Cuantificar la morfología de la microglía de microfotografías de la inmunohistoquímica preparado tejido con ImageJ

Todos los experimentos fueron aprobados por y realizados de acuerdo con los lineamientos establecidos por el Comité de uso y la atención Animal institucional de la Universidad de Arizona y las directrices de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Se tuvo cuidado para minimizar la incomodidad y el dolor animal. Métodos de eutanasia son de acuerdo a un protocolo aprobado y constan de decapitación cervical bajo anestesia isoflurano. 1. preparación de tejido Nota: Llevar a cabo análisis de morfología de microglia en muestras de tejido de cryoprotected fijo, para preservar la morfología celular. El siguiente es un protocolo estándar para preparar y cortar directamente tejido fijo para fluorescencia IHC. Quitar cerebros de ratón o rata de un sacrificio animal después de la experiencia deseada y de acuerdo con un protocolo estándar de laboratorio. Colocar el cerebro en un frasco de 10 mL que contiene 5 mL de una solución de paraformaldehído al 4% durante 24 h a 4 ° C. Luego enjuague y lugar en 5-10 mL de un fosfato de sacarosa al 30% de solución amortiguadora (SSAF, 0.01 M por 72 h) a 4 ° C. Almacenar los cerebros enteros a-80 ° C hasta tejido seccionado con un criostato, o a 4 ° C si Seccionando con un micrótomo.Nota: Este Protocolo no ha todavía ha probado utilizando tejido en rebanadas del tejido parafina-encajado. Sección de tejido cerebral para el grueso de la sección deseada y la orientación mediante un criostato o un micrótomo y tienda secciones flotan libremente en una solución de crioprotección (50 mM PBS, etilenglicol, glicerol) a-20 ° C.Nota: Este protocolo ha sido realizado con éxito en secciones de tejido coronal entre 50 μm y 200 μm de espesor. Secciones de tejido menos de 50 μm, no captura el intervalo completo de los procesos de la microglia, mientras que en secciones de tejido grueso, tinción IHQ puede ser imperfecta por la penetración del anticuerpo en tejidos. Tejido puede ser seccionado o bien en una coronal o sagital orientación y esta elección dependerá de las regiones meta y cerebro experimentales a estudiar. 2. inmunohistoquímica Nota: Pueden aplicarse métodos de análisis de esqueleto y fractal fluorescencia o 3, 3 ‘-diaminobenzidina (DAB) IHC. El siguiente es un protocolo IHC de fluorescencia estándar y puede ser sustituido cuando sea necesario. Fluorescencia IHC rendimientos superior visualización de procesos de la célula en comparación con DAB IHQ. Coloque las secciones de tejido en un frasco de vidrio de 4 mL (hasta 15 mouse cerebro secciones/vial) e incubar con 1 mL de solución con un contenido de 10% de suero de caballo, PBS (0,01 M), 0,5% Tritón, 0.04% NaN3 a temperatura ambiente (23 ° C) durante 1 h. Lavar durante 5 minutos con PBS (0.01 M) tres veces a temperatura ambiente. Incubar con el anticuerpo primario (Iba1, 1:1, 000) a temperatura ambiente durante 72 h en 1 mL de solución contiene 0,5% Triton en PBS (0.01 M), 0.04% NaN3y cubierto (para preservar la eficacia de3 NaN). Lavar durante 5 minutos con PBS (0.01 M) tres veces a temperatura ambiente. Incubar con el anticuerpo secundario (anti-conejo 488, 1: 250) cubierto a temperatura ambiente durante 4 h en 1 mL de solución PBS (0.01 M), 0,5% Tritón, 0.04% NaN3 Lavar durante 5 minutos con PBS (0.01 M) tres veces a temperatura ambiente. Montar las secciones de tejido cerebral (número y orientación según preferencia) a portaobjetos subbed, aplicar un medio de montaje suave-set a la diapositiva y colocar el cubreobjetos sobre el tejido. Almacenar las diapositivas a 4 ° C.Nota: Un grueso cubreobjetos de 1.5 vidrio es necesario para la proyección de imagen confocal. Soft-set es un medio de montaje recomendado: debido a la alta viscosidad no comprime el tejido y mejor conserva la morfología en comparación con medios de montaje observó. 3. la proyección de imagen Imagen Iba1 las células positivas en la sección de tejido cerebral utilizando un microscopio de campo brillante o confocal que tiene una capacidad de adquisición de z-pila usando un 20 X objetivo o mayor.Nota: Parámetros y configuración de software de imagen debe ser constante para todos adquisición de microfotografía en un experimento. Detalle de proceso excelente se obtiene utilizando un 40 X u objetivo X 63. Es posible aplicar el protocolo de Análisis esquelético descrito una microfotografía entera o un ROI múltiples de la célula dentro de una microfotografía más grande. Adquisición de imágenes de 8 bits mediante la configuración de software apropiado específica para el software del microscopio.Nota: La conversión de ficheros en 8 bits después de la adquisición puede distorsionar la recolección de datos. Adquirir al menos un z-stack de 30 μm con no más de un intervalo de 2 μm entre imágenes usando la configuración de software apropiado específica para el software del microscopio.Nota: El microscopio y el software deben permitir la adquisición de imágenes en un eje X, Y y Z. Un z-stack puede aumentarse, y el intervalo puede reducirse para proporcionar el detalle adicional de la microglia. En cambio, tiempo de la proyección de imagen va a aumentar. Uso de muestreo de Nyquist posible para microscopía de fluorescencia. Guarde todos los archivos como archivos Tif o como requerido por el software del microscopio. Abra los archivos Tif en ImageJ y utilice la barra de herramientas para dividir canales haciendo clic en imagen | Color | Dividir canalesy pila de imágenes haciendo clic en imagen | Pilas | X proyecto | Proyección de intensidad máxima cuando proceda. Guardar archivos de .tif. 4. esqueleto análisis Descargar FIJI o ImageJ de . Para los plugins individuales, descargar AnalyzeSkeleton(2D/3D) de 15 y descarga FracLac de 16.Nota: Todo el proceso de conversión de una microfotografía a una imagen binaria del esqueleto tarda menos de 1 minuto. Si utiliza una microfotografía de fluorescencia, garantizar que la imagen es de 8 bits y convertir a escala de grises para mejor visualizar la coloración positiva todos. Utilice la barra de herramientas y haga clic en imagen | Tablas de búsqueda | Greys. Si se utiliza una fotografía de campo brillante de DAB, primer uso las FFT bandpass filtro plugin (utilizando la barra de herramientas haciendo clic en proceso | FFT | filtro paso de banda) y luego convertir a escala de grises.Nota: Para los efectos del presente Protocolo, ImageJ por defecto para un filtro pasabanda de FFT es suficiente (filtro de hasta 3 píxeles, hasta 40, no supresión de la banda). Aplicación de un Filtro Bandpass de FFT elimina el ruido (pequeñas características) preservando los aspectos generales más grandes de la imagen. Esto es particularmente útil en imágenes de campo claro, donde se divide y grietas en el tejido pueden aparecer como fondo y así complicar el análisis esquelético18. Ajustar el brillo y contraste si la imagen es demasiado oscura y no se pueden visualizar el proceso de la microglia. Utilice la barra de herramientas y haga clic en imagen | Ajustar | Brillo/contraste. Ajuste los controles deslizantes de mínimos o máximos según sea necesario, hasta los bordes el histograma pero no más.Nota: En ImageJ, brillo y contraste son cambiadas por actualización de tabla de búsqueda de la imagen (LUT), para que valores de píxel han cambiado. Deslizadores de Max y min de control los límites inferiores y superiores de la gama de la pantalla, con valores de los píxeles sobre 255 aparece blanco y valores de los píxeles por debajo de 0 que aparece negro18. En el caso de microfotografías de fluorescencia, debe utilizarse el máximo regulador, mientras que el regulador mínimo se usará para Microfotografías de DAB manchado microglia. Ejecutar un filtro máscara de enfoque para aumentar aún más el contraste usando la barra de herramientas haciendo clic en proceso | Filtros | Máscara de enfoque. Para los efectos del presente Protocolo, por defecto de ImageJ (un radio de píxeles de 3 y peso de 0,6 de la máscara) se utilizan.Nota: La máscara de desenfoque agudiza y mejora las características del borde de una imagen por restar una versión borrosa de la imagen (máscara de enfoque) de la original y luego fusionar la imagen resultante con una versión de alto contraste de la imagen original. Por lo tanto, el filtro máscara de enfoque no crea detalles, sino que aclara bastante el detalle existente en una imagen. El radio ajuste cambios como borrosa la máscara de enfoque será (y se eliminarán así cómo mucho desenfoque), y el peso de la máscara ajuste cambios el grado de contraste que se fusionará con la máscara de enfoque (y así se ajusta el contraste de la imagen final). Realizar un paso de eliminar exceso de puntos para sacar de estriada ruido generado por la máscara de enfoque. Utilice la barra de herramientas y haga clic en proceso | Ruido | Refinar.Nota: Refinar quita ruido entrecano sustituyendo cada píxel por el mediana valor en su vecindario de 3 × 3. El efecto es que afloramientos en intensidad son substituidos por pixel mediano sin afectar la nitidez de los bordes18. Convertir la imagen a binario usando la barra de herramientas haciendo clic en imagen | Ajustar | Umbral.Nota: Umbral estratifica las imágenes en escala de grises en características de interés versus fondo y convierte la imagen en binario18. El refinar, cercano-, de poner y quitar funciones de afloramientos: en la imagen binaria resultante, puede haber ruido de fondo del píxel y las diferencias entre procesos. Aplicar la función de eliminar exceso de puntos utilizando la barra de herramientas haciendo clic en proceso | Ruido | Refinar.Nota: Aplicación de refinar al binario imagen elimina cualquier ruido píxel restantes. Aplicar la función cercana utilizando la barra de herramientas haciendo clic en proceso | Binario | Cierre.Nota: Este plugin conecta dos píxeles oscuros si están separados por un máximo de 2 píxeles. Aplicar la función de afloramientos de eliminar usando la barra de herramientas haciendo clic en proceso | Ruido | Eliminar valores extremos.Nota: Para los efectos del presente Protocolo, brillantes afloramientos están dirigidas con un radio de píxeles de 2 y un umbral de 50. Este plugin reemplaza un píxel brillante u oscuro aislados por los píxeles mediana en el área circundante si se desvía por más de un determinado valor (umbral)18. Guarda la imagen como un archivo independiente para el futuro análisis de uso o fractal y skeletonize la imagen con la barra de herramientas haciendo clic en proceso | Binario | Skeletonize. Seleccione la imagen esqueleto y ejecutar el plugin AnalyzeSkeleton(2D/3D) usando la barra de herramientas haciendo clic en Plugins | Esqueleto | Analizar el esqueletoy marca la casilla de información de la rama.Nota: Es probable que el proceso de imagen requiere optimización con la adición o supresión de los pasos sugeridos anteriormente. En este proceso, se evalúan los imágenes esbozados para exactitud creando una superposición de la imagen original y el esqueleto. Somas se deben puntos de origen con procesos que emana desde el centro; somas circular confundir los datos y deben evitarse con ajuste de protocolo. Un ejemplo de un punto de origen frente a Soma circular se ilustra en la figura 1. Problemas comunes resultante en esqueletos no representativa y sugiere soluciones: Imagen muy tenue: convertir a escala de grises, ajustar los controles deslizantes de brillo y contraste o aplicar máscara de enfoque Mucho fondo: ajustar los controles deslizantes de brillo y contraste, aplicar refinar o quitar outliers Circular somas en imagen esqueleto (sobre todo para imágenes de fluorescencia): aplicar Filtro Bandpass de FFT, o máscara de enfoque Grietas en el tejido (especialmente para imágenes de campo claro): aplicar Filtro Bandpass de FFT, o refinar Copiar todos los datos de los resultados e información de la rama salidas y pegar los datos en una hoja de cálculo de Excel. En Excel, recortar los datos para eliminar fragmentos de esqueleto que resultan de la adquisición de IHC y de imagen. Duplicado del libro de experimento con la salida de datos de Análisis esquelético y agregar ajuste al nombre de archivo. Todo recorte de datos posteriores debe ocurrir en el libro duplicado para preservar los datos en bruto para referencia y uso futuro. Determinar que longitud de los fragmentos se recortará del conjunto de datos abriendo la imagen esqueleto en ImageJ y seleccionar la herramienta línea. Medir varios fragmentos, tomando nota de la longitud media y decidir sobre un valor de corte.Nota: Para los efectos de los datos presentados aquí, la longitud de corte de fragmentos no deseados es de 0,5. Este valor debe ser consistente a través de un conjunto de datos. Custom ordenar la hoja de cálculo Excel por haga clic en ordenar y filtrar | Ordenación personalizada. Ordenar por “extremo voxels” de mayor a menor y, en un nuevo nivel, por “Mx rama pt” de mayor a menor. Quitar cada fila que contiene 2 extremos con una longitud máxima de la rama de menor que el valor de corte (es decir., 0.5). Suma los datos en la columna de criterios de valoración para calcular el número total de criterios de valoración recogidos en la imagen. Repetición de datos rama: ordenar por ‘longitud de la rama’ de mayor a menor. Desplazarse por los datos y quitar cada fila que tiene una longitud de rama de menor que el valor de corte(es decir., 0.5). Suma los valores en la columna de longitud de rama para calcular la longitud sumada de todas las ramas de la imagen. Repita los pasos 4.11.3-4.11.5 para cada imagen/hoja hasta que todos los datos han sido recortados y suman. Dividir los datos de cada imagen (suman número de puntos finales y sumar la longitud de la rama) por el número de microglía somas en la imagen correspondiente. Entrar los datos finales (extremos de la célula y longitud/célula) en el software estadístico.Nota: Los datos sumados rama del longitud/celular pueden requerir conversión de longitud en píxeles a micras. 5. Análisis fractal Nota: FracLac es capaz de ejecutar una serie de análisis de formas que no están cubiertos en el presente Protocolo. Para una explicación más detallada de FracLac de distintas funciones, consulte el manual de FracLac en y referencias asociadas 2,16,19. Análisis fractal utiliza los pasos del Protocolo 4.1-4.7 descrito anteriormente. Determinar el tamaño del ROI que se utilizará para todos los análisis fractal. Utilice la herramienta Rectángulo para dibujar el ROI. Asegúrese de que la caja sea lo suficientemente grande como para capturar toda la célula y puede permanecer constante a lo largo del conjunto de datos.Nota: Utilice la selección de rectángulo en lugar de la selección a mano alzada para que ROIs todos son el mismo rectángulo de tamaño, y por lo tanto, las células tienen la misma escala. Esto no sería el caso si la selección a mano alzada se utiliza pues ImageJ escala automática un ROI cuadrado para adaptarse a diferentes ventanas rectangulares tamaño dando como resultado células con diferentes escalas. Mientras que formas fractales son independientes de la escala, el proceso de análisis fractal usando FracLac para ImageJ depende de escala16. Por lo tanto, es la necesidad de un ROI siempre tamaño a lo largo de la recolección de datos. Al azar seleccione microglia para análisis fractal en cada fotomicrografía e imagen binaria correspondiente. En la ventana del administrador de ROI, seleccione actualización para bloquear el retorno de la inversión en la posición de la celda. Utilice Ctrl + Mayús + D para duplicar el área dentro del ROI como una nueva ventana y guarde la célula cultivada. En la imagen binaria correspondiente (desde el análisis del esqueleto), duplicar el área con la misma célula mediante el ROI manager. Repita hasta que un número suficiente de células ha sido seleccionado al azar para el análisis fractal y guarde todos los archivos.Nota: Un generador de números aleatorios y una cuadrícula numerada pueden utilizarse para seleccionar aleatoriamente las células. Abra la imagen binaria con la célula individual. Haga doble clic en la herramienta de pincel, establecer el color a negro y ajuste el ancho del pincel según sea necesario. La fotomicrografía correspondiente como referencia, utilizar la brocha para eliminar procesos de la célula adyacente, conectar procesos fragmentados y aislar la célula de interés. Una vez aislada la celda binaria, guarde el archivo binario.Nota: Holding ‘alt’ cambiará el pincel desde el color frontal (negro) al color de fondo (blanco). Convertir la celda binaria a un esquema utilizando la barra de herramientas a través de proceso | Binario | Esquema.Nota: FracLac de imagen J puede ser utilizado en cualquiera de los dos formas sólidas o forma describe, sin embargo, Convenio actual es a utilizar forma describe16. En la barra de herramientas, abra el FracLac usando la barra de herramientas haciendo clic en Plugins | Análisis fractal | FracLac y seleccione BC (cuenta caja). En la configuración de Diseño de cuadrícula , establezca Num G en 4. Bajo Opciones de gráficos , marque el cuadro de mediciones para analizar el casco convexo y círculo delimitador de la célula. Cuando haya terminado, seleccione OK.Nota: Num G es el número de la caja contando orientaciones de rejilla utilizados durante la exploración y el intervalo recomendado para Num G es 4-12. El valor de Num G y el rango sugerido bien se revisa en el manual de FracLac16. Aumentar Num G puede retardar significativamente tiempos de cálculo. FracLac configuración sólo tendrá que configurar una vez por sesión. Una vez que se han introducido los ajustes, estará disponible el botón Scan. Seleccione el botón Scan para ejecutar una exploración de la cuenta de caja en la imagen seleccionada.Nota: El análisis generará tres ventanas con salidas de datos: casco y círculo resultados, archivo de Resumen de cuenta de caja y tipos de análisis. La ventana tipos de escaneo contiene un registro de la configuración utilizada, desviaciones estándar, así como para ciertas medidas. Para los efectos del presente Protocolo, la ventana tipos de análisis no se utiliza y puede ser cerrada o guardar para referencia futura. En la ventana Resultados de círculo y casco , copiar datos del todo deseados (es decir., densidad, proporción de palmo y circularidad) resultados. En la ventana de Resumen de cuenta de caja , copia los datos deseados (es decir., dimensión fractal y lagunaridad) resultados. Transferencia de los datos copiados a un archivo de Excel o software estadístico.Nota: Un listado completo de lo FracLac de salida de datos son proporcionados y bien explicados en el FracLac de ImageJ manual16.