JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurosciences

Amiloid β mevduat matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi Imaging ile insan beynindeki görselleştirme

Published: March 07, 2019
doi:
10.3791/57645
, , , , , ,
1Department of Life and Medical Systems,Doshisha University, 2Bruker Daltonics K.K., 3The Brain Bank for Aging Research,Tokyo Metropolitan Geriatric Hospital and Institute of Gerontology, 4Graduate School of Brain Science,Doshisha University

Summary

Moleküler görüntüleme matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma tabanlı görüntüleme kütle spektrometresi (maldı-IMS) ile birden çok analitler eş zamanlı haritalama biyolojik örnekleri sağlar. Burada, Alzheimer hastalığı ve serebral amiloid angiopathy örnekleri maldı-IMS kullanarak beyin dokuları algılama ve görselleştirme amiloid β protein için bir iletişim kuralı mevcut.

Abstract

Alzheimer hastalığı (Ah) nevropatoloji birikimi ve amiloid β (Aβ) peptidler toplama içine beyin hücre dışı plaklar ile karakterizedir. 40 amino asitleri, oluşan Aβ peptidler amiloid habercisi proteinler (APP) β – ve γ-secretases tarafından oluşturulur. Aβ sadece beyin parankimi zamanda leptomeningeal ve serebral damar duvarları, serebral amiloid angiopathy (CAA) bilinen yatırılır. Aβ peptidler çeşitli tespit edildi iken, detaylı üretimini ve dağıtımını bireysel Aβ peptidler reklam patolojik dokularda ve CAA değil tam olarak ele. Burada, bir protokol matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma tabanlı görüntüleme kütle spektrometresi (maldı-IMS) kapsamlı protein eşleme elde etmek için insan otopsi beyin dokuları üzerinde geliştirmek. Bu amaçla, insan kortikal numuneler Tokyo Metropolitan Gerontoloji Enstitüsü, beyin bankadan elde edilmiştir. Donmuş cryosections kes ve indiyum-teneke-oksit (ITO) transfer-kaplı cam slaytlar. Spectra elde maldı sistemini kullanarak uzamsal çözünürlük ile ilâ 20 µm. Sinapinic asit (SA) düzgün yatırılır ya otomatik ya da el ile bir püskürtme kullanarak slayt üzerinde. MALDI-IMS geçerli teknik avantajları ile çeşitli Aβ tür aynı bölümleri içinde insan beyni bakılırsa tipik bir veri kümesi belirli probları elde edilebilir. Ayrıca, yüksek çözünürlüklü (20 µm) görüntüleme bir reklam beyin ve şiddetli CAA örnek açıkça gösterir iken Aβ1-42 ve Aβ1-43 beyin parankimi Senil plak (SP) tevdi tevdi Aβ1-36 Aβ1-41 leptomeningeal damarlarının. Reklam, CAA, patoloji anlamada, genetik, klinik ve patolojik gözlemleri ile birlikte standart bir yaklaşım olarak maldı-IMS benimsemeye uygun ve diğer nörolojik hastalıklar üzerinde mevcut strateji tabanlı.

Introduction

Tanı yapmak için ve nörodejeneratif hastalıkların patogenezinde anlamak için hassas moleküler patolojik mevduat gerekli1tanımlamasıdır. Reklam sırasında Aβ SPs beyin parankimi yapmak için üretilen ve damarlarının yatırılır çok önce hastalık başlangıcından2,3,4,5,6. Aβ1-42 AD beyin SP baskın peptid olmakla birlikte, N-terminal veya C-terminal gibi diğer Aβ türevleri kesildi veya Aβs değiştirilmiş, aynı zamanda etkilenen reklam beyin7,8,9‘tespit, 10. Tam bir resim insan beynindeki geniş Aβ dizi türlerin özellikle reklam ve serebral amiloid angiopathy (CAA)11, yardımcı olacaktır Aβ üretim, metabolizma ve ifade anlamak bilim adamları.

Nevropatoloji klasik yaklaşım, immünhistokimya (IHC) beyin dokuları12,13,14,15Aβs konumunu belirlemek için en kesin yöntem olmuştur. Genel olarak, ne zaman aynı anda çeşitli epitopları arada IHC molekülleri ayırt edemez. Buna karşılık, ortaya çıkan bir kütle spektrometresi tabanlı proteomik analiz özellikle Aβ türler antikorlar16,17ile ayrıştırılan beyin dokularında çeşitli analiz etmek için değerli bir yaklaşımdır. Beyin lysates ve immün çöktürülmüş örnekleri geleneksel kütle spektrometresi tabanlı analizi küçük Aβ peptidler algılamak başarısız olur ve Aβ dağıtım bilgileri beyin dokusu içinde kaybeder.

Önceki eserlerinde Aβ mevduat fare beynindeki görselleştirme reklam, APP23 gibi bir transgenik hayvan modelini kullanma başarılı olmuştur. Ancak, bu işlem hala teknik gelişmeler ile ilgili olarak çözünürlük ve hassasiyet18,19,20IMS ve IHC karşılaştırmak gerekir. Reklam nevropatoloji insan beyin eğitimi aldı ve biz maldı-IMS teknoloji insan otopsi beyin dokuları üzerinde kapsamlı protein eşleme21elde etmek için kullanılır. Bu amaçla, biz onun hız, hassasiyet ve tekrarlanabilirlik avantajları vardır kütle spektrometresi gelişmiş bir tür için bir iletişim kuralı geliştirilmiştir.

Protocol

Burada, doku örnekleri Japonya’da yaşlı nüfus için topluma dayalı sağlık hizmetleri sağlayan Tokyo Metropolitan geriatrik Hastanesi toplanmıştır. Çalışmada kullanılan beyin otopsi örnekleri beyin bankaya ölenin yakınları Onam ile yaşlanma araştırma (BBAR) için kaydedildi. BBAR Tokyo Metropolitan Hastanesi Geriatri ve Gerontoloji Enstitüsü Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Beyin bankada kayıtlı tüm beyin hastaları veya aileleri yazılı bilgilendirilmiş izinlerin kullanımları için tıbbi araştırma için aldığınız. Hastaların beyin öldükten sonra değişiklikleri azaltmak için ölümünden sonra 2 saat içinde soğuk (4 ° C) Oda yerleştirildi. Burada açıklanan tüm yöntemleri yaşlanma araştırma, Tokyo Metropolitan Hastanesi Geriatri ve Gerontoloji Enstitüsü için Doshisha Üniversitesi ve beyin banka tarafından onaylanmıştır. 1. IMS için hazırlık doku bölümleri İnsan autopsied beyin doku numune işlemeNot: emin olun örnek hazırlama adım IMS için doku özgün durumunu korur. Kirlenme ve öldükten sonra değişikliklerinden sakınınız. Aşağıdaki adım çok önemlidir. İnsan kortikal örnekleri IMS için kaldırıldı, işlenen ve 8 h öldükten sonra içinde-80 ° C’de depolanan beyin ile alın. Oksipital korteksi reklam hasta ve yaş eşlemeli denetimleri21üzerinden beyin numune al. Donmuş doku bölümleri hazırlanması Bir cryostat doku bölümlerde kesti. İletken mikroskop ITO kaplı cam slaytlar cryostat21içine yerleştirin. Otopsi beyin numune-80 ° C’den-22 ° c cryostat içinde sıcak. Her deneme için cryostat yeni bir tek kullanımlık bıçak iliştirin. Her zaman bıçak temiz bir parçası kullanmayı deneyin. OCT bileşik küçük bir miktar ile birlikte sahnede donmuş otopsi beyin koymak (orijinaliyle merkezi alanı kapsayacak şekilde yeterli Malzemeler tablobakın). İnce kesit için koşulları seçin. IMS için 10-12 mikron kalınlığında insan beyin bölümleri için kullanın. IMS ve IHC için 5-6 bölümleri her doku örneği kesti. Bıçak sadece doku kesmeye başlatırken, tekerlek ve “yüz” blok tüm doku maruz kadar açın. Bir küçük çizgi veya varsa gözyaşı bölüm, sıcaklık ayarı otomatik olarak giderir biraz daha cryostat içinde bekleyin. Anti-roll altında bir doku ile açmadan önce birkaç saniye sayısı. Hemen doku dilim cam slayt ITO kaplı tarafına yerleştirmek. Doku dilim bir parmak altında slayt ITO kaplı yan üzerinde koyarak çözülme. Doku slayt için sopa olacak; doku yok kırışıklıklar ile mümkün olduğunca düz olduğundan emin olun. Oda sıcaklığında bu adımı gerçekleştirin.Not: insan örnekleri Biyolojik kirleticiler içerebilir çünkü eldiven, maske ve laboratuvar elbisesi giymek. Tüm bölümler için gün yapıldığında, cryostat, fırçalar ve chucks laboratuvar mendil ile ve 200 mL % 100 etanol temiz. Doku bölümleri durulama 40-100 mL % 70 etanol için 30 örneklerinde bırakın s endojen lipidler ve inorganik tuzları kaldırmak için. Bir cam kavanoz boyama kullanın. 40-100 mL % 100 etanol için 30 örnekleriyle yıkama s, 40-100 mL Carnoy’nın çözüm için 3 dk, 40-100 mL % 100 etanol için 30 s, 40-100 mL %0,1 trifluoroacetic asit (TFA) 1 dk. için ve % 100 etanol 30 s. kullanmak bir cam için 40-100 mL kavanoz boyama.Not: Carnoy’nın altı parçaları etanol, üç bölümden Asetik asit ve bir kısım kloroform oluşan bir sabitleştirici çözümdür. Kuru bir vakum 30 dk için. Tedavi için daha iyi bir iyonizasyon otopsi beyin dokuları üzerinden Aβ proteinlerin formik asit buharı ile doku bölümlerin 0 formik asit ile 5 mL sonraki buharlaşma için kullanılacak fırın ve kuluçka cam slayt hazırlamak. Tatmin edici bir asit tedavi elde etmek için bu adımı boyunca doygunluk düzeyinde kuluçka cam tabak içinde hava nemi tutmak ve sıcaklık 60 ° C’de devam Formik asit batma kaçınırken kuluçka cam tabakta doku slaytlar yerleştirin ve 6 min için tedavi. Kullanarak bir film tarayıcı, jel tarayıcı örnekleri optik görüntüsünü almak veya bir dijital mikroskop, vb oda sıcaklığında bu adımı gerçekleştirin. Örnek hedef araç yerleştirildiğinde örnekleri optik görüntü hizalamasını gereklidir. Genellikle, bu matris katmanının altında doku bölümü tanımak mümkün değil.Not: Bir optik görüntü almak için en uygun yol bir office tarayıcısını kullanmaktır. Görüntü görüntüleme veri depolama klasörüne kaydetmek için iyi bir fikirdir. Optik görüntü örnekleri ile ilişkilendirmek için optik görüntü ve kamera Optik matris katmanının altında görülebilir Kılavuzu işaretleri olun. Optik görüntü çekmeden önce örnek nokta en az üç düzeltme sıvı alın için en kolay yolu olduğunu. Matris uygulama Matris çözüm hazırlanması Bir organik solvent dayanıklı microtube 10 mg/mL % 50 Asetonitril (ACN) ve % 0.1 SA çözüm hazırlamak TFA. İyice vortexing veya kullanım kadar kısa sonication için 10 dk. mağaza oda sıcaklığında çözüm tarafından bileşik SA geçiyoruz.Not: Matris püskürtme için üç farklı seçenek vardır: airbrush, ultrasonik bir püskürtme veya otomatik bir püskürtücü kullanarak. Matrix Pistole ile püskürtme Bir sabit Oda sıcaklığı (20-23 ° C) ve nem oranı (% 40-) işlemi gerçekleştirin. En uygun İlaçlama için ayarlamak için parametreler damlacık boyutu, sis, açı ve sprey başlığı ve doku bölümü ve laboratuvar sıcaklık ve nem arasındaki mesafe miktarı içerir. Bu koşullar mikroskobu sonuçları kontrol ederek ayarlayın.Not: Kristal boyutu ve matris kapsama polimerlerin ve istenmeyen geçiş/Difüzyon analitler ve sınırlayıcı faktörler gibi daha küçük damla boyutu için iyidir. Homojenliği de denetim noktasıdır. Matrix ultrasonik bir püskürtücü ile püskürtme Desiccator püskürtülür ve odasında yeri dokuyu. Doku sensör pencere kapsayan değil emin olun. Hazırlık başlatmak düğmesine basarak Başlat; genellikle, hazırlama süresi yaklaşık 90 dakika var. Hazırlık otomatik olarak matris tabakası kalınlığı ve ıslaklık izleme yoluyla düzenlenmiş olması. Hazırlık tamamlandıktan sonra slayt çıkarın ve maldı enstrüman okumadan önce desiccator 15 dakika içinde saklayın. Püskürtme ile 2-3 mL sprey kafa görünene kadar MeOH temiz % 100 temiz.Not: Matris damlacıkları ince bir sis dokusu içine batmaya yerçekimi tabakasıyla izin verilir. Bir ortalama damlacık boyutu 20 mikron oluşturulur; Tüm damlacık çapı 50’den az mikron sağlamaktadır. Matrix otomatik bir püskürtücü ile püskürtme Sprey otomatik bir püskürtücü ile doku yüzeyindeki matris çözüm. Isıtmalı kılıf gaz (N2, 10 PSI, gerekse 75 ° C) sabit bir flow getirebileceği matris çözüm sprey ile teslim edilecektir. Bir çözücü pompa sistemi (10 PSI ve 0,15 mL/dk olarak ayarlamak) matris çözümü sunmak için kullanın.Not: En önemlisi, bir emanet matris aerosoller hiçbir soluma önlemek için kabin altında çalışırlar. Oda sıcaklığına ve nem homojen matris kristalizasyon çoğaltmak denetler. 2. MALDI-IMS Ultra-High-Speed kütle spektrometresi gerçekleştirin. Yüksek performans ve yüksek Uzaysal çözünürlük görüntüleme deneyler maldı-IMS 10 kHz ND: YAG ile donatılmış ile gerçekleştirmek (355 nm) lazer. Kütle spektrometresi ölçülerini maldı kontrol yazılımı ve veri analiz yazılımı kullanarak doku alanlarını tanımlayın. Spectra m/z 2.000-20.000 kitlesel bir dizi ile olumlu doğrusal modunda ve 20 ve 100 µm uzamsal çözünürlük elde etmek. Peptid kalibrasyon standart ve 1:4 TA30 çözüm olarak Alfa-Cyano-4-hidroksil-Sinanamik asit (CHCA) ile bir oranı ile standart protein kalibrasyon kalibrasyon standart yapmak için çözmek (ACN:0.1% TFA 30:70 =) ve ardından seyreltik 10 x. Kalibrasyon 1 μL standart slayt dört farklı yerlerde yerleştirin. Moleküler Histoloji yazılımını kullanarak (bakınız Tablo malzemeler), yer paylaşımı farklı Aβ peptidler SPs ve Arteryel duvarlarda colocalizing gibi çeşitli sinyallerini kayma korelasyon bulmak için birden çok tek görüntüleri. 3. veri işleme Spektral hizalama için tüm spectra seçili m/z listesine bir önceki yayın21kimden hizalayın. İstatistiksel analiz yazılımı maldı-IMS veri kümesi alma ( Tablo malzemelerigörmek) ile temel çıkarma. Histolojik bilgiye dayalı faiz (ROIs) bölgelerinde iz. Tekdeğişirli çözümlemesi için ortalama yoğunluklarını, standart sapma, m/z değerleri colocalized discriminative m/z-işaretleri (ROC analizi), Hipotez testleri ve keşfi açığa çıkarmak. Bir bölümleme Haritası oluşturun. Denetimsiz bir çok değişkenli analiz büyük veri kümeleri ve bileşen analizi temel eğilimleri çıkarım için uzamsal ayrılmasını gerçekleştirir. Anatomik ROIs parankimi ve subaraknoid boşluk gibi histolojik özelliklerine dayanarak seçin. Yapıları bireysel ROIs olarak atamak ve onları ile işlenmiş MS veri bölge görüntü ayrılmasını izin ilişkili peptidler tanımlamak için aralarındaki ilişkileri belirlemektir.

Representative Results

CAA olan sporadik reklam hastalar (n = 5; Yani yaş 83.2 = y) ve Senil plak ücretsiz (SP O) ve CAA olan bireylerde yaşlı (n = 5; Yani yaş 77.2 = y) idi (Tablo 1) analiz. CAA fenotipleri hastanın #3 Bu çalışmada en önemli. Aβ1-40 ve Aβ1-42 mevduat #3 hastadan beyin dokusunda dağıtımları maldı-IMS ile (şekil 1) görüntülenir. Şekil 1′ de gösterildiği gibi (#9 ve #10 hasta) nonpathological denetim beyinlerinde hiçbir önemli sinyaller vardı. Burada, maldı-IMS açıkça Aβ1-42 tercihen beyin parankimi SPs yatırılır görüntülenir. Buna karşılık, Aβ1-36 1-41, gibi daha kısa Aβs tercihen leptomeningeal vasküler alanları (şekil 1) tevdi. Dağılımları, Aβ40 ve Aβ42 daha fazla dokuları bitişik donmuş bölümleri kullanarak IHC ile doğrulanmış. Anti-Aβ40 antikor için dağıtım Aβ42 beyin parankimi, SPs olarak açık aksine olan CAA şekil2B (oklar), etiketli. Aβ1-41, insan beyni bu parçayı bulmak için ilk sırada ve Aβ41 Aβ40 andAβ4221ayırt belirli antikor oluşturmuş. MALDI-IMS Uzaysal çözünürlük genellikle üzerine geliştirilmiş için en önemli faktördür. Şekil 1 ve Şekil 2 maldı-IMS 100 µm pitch çözünürlük ile göstermek ve bir genel dağıtım profili için nispeten geniş alan21elde edilir. Tam olarak subaraknoid alanı damar yapısı dahil olmak üzere, amiloid birikimi tanımlamak zordur. İnce doku yapıları subaraknoid gemilerin ve korteks yüzeyine canlandıracak yüksek çözünürlüklü maldı görüntüleme (40 µm: şekil 3; 20 µm: şekil 4 ve şekil 5) gerçekleştirildi. Sonuç olarak, maldı-IMS IHC ile karşılaştırılabilir olduğu gibi Aβ1-36 1-41, daha kısa Aβs arterler, duvarlarda dağıtılır sergilenmez. MALDI-IMS gösterdi Aβx-40 ve Aβx-42 detaylı Dağılımları (x = 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ve 11pE) reklam orta CAA beyin ile eşlik etti. Aβx-40 tür Aβ1-40’a benzer bir dağıtım profili gösterdi, örneğin, Aβ1-4221farklı dağıtım desenle Aβx-42 türler gösterdi. Geçerli iletişim kuralı tarafından bireysel Aβ peptidler maldı-IMS ile gözlenen görüntülerini tek iyon Aβ türler için atanır. Buna karşılık, görüntü veri denetimsiz çok değişkenli istatistik kullanarak görüntü segmentasyonu tanımsız proteinlerin daha fazla çözümleme için ilgi anatomik bölgelerin elde etmek için soruşturma olması satın aldı. Bir bölümleme harita aynı bölüme hasta #321uygulanan bisecting bir k-anlamına gelir analizi ile elde edilen şekil 5 gösterir. Bu kümeleme yöntem başarıyla parankimi ( şekil 5Ciçinde mavi) plak benzeri yapılar ve subaraknoid boşluk ( şekil 5Ciçinde yeşil) vasküler yapılar tespit edilmiştir. Sadece küçük bir arteriyol parankimi yanı sıra subaraknoid boşluk ( şekil 5Ciçinde mor) etrafında algılanan parankimi küçük dairesel bir alan bulmak ilginçtir. Bu rakam 5 dbu bireysel Aβ peptidler görüntülerini tek iyon tarafından doğrulanır-5F. Şekil 1: maldı-IMS donmuş bir AD/CAA, beyin bölümü. Çeşitli C-terminal kesildi Aβ peptidler şiddetli CAA (hasta #3) eşlik eden reklam görselleştirildiği denetimleri (hasta #9 hasta #10 tüm görüntüleri sol ve sağ) ve sol kapı aynası sağ panelde. #3, denetim hastalarda sinyal yok iken (durumlarda #9 ve #10) beyin diye Aβ1-42 ve Aβ1-43 beyin parankimi Senil plak yatırılan iken Aβ1-36 Aβ1-41 tercihen leptomeningeal kan damarlarının yatırılır. Çözünürlük = 100 mikron. Ölçek çubuğu 5 mm =. Bu rakam, Kakuda ve ark.21izinle değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 2: maldı-IMS donmuş reklam/CAA, beyin bölümleri ve oksipital korteksi reklam beyin üzerinden bitişik bölümlerinin. (A – C) dondurulmuş reklam/CAA beyin bölümleri ve oksipital korteksi reklam beyin üzerinden bitişik bölümlerinin (D ve E) bağışıklık lekeli ve arteriyol ve Aβ40 karşı antikor kullanarak beyin parankimi odaklı (D: BA27) veya Aβ42 (E: anti-Aβ42 poliklonal). Her iki analizleri Aβ40 tercihen leptomeningeal kan damarları (oklar panelinde D)ve arteriyoller subaraknoid boşluk ve CAA oluşturan beyin parankimi yatırılır gösterdi. Buna ek olarak, Aβ42 esas olarak SPs içinde yatırılır. IMS, çözünürlük için 100 mikron =. Ölçek çubuğu 5 mm (A, Bve C) = 5 mm, 500 (D ve E) =. Bu rakam, Kakuda ve ark.21izinle değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3: MALD-IMS donmuş reklam/CAA, beyin bölümleri (hasta #3) 40 µm çözünürlükte. Çeşitli C-terminal ve N-terminal kesildi ve şiddetli CAA (hasta #3) eşlik eden reklam Aβ peptidler değiştirilebilir. Aβ1-42 ve Aβ1-43 beyin parankimi Senil plak yatırılan iken Aβ1-36 Aβ1-41 tercihen leptomeningeal kan damarlarının yatırılır. Ölçek çubukları = 1 mm (A-B), 2 mm (sol üst). Çözünürlük = 40 mikron. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4: maldı-IMS donmuş reklam/CAA, beyin bölümleri (hasta #3) 20 µm çözünürlükte. Bu panel çeşitli C-terminal ve N-terminal kesildi ve şiddetli CAA (hasta #3) eşlik eden reklam Aβ peptidler değişiklik gösterir. Aβ1-42 ve Aβ1-43 beyin parankimi Senil plak yatırılan iken Aβ1-36 Aβ1-41 tercihen leptomeningeal kan damarlarının yatırılır. Ölçek çubukları 200 mikron (a, b, c), = 1 mm (sol üst). Çözünürlük = 20 mikron. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 5: maldı-IMS donmuş bir reklam beyin bölümü tarafından elde edilen bölümleme harita ortaya koymaktadır sözde Senil plak, büyük subaraknoid damar yapıları ve küçük parenkima arteriyoller. (A)bölümleme harita elde maldı-IMS verileri bir çok değişkenli görüntü analizi. (B) Bisecting k-tabanlı kümeleme analizi plak benzeri ve gemi benzeri yapıları Oksipital kortekste tanımlanan anlamına gelir. Kümeleri ve kümelendirilebilir ve ilişkilerini düğümleri olarak (e.g.,1-0-0) gösterilir. (C) farklı Aβ peptid yerelleştirme desenleri andıran plaklar (mavi), subaraknoid gemiler (yeşil) ve arteriyol (kırmızı) yapıları. Not bir kaç kırmızı kümeleri subaraknoid boşluğa da dağıtılır. Bu bu bireysel Aβ peptidler 20 µm çözünürlükte görüntülerini tek iyon tarafından doğrulanır: (D) Aβ 1-40, (E) Aβ 1-41 ve (F) Aβ 1-42. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Dava Cinsiyet Ölüm yaş Braak SP CAA 1 M 83 C 0,5 2 M 88 C 1 3 M 84 C 2 4 M 78 C 1 5 M 83 C 1 6 M 84 EY 0 7 M 78 EY 0 8 M 70 EY 0 9 M 73 EY 0 10 M 81 EY 0 Tablo 1: reklam klinik ve patolojik veri CAA durumları ve yaşlı SP O konular ile. İnsan kortikal örnekleri IMS ve IHC Tokyo Metropolitan Enstitüsü Gerontoloji beyin bankada elde. Her beyin numune beş reklam hasta ve beş yaş eşlemeli denetimlerin korteks oksipital çekildi. Aβ Monoklonal antikor tarafından gösterildiği gibi amiloid birikimi ölçüde Braak SP (amiloid) aşamaları tarafından tanımlanmıştır. O aşamada isocortex boyunca Senil plak hemen hemen yok orada. C aşamada hemen hemen tüm isocortical alanlar etkilenir. Reklam beyin C. aşamada değişmez Bu tablo izni Kakuda vd21ile değiştirildi.

Discussion

Burada biz Aβ ve onun izoformlarının görselleştirme sonuçlarını ve detaylı bir iletişim kuralı üzerinden reklam ile birkaç autopsied beyin gösterdi ve CAA maldı-IMS ile. Aβs ifade profil büyük ölçüde N ve C-terminal çeşitleri Aβ1-42 değiştirildi. Aβ1-41 ilk tespit ve geçerli protokol ile insan beynindeki görüntülenir ve daha fazla IHC21ile doğrulandı. IMS tarafından yatırılan Aβ morfolojisi yüksek çözünürlüklü analiz (20 mikron) IHC ile iyi anlaşma olması gerektiğini düşünüyor, IMS ve IHC eşit Aβ mevduat onların konumu ve protein içeriği, yanı sıra onların morfolojisi ayırt için katkıda bulunur. Burada açıklanan tüm oksipital korteksi yapılan gibi farklı beta-amiloid türlerin yerelleştirme tüm beyin bölgeleri arasında eğitim gelecekteki deneyler geçerli iletişim kuralını kullanarak Genelleştirilmiş.

Kritik protokol içinde insan beyin dokularında toplanan proteinlerin etkili bir iyonizasyon elde etmek için doku hazırlık adımları adımlardır. Bir matris tabaka lazer enerjisini absorbe ederek, desorpsiyon ve analitler iyonlaşma ikna etmek için gereklidir. Bu süreçte, bir tüm doku bölümü homojen küçük kristallerle kaplı. Analit matrix ile homojen cocrystallization yüksek-duyarlı ve yapı içermeyen görüntüleme için önemlidir. Üç sprey yöntemlerin her biri kendi avantajları vardır. El ile sprey kaplama en sık kullanılan yöntemlerden biridir. Pistole uygundur; Ancak, usta işlem gerektirir. Hassas ve tekrarlanabilir deneysel teknik gerekli olduğu gibi ultrasonik bir püskürtücü ve/veya otomatik bir püskürtücü geçerli iletişim kuralları’nda açıklandığı gibi kullanılması önerilir. Bir odanın içine püskürtülür çünkü ultrasonik bir püskürtücü ile ilgili olarak bu nem ve sıcaklık Oda tarafından etkilenir değil. Bu arada, otomatik bir püskürtücü ile iyi tekrarlanabilirlik ile nispeten korunmuş Uzaysal çözünürlük elde edilir. Genel olarak, üç yöntem artarak 1) airbrush, 2) otomatik cihaz ve 3) ultrasonik püskürtme sırasına göre elde edilen Uzaysal çözünürlük.

En önemlisi, bu protokolü ilk olarak algılayıp Aβs insan beyninin bakılırsa örneklerinde görselleştirmek için oluşturuldu. İnsan APP İsveç tipi mutasyon dayalı reklam hayvan bir model olarak oluşturulan görselleştirme maldı-IMS ile Aβs için APP23 fareler, daha önce başkaları tarafından bir varolan yöntem18,19ile bildirilmiştir. Ancak, APP23 için uygulanan eski protokol onun yanal çözünürlük ve hassasiyet Aβ görselleştirmek için yeterli değildi. Önceki işleri yüksek Aβ konsantrasyonlarda doku sınır dışında açıkça APP23 ile onların iletişim kuralı18,19görüntüleme aktarımında açıklanmıştır. Yani sözde ‘gerçek SPs ve IMS arasında matris ayıklama adım nedeniyle görüntü Bulanıklığı’ maldı-tipi görüntüleme ile kaçınılmazdı. Ancak, geçerli protokolündeki görüntü kayboldu ve her spektrum beyin parankimi tek her SP temsil.

Burada gösterildiği gibi biz reklam ilk kez Aβ1-41 izleyebilirsiniz ve CAA beyin maldı-IMS yanı sıra IHC, spesifik bir antikor kendi üretimi21tarafından. Aβ1-41 Aβ1-45 türeyen γ-secretase kademeli bölünme27,28,29,30‘,31 iken Aβ işleme modeline göre Aβ1-45 ile Aβ1-42, Aβ1-38 türer . Bu geçerli protokol bu model desteklediği anlamına gelir. Bu teknik sınırlamalar gelince, biz insan otopsi beyin örneklerinden heterojen göz önünde bulundurulmalıdır. Bir anlamda, en kritik adım nitelikli otopsi beyin dokusu ile etik kanıt değerlendirmek etmektir. Tam otopsi beyin dokuların geçerli protokol ile maldı-IMS ayrı ayrı birden çok değişiklikler yanı sıra henüz olacaksın düzenleyen reklam, patogenezi bilinmeyen factor(s) sahip karmaşık molekülleri tüm dağıtım izleyebilirsiniz tanımlı. Ayrıca, yaşlı insan beynindeki çeşitli nevropatoloji genel patogenezinde anlamakta, nörolojik hastalıklar, genetik, klinik ve patolojik gözlemleri ile standart bir yaklaşım olarak maldı-IMS benimsemeye uygun olmalı .

Başka bir kritik maldı-IMS elde edilen veri kümesinden veri madenciliği işlemi her zaman zaman alıcı olduğu adımdır. El ile veri madenciliği her tepe dağıtım her görüntüyü tıklatın ve analiz örnek morfolojisi ilişkilendirmek dağıtımları arayın açmasını gerektirir. Otomatik uzamsal ayrılmasını madencilik, veri kümesinin bir özetini sağlar ve belirgin özellikleri hızlı algılama sağlayan veri ilk adımı olarak kullanılabilir. Bu yaklaşım, belirli bir bölge spectra arasındaki benzerlikler istatistiksel olarak belirlenir ve benzer spectra bir küme gruplandırılmıştır. Tüm pikseller onların küme atama (şekil 5) göre renk kodlu. Reklam/CAA çalışmanın, ilgi alanı Aβ işlemimiz parenkima plak ve subaraknoid ve parenkimal vasküler yapılar alanıdır. Daha fazla IHC ile doğrulanmış iki farklı zirveleri Aβ1-40 ve Aβ1-4221m/z değerleri vardı. Böylece, colocalized m/z Aβ1-40 ve N C terminali için ek açıklama eklenen kesilmiş Aβ yanı sıra daha fazla çözümleme için bilinmeyen peptidler zaten Aβ1-42 ile bulmak kolaydır.

Weller ve meslektaşları Aβ çevresinde21damarları daha fazla arterler etrafında damar duvarlarında birikir bildirdin. İnterstisyel sıvı (ISF) lenf nodu yolu ile için bir Perivasküler drenaj yolu22,23,24,25 beyin parankimi atılır Aβs içerir önerilmiştir Ayrıca, ,26. CAA için reklam21 ‘ önemli ölçüde katkıda Perivasküler drenaj yolları (şekil 5), beynin olası varlığı 20 µm çözünürlükte maldı-IMS veri kümesini temel alan bir bölümleme harita oluşturmak için geçerli protokolü destekler , 32. Ayrıca, plak ve subaraknoid damarlara ile korelasyon her m/z değerlerini hesaplayarak colocalized işaretçisi proteinler keşfedebilirsiniz. Yaşlı insan beynindeki çeşitli nevropatoloji genel patogenezinde anlamakta, klinik, genetik kurulan IHC veri ile birlikte güçlü bir yaklaşım olarak maldı-IMS ve nörolojik olarak patolojik gözlemlere benimsemeye uygun olmalıdır hastalıklar.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser kısmen yenilikçi alanlar üzerinde bilimsel araştırma için Grant-in-Aid tarafından desteklenmiştir (beyin Protein eskime ve demans denetim 26117004; M.I. ve m.). Bu araştırma kısmen stratejik araştırma programı tarafından beyin Bilimleri Japonya ajansı için tıbbi araştırma ve geliştirme (AMED) için desteklenen bir durumdu. Tüm deneyler varış yönergelere uygun olarak yapılmıştır.

Materials

Cryostat Leica Microsystems, Wetzlar, Germany CM1950
Indium tin oxide (ITO)-coated microscope glass slide Bruker Daltonics #237001
Blade (disposable) Leica Microsystems, Wetzlar, Germany #117394
O.C.T. Compound Leica Microsystems, Wetzlar, Germany FSC 22 Blue
Scanner EPSON GT-980
Air-Brush GSI Creos PS274
Compressor MRHOBBY Mr.Linear compressor L5
Ultrasonic sprayer Bruker Daltonics ImagePrep
Automatic sprayer HTX Technologies TM Sprayer
Confocal-laser-scanning-microscope Carl Zeiss Inc. LSM 700
Ultra high speed MALDI instrument Bruker Daltonics rapifleX MALDI Tissuetyper
MALDI control software Bruker Daltonics FlexControl 3.8
Data analysis software Bruker Daltonics FlexImaging 5.0
Molecular histology software SCiLS, Bremen, Germany SciLS Lab 2016a
Statistical software SCiLS, Bremen, Germany SciLS Lab 2016a
Sinapinic acid (SA) Nacalai tesque 30494-91
Alpha-Cyano-4-hydroxyl-cinnamic acid (CHCA) Wako 037-19261
Calibration standard Bruker Daltonics
Biotinylated anti-mouse IgG antibodies Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA
Biotinylated anti-rabbit IgG antibodies Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA
Avidin and biotinylated HRP complex. Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA Vectastain Elite ABC kit
3,3-diaminobenzidine (DAB) Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA Vectastain Elite ABC kit
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kovacs, G. G. Molecular Pathological Classification of Neurodegenerative Diseases: Turning towards Precision Medicine. International Journal of Molecular Sciences. 17, E189 (2016).
  2. Selkoe, D. J. Alzheimer’s disease: genes, proteins, and therapy. Physiological Reviews. 81, 741-766 (2001).
  3. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8, 595-608 (2016).
  4. Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathologica. 82, 239-259 (1991).
  5. Braak, H., Alafuzoff, I., Arzberger, T., Kretzschmar, H., Del Tredici, K. Staging of Alzheimer disease-associated neurofibrillary pathology using paraffin sections and immunocytochemistry. Acta Neuropathologica. 112, 389-404 (2006).
  6. Bateman, R. J., et al. Dominantly Inherited Alzheimer Network. Clinical and biomarker changes in dominantly inherited Alzheimer’s disease. The New England Journal of Medicine. 367, 795-804 (2012).
  7. Iwatsubo, T., et al. Visualization of A beta 42(43) and A beta 40 in senile plaques with end-specific A beta monoclonals: evidence that an initially deposited species is Abeta 42(43). Neuron. 13, 45-53 (1994).
  8. Reinert, J., et al. Deposition of C-terminally truncated Aβ species Aβ37 and Aβ39 in Alzheimer’s disease and transgenic mouse models. Acta Neuropathologica Communications. 4, 24 (2016).
  9. Saido, T. C., et al. Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, A beta N3(pE), in senile plaques. Neuron. 14, 457-466 (1995).
  10. Harigaya, Y., et al. Amyloid beta protein starting pyroglutamate at position 3 is a major component of the amyloid deposits in the Alzheimer’s disease brain. Biochemical and Biophysical Research Communications. 276, 422-427 (2000).
  11. Vinters, H. V. Cerebral amyloid angiopathy. A critical review. Stroke. 18, 311-324 (1987).
  12. Saito, T., et al. Potent amyloidogenicity and pathogenicity of Aβ43. Nature Neuroscience. 14, 1023-1032 (2011).
  13. Sergeant, N., et al. Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer’s disease as new targets for the vaccination approach. Journal of Neurochemistry. 85, 1581-1591 (2003).
  14. Suzuki, N., et al. High tissue content of soluble beta 1-40 is linked to cerebral amyloid angiopathy. The American Journal of Pathology. 145 (2), 452-460 (1994).
  15. Miyasaka, T., et al. Visualization of newly deposited tau in neurofibrillary tangles and neuropil threads. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 64, 665-674 (2005).
  16. Portelius, E., et al. Mass spectrometric characterization of brain amyloid beta isoform signatures in familial and sporadic Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica. 120, 185-193 (2010).
  17. Kelley, A. R., Perry, G., Castellani, R. J., Bach, S. B. Laser-Induced In-Source Decay Applied to the Determination of Amyloid-Beta in Alzheimer’s Brains. ACS Chemical Neuroscience. 7, 261-268 (2016).
  18. Stoeckli, M., Staab, D., Staufenbiel, M., Wiederhold, K. H., Signor, L. Molecular imaging of amyloid beta peptides in mouse brain sections using mass spectrometry. Analytical Biochemistry. , 33-39 (2002).
  19. Stoeckli, M., et al. MALDI MS imaging of amyloid. Methods in Enzymology. 412, 94-106 (2006).
  20. Seeley, E. H., Caprioli, R. M. Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 18126-18131 (2008).
  21. Kakuda, N., et al. Distinct deposition of amyloid-β species in brains with Alzheimer’s disease pathology visualized with MALDI imaging mass spectrometry. Acta Neuropathologica Communications. 5, 73 (2017).
  22. Weller, R. O., Djuanda, E., Yow, H. Y., Carare, R. O. Lymphatic drainage of the brain and the pathophysiology of neurological disease. Acta Neuropathologica. 117, 1-14 (2009).
  23. Weller, R. O., Boche, D., Nicoll, J. A. Microvasculature changes and cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer’s disease and their potential impact on therapy. Acta Neuropathologica. 118, 87-102 (2009).
  24. Weller, R. O., Subash, M., Preston, S. D., Mazanti, I., Carare, R. O. Perivascular drainage of amyloid-beta peptides from the brain and its failure in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer’s disease. Brain Pathology. 18, 253-266 (2008).
  25. Morris, A. W., et al. Vascular basement membranes as pathways for the passage of fluid into and out of the brain. Acta Neuropathologica. 131, 725-736 (2016).
  26. Hawkes, C. A., et al. Perivascular drainage of solutes is impaired in the ageing mouse brain and in the presence of cerebral amyloid angiopathy. Acta Neuropathologica. 121, 431-443 (2011).
  27. Kakuda, N., et al. Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase. Journal of Biological Chemistry. 281, 14776-14786 (2006).
  28. Matsumura, N., et al. γ-Secretase associated with lipid rafts: multiple interactive pathways in the stepwise processing of β-carboxyl-terminal fragment. Journal of Biological Chemistry. 289, 5109-5121 (2014).
  29. Morishima-Kawashima, M., et al. Effect of apolipoprotein E allele epsilon4 on the initial phase of amyloid beta-protein accumulation in the human brain. The American Journal of Pathology. 157, 2093-2099 (2000).
  30. Takami, M., et al. γ-Secretase: Successive tripeptide and tetrapeptide release from the transmembrane domain of β-carboxyl terminal fragment. The Journal of Neuroscience. 29, 13042-13052 (2009).
  31. Kakuda, N., et al. Altered γ-secretase activity in mild cognitive impairment and Alzheimer’s disease. EMBO Molecular Medicine. 4, 344-352 (2012).
  32. Carlred, L., et al. Probing amyloid-b pathology in transgenic Alzheimer’s disease (tgArcSwe) mice using MALDI imaging mass spectrometry. Journal of Neurochemistry. 138, 469-478 (2016).

Tags

Amyloid BetaMALDI Imaging Mass SpectrometryAlzheimer’s DiseaseAutopsyFormic AcidSegmentation MapsMarker ProteinsPeptidesPlaqueSubarachnoid VasculatureCryostatITO-coated Glass SlidesEthanol WashVacuum Drying

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Ikegawa, M., Nirasawa, T., Kakuda, N., Miyasaka, T., Kuzuhara, Y., Murayama, S., Ihara, Y. Visualization of Amyloid β Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (145), e57645, doi:10.3791/57645 (2019).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image