita analisi di materiale sezionato con un assembly computazionale per predire l’espressione in organi interi¹⁵. Mentre intero-monta si riferisce generalmente a interi organismi¹², qui intero-monta si riferisce all’intero fegato o organi. I vantaggi di utilizzare l’intero-monta RNA in situ ibridazione approccio per valutare l’architettura del microbiota dell’intestino tick sono molteplici. L’intestino di graduazione è composto da 7 paia di diverticoli, ogni coppia variano in dimensione¹⁶. Le differenze funzionali, se qualcuno, tra questi diverticoli, non sono compresi nell’ambito della biologia di tick, tick interazioni microbiota o tick-patogeno. Manipolazioni dell’intestino che rompersi i diverticoli intestino sarebbero spostare il microbiota presente nel lume dell’intestino o quelle associate senza bloccare l’intestino e il risultato in un’interpretazione errata della localizzazione spaziale del microbiota. Fluorescenza-identificato RNA in situ ibridazione è stata utilizzata in precedenza per esaminare tick gut trascrizioni¹⁷ fissando e diverticoli intestino individuali per garantire l’ibridazione della sonda e per localizzare b. burgdorferi di apertura trascrizioni sezionando paraffina tutta zecche¹⁸. Entrambi questi approcci richiedono manipolazioni dei tessuti tick prima dell’ibridazione che interesserebbero l’architettura del microbiota intestinale.

In questo rapporto, descriviamo in dettaglio il protocollo per esaminare il battito vitale microbiota dell’intestino intero-monta in situ ibridazione (WMISH). L’uso dell’intero-monta RNA in situ ibridazione consente una comprensione globale della presenza e abbondanza di batteri dell’intestino specifici nelle diverse regioni dell’intestino e può stimolare nuove intuizioni biologia di intestino tick nel contesto della colonizzazione del patogeno e trasmissione. Ulteriormente, l’uso di sonde di RNA nei confronti di specifico RNA batterico permette la rilevazione di batteri vitali nell’intestino tick.