Summary

Lipopolysaccharide enjeksiyon bağırsak bariyer ihlali sonra giriş ürünlerin mikrobiyal kaynaklı taklit etmek için fareler içine

Published: May 02, 2018
doi:

Summary

Burada bağırsak bariyer ihlali sonra girişinde bileşiklerin bakteriyel kaynaklı taklit için bir protokol sunulmuştur. Lipopolysaccharide sublethal düşük dozda sistemik 24 saat sonrası enjeksiyon için izlenen fareler içine enjekte ettiler. Pro-inflamatuar sitokinlerin ifade dalak, karaciğer ve iki nokta üst üste birkaç saat noktada tespit edilmiştir.

Abstract

Bağırsak epitel bariyer normalde tolere veya göz ardı microbiota konaktan ayırır. Bu bariyer ihlali ana bilgisayar dolaşım ve iç organların iltihabi bağırsak hastalığı (IBD) olgularda gözlenen gibi kontrolsüz iltihap için önde gelen erişim ana bilgisayar içine bakteri veya bakteri kaynaklı ürün giriş sonuç bu tarafından artan bir bağırsak epitel geçirgenliği ile karakterizedir.

Ana girişinde bileşiklerin bakteriyel kaynaklı taklit etmek için bir endotoksemi modeli kabul hangi lipopolysaccharide (LPS), gram-negatif bakteri dış hücre duvarına bir bileşenidir, fareler enjekte edildi. Bu çalışmada, LPS sublethal bir doz intraperitoneally enjekte ettiler ve fareler daha sonra 8 h bir hastalık Puan kullanarak takip. Ayrıca, Il6, Il1b ve Tnfa inflamatuar sitokinlerin düzeyde dalak, karaciğer ve kolon qPCR farklı zaman noktalarda tarafından analiz edildi ifade LPS enjeksiyon sonrası. Bu model bağışıklık yanıtı araştırmaların ardından mikroorganizmalar veya vücut yüzeyleri bariyer ihlali tarafından neden olduğu bakteriyel kaynaklı ürünler işgali ile ilgili çalışmaları için yararlı olabilir.

Introduction

İnsan bağırsak bir karşılıklı yararlı ilişkilerini evrimi sırasında ana bilgisayar ile geliştirmiştir microbiota, oluşturan mikroorganizmaların büyük bir konsorsiyum ile kolonize. Vitaminler, besin sindirim ve patojenler koruma microbiota1bulunduğu ana bilgisayara microbiota sağlar, ancak bu ilişkide, ana bilgisayar güvenli bir niş microbiota için sağlar. Ev sahibi ve microbiota yararlı bu ilişkisi rahatsız zaman, iltihabi bağırsak hastalığı (IBD) gibi hastalıklar gelişebilir. IBD bir multifaktöriyel kronik inflamatuar iki önemli biçimde, Crohn hastalığı (CD) ve Ülseratif Kolit (UC) oluşan genetik ve çevresel faktörler nedeniyle bağırsak hastalığıdır. İki IBD form arasındaki benzerlikler olsa da, onlar konum ve inflamatuar değişiklikler doğası bazı farklılıklar karakterizedir. CD UC transmural sigara ve kolon sınırlı iken potansiyel olarak gastrointestinal sistem herhangi bir bölüme genişletebilirsiniz bir relaps transmural inflamatuvar hastalıktır. Ayrıca, mutasyonlar nükleotit bağlama Oligomerizasyonda etki alanını içeren protein 2 (NOD2), Muramil dipeptid (MDP), bir bileşeni en gram-pozitif – negatif bakteriler, hücre duvarı tanıdığı bir desen tanıma reseptör (PRR) olduğunu CD2ile ilişkili. Ayrıca, Escherichia coli (e.coli), Listeria ve streptokok ürünlerini tüm makrofajlar içinde bir bariyeri sonra3ana girdiğiniz CD hastalarda bulunmuştur. Bakteri veya ürünlerini ana CD geliştirilmesi sırasında girdiğinizde, anti-bakteriyel antikorlar4dolaşan üretimi için önde gelen bir yanıt bağışıklık sistemi geliştirir. Belki de, en inandırıcı kanıt microbiota IBD patogenezinde rol için fare modelleri kaynaklanıyor. Hayvanlar antibiyotiklerle tedavi edilir zaman, ya da fareler döl-özgür (GF) koşullarda tutulur, hastalığın şiddeti en kolit modellerinde gibi farelerde IL-10-/-kolit GF İmkanları5,6geliştirdiğiniz değil azalır. Ayrıca, kolit da dengesiz bir kompozisyon ile karakterizedir ve dysbiosis7denilen zenginlik azaltılmış microbiota bileşimi rahatsız ediyor. Mikroplar ve mikrobiyal kaynaklı ürünler girişine doğru ev sahibi açabilir artan bir bağırsak geçirgenliği IBD sonucu olabilir.

Hayvanlarda, uygulama Dextran sodyum sülfat (DSS) epitel bariyer8bir artan geçirgenliği için önde gelen bir bağırsak epitel gedik neden olmaktadır. DSS kolit9ile hayvanlarda Portal LPS konsantrasyonları yüksek. İlginçtir, C tipi lektin reseptör belirli hücre içi adezyon molekülü-3 eksik hayvanlar nonintegrin kapma homolog ile ilgili 1 (işareti-R1) DSS kolit ve LPS kaynaklı endotoksemi10korunur. Daha fazla ana bilgisayar yaymak için bakteri veya türetilmiş bakteri ürünleri vasküler bariyer11, küçük ve büyük bağırsak bulunur Periton boşluğuna, Mezenterik lenf düğümleri ve/veya karaciğer12geçmek zorunda. Bu sistem karmaşıklığını azaltmak için tanımlanmış bir bakteriyel kaynaklı bileşik kullanıldı. LPS, endotoksemi yol açan mayi (IP) veya Intravenous (IV) sonra enjeksiyon13 İnterlökin Il6 ifade ve Bab ve sitokin Tnfa LPS karşılık olarak çalışmaya fareler, içine enjekte.

LPS olduğunu lipid A oluşan bir hücre duvarı bileşeni Ayagin Gram-negatif bakteriler, olarak ifade edilen bir patojen ilişkili moleküler desen (PAMP) (LPS yapısı ana PAMP), çekirdek oligosakkarit ve bir O zinciri14yan. Toll benzeri reseptör dendritik hücreler, makrofajlar ve epitel hücreleri tarafından ifade edilen 4 (TLR4) Co reseptörleri için uygun bağlama gerektiren LPS15, tanır. Akut Faz LPS farklılaşma 14 kümeye LPS (CD14), bir glycosylphosphatidylinositol bağlantılı membran protein aktarır bir kompleks oluştururlar, protein LPS-bağlayıcı protein (LBP) bağlar. CD14 daha fazla LPS lenfosit antijeni 96 veya diğer adıyla MD-2, TLR4 ekstrasellüler etki alanı ile ilişkili olduğu taşırma su bendi kapakları. MD-2 LPS bağlama Miyeloid farklılaşma İlköğretim içeren aşağı akım sinyal yolu14, etkinleştirmek için hücre içi adaptör molekülleri askere konformasyon değişiklikleri ikna etmek için TLR4/MD-2 dimerization kolaylaştırır Yanıt gen 88 (MyD88) – bağımlı yolu ve tır etki alanını içeren adaptör-inducing interferon-β (TRIF) – bağımlı yolu16. LPS TLR4 tarafından tanınması sonra NF-κB yolu etkinleştirir ve proinflamatuar sitokinler, TNFα, Il-6 ve IL-1β17gibi ifadesi indükler.

LPS enjekte edilir zaman hayvanlar, hayvanlar için verilen LPS konsantrasyonu içine özellikle, hayvan ve diyet genetik arka plan kabul gerekir. LPS yüksek konsantrasyonda hipotansiyon ve birden fazla organ arızaları, ile karakterize bir septik şoka yol açar ve sonunda ölüm18. Fareler nerede LPS konsantrasyonları 2-4 ng/kg vücut ağırlığı (BW) arasında bir sitokin fırtına19ikna edebiliyoruz daha az göre uzatmaktı, LPS duyarlıdır. Fareler için öldürücü doz (LD50), hangi ölüm yarısı 10-25 mg/kg BW20 bağlı olarak kullanılan fare zorlanma fareler aralıklarının neden olmaktadır. C57Bl/6 ve BALB/c, yaygın olarak kullanılan fare suşları için 10 mg/kg BW (LD50) % öldürücü doz 50’dir. Buna ek olarak, suşları C3H/HeJ ve C57BL/10ScCr Tlr421mutasyonların kaynaklanmaktadır indüklenen LPS endotoksemi korunuyorsunuz demektir. Sonuç olarak, Tlr4-eksik fareler hiporesponsif LPS22ile enjeksiyonlar için değildir. Diğer genetik olarak değiştirilmiş fare, PARP1/fareler23 gibi LPS kaynaklı toksik şok dayanıklı vardır.

Açıklanan fare modeli burada sistemik bir bariyer ihlali sonra LPS yayılması vücudun yüzeyler sonuçlarını taklit etmek için yönetilen LPS sublethal bir doz kullanır. Seçilen LPS konsantrasyonu (2 mg/kg BW) mortalite C56Bl/6 farelerde ama pro-inflamatuar sitokinlerin indüklenen sürümü ikna etmek değil.

Protocol

Fareler yetiştirilen ve belirli patojen-Alerjik (SPF) şartlarda, biyomedikal bölümü, Basel Üniversitesi (Basel, İsviçre) hayvan tesisi devam etti. Tüm fare deneyleri İsviçre Federal ve Kanton düzenlemeler (hayvan iletişim kuralı numarası 2816 [Kanton Basel-Stadt]) uygun olarak yapıldı. 1. LPS çözüm hazırlanması Escherichia coli 0111:B4 steril koşullarda gelen saf LPS stokunun açın ve su 5 mg/mL konsantrasyonu için yeniden oluşturma. Steri…

Representative Results

Sonuçları için ana bağırsak bariyer ihlali sonra oluşur giriş bakteri veya bakteriyel kaynaklı ürün sonra taklit etmek için LPS enjekte içine sublethal doz (2 µg/g vücut ağırlığı) farelerde C57Bl/6. Her tek fare takip ve fareler görünümünü, hayvanlar, gözler, durumu ve solunum hızı ve kalitesi (Tablo 1) faaliyet içerir skor tablosunda listelenen parametrelerle endotoksemi oluşumu için attı . Hayvanlar içinde 24 h (şeki…

Discussion

Bu iletişim kuralı mikrobiyal kaynaklı ürünler tarafından işgalden sonra gerçekleşen immünolojik süreçleri taklit eder. Kritik protokol içinde fare çizgi, fareler hijyen durumunu, LPS, hayvanlar endotoksemi oluşumunu ve deney fesih süresi noktası için izleme doz seçimi adımlardır. En önemlisi, genetik arka plan fare baskı kabul gerekir. Farklı fare suşları LPS farklı duyarlılık var. Örneğin, indüklenen C3H/HeJ ve C57BL/10ScCr fareler için LPS dirençli endotoksemi21</sup…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

JHN İsviçre Ulusal Vakfı (SNSF 310030_146290) tarafından desteklenmektedir.

Materials

DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA K1081
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA 4368813
RNase-Free DNase Set, Qiagen, Hilden, Germany 79254
LPS Escherichia coli O111:B4 Invivogen, San Diego, CA, USA. tlrl-eblps
Omnican 50 Single-use insulin syringe B. Braun Melsungen, Melsungen, Germany 9151125
Bioanalyzer 2100 Agilent Technologie, Santa Clara, USA not applicable
Centrifuge 5430 Eppendorf, Hamburg, Germany not applicable
Centrifuge Mikro 220R Hettich, Kirchlengern, Germany not applicable
Dissection tools Aesculap, Tuttlingen, Germany not applicable
Fast-Prep-24 5G Sample Preparation System M.P. Biomedicals, Santa Ana, CA, USA not applicable
NanoDrop ND-1000 NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA not applicable
TRI Reagent Zymo Research, Irvine, CA, USA R2050-1

References

  1. Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
  2. Abreu, M. T., et al. Mutations in NOD2 are associated with fibrostenosing disease in patients with Crohn’s disease. Gastroenterology. 123, 679-688 (2002).
  3. Liu, Y., et al. Immunocytochemical evidence of Listeria, Escherichia coli, and Streptococcus antigens in Crohn’s disease. Gastroenterology. 108, 1396-1404 (1995).
  4. Schaffer, T., et al. Anti-Saccharomyces cerevisiae mannan antibodies (ASCA) of Crohn’s patients crossreact with mannan from other yeast strains, and murine ASCA IgM can be experimentally induced with Candida albicans. Inflamm Bowel Dis. 13, 1339-1346 (2007).
  5. Sellon, R. K., et al. Resident enteric bacteria are necessary for development of spontaneous colitis and immune system activation in interleukin-10-deficient mice. Infect Immun. 66, 5224-5231 (1998).
  6. Gkouskou, K. K., Deligianni, C., Tsatsanis, C., Eliopoulos, A. G. The gut microbiota in mouse models of inflammatory bowel disease. Front Cell Infect Microbiol. 4, 28 (2014).
  7. Schaubeck, M., et al. Dysbiotic gut microbiota causes transmissible Crohn’s disease-like ileitis independent of failure in antimicrobial defence. Gut. 65, 225-237 (2016).
  8. Steinert, A., et al. The Stimulation of Macrophages with TLR Ligands Supports Increased IL-19 Expression in Inflammatory Bowel Disease Patients and in Colitis Models. J Immunol. 199, 2570-2584 (2017).
  9. Gabele, E., et al. DSS induced colitis increases portal LPS levels and enhances hepatic inflammation and fibrogenesis in experimental NASH. J Hepatol. 55, 1391-1399 (2011).
  10. Saunders, S. P., et al. C-type lectin SIGN-R1 has a role in experimental colitis and responsiveness to lipopolysaccharide. J Immunol. 184, 2627-2637 (2010).
  11. Spadoni, I., et al. A gut-vascular barrier controls the systemic dissemination of bacteria. Science. 350, 830-834 (2015).
  12. Balmer, M. L., et al. The liver may act as a firewall mediating mutualism between the host and its gut commensal microbiota. Sci Transl Med. 6, 237ra266 (2014).
  13. Maier, R. V., Mathison, J. C., Ulevitch, R. J. Interactions of bacterial lipopolysaccharides with tissue macrophages and plasma lipoproteins. Prog Clin Biol Res. 62, 133-155 (1981).
  14. Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42, 145-151 (2008).
  15. Deng, M., et al. Lipopolysaccharide clearance, bacterial clearance, and systemic inflammatory responses are regulated by cell type-specific functions of TLR4 during sepsis. J Immunol. 190, 5152-5160 (2013).
  16. Kagan, J. C., et al. TRAM couples endocytosis of Toll-like receptor 4 to the induction of interferon-beta. Nat Immunol. 9, 361-368 (2008).
  17. Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124, 783-801 (2006).
  18. Cohen, J. The immunopathogenesis of sepsis. Nature. 420, 885-891 (2002).
  19. Suffredini, A. F., et al. Effects of recombinant dimeric TNF receptor on human inflammatory responses following intravenous endotoxin administration. J Immunol. 155, 5038-5045 (1995).
  20. Fink, M. P. Animal models of sepsis. Virulence. 5, 143-153 (2014).
  21. Poltorak, A., et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science. 282, 2085-2088 (1998).
  22. Hoshino, K., et al. Cutting edge: Toll-like receptor 4 (TLR4)-deficient mice are hyporesponsive to lipopolysaccharide: evidence for TLR4 as the Lps gene product. J Immunol. 162, 3749-3752 (1999).
  23. Corral, J., et al. Role of lipopolysaccharide and cecal ligation and puncture on blood coagulation and inflammation in sensitive and resistant mice models. Am J Pathol. 166, 1089-1098 (2005).
  24. Shrum, B., et al. A robust scoring system to evaluate sepsis severity in an animal model. BMC Res Notes. 7, 233 (2014).
  25. Brandwein, S. L., et al. Spontaneously colitic C3H/HeJBir mice demonstrate selective antibody reactivity to antigens of the enteric bacterial flora. J Immunol. 159, 44-52 (1997).
  26. Macpherson, A. J., McCoy, K. D. Standardised animal models of host microbial mutualism. Mucosal Immunol. 8, 476-486 (2015).
  27. Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. Of Mice, Dirty Mice, and Men: Using Mice To Understand Human Immunology. J Immunol. 199, 383-388 (2017).
  28. Wirtz, S., et al. Protection from lethal septic peritonitis by neutralizing the biological function of interleukin 27. J Exp Med. 203, 1875-1881 (2006).

Play Video

Citer Cet Article
Radulovic, K., Mak’Anyengo, R., Kaya, B., Steinert, A., Niess, J. H. Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach. J. Vis. Exp. (135), e57610, doi:10.3791/57610 (2018).

View Video