Iniezioni di Lipopolysaccharide in topi per simulare l'ingresso di prodotti microbici derivati dopo la violazione della barriera intestinale

L’intestino umano è colonizzato con un grande consorzio di microrganismi che forma il microbiota, che ha sviluppato un rapporto di reciproco beneficio con l’host durante l’evoluzione. In questo rapporto, l’host fornisce una nicchia sicura per il microbiota, considerando che il microbiota fornisce vitamine, digestione dei nutrienti e protezione dagli agenti patogeni per l’host, dove il microbiota si trova¹. Quando questo rapporto vantaggioso tra l’host e il microbiota è disturbato, possono sviluppare malattie, come la malattia infiammatoria intestinale (IBD). IBD è una malattia infiammatoria cronica multifattoriale dell’intestino causata da fattori genetici e ambientali che si presentano in due forme principali, (CD) la malattia di Crohn e colite ulcerosa (UC). Nonostante le similitudini tra le due forme IBD, sono caratterizzati da alcune differenze nella posizione e nella natura delle modificazioni infiammatorie. CD è un disordine infiammatorio di ricaduta transmurale che potenzialmente possa estendere a qualsiasi parte del tratto gastrointestinale, mentre UC è non transmurale ed è limitato ai due punti. Inoltre, mutazioni in proteine Nucleotide-binding dominio contenenti oligomerizzazione 2 (NOD2), un recettore di riconoscimento di pattern (PRR) che riconosce muramil dipeptide (MDP), un componente della parete cellulare dei batteri Gram-positivi più e – negativi, è associata al CD². Inoltre, Escherichia coli (Escherichia coli), Listeria e streptococchi e i loro prodotti sono stati tutti trovati all’interno dei macrofagi nei pazienti del CD che sono entrati nell’host dopo una barriera violazione³. Quando i batteri o loro prodotti immettono l’host durante lo sviluppo del CD, il sistema immunitario sviluppa una risposta che porta alla produzione di anticorpi anti-batterica⁴di circolazione. Forse, la prova più convincente per il ruolo del microbiota nella patogenesi delle IBD deriva da modelli murini. Quando gli animali sono trattati con antibiotici, o topi siano tenuti in germe-free (GF), la gravità della malattia è ridotta nella maggior parte dei modelli di colite, come in IL-10-/-topi che non sviluppano colite in GF strutture^5,6. Inoltre, colite disturba anche la composizione del microbiota, che è caratterizzata da una composizione squilibrata e ridotto ricchezza chiamato disbiosi⁷. La conseguenza di IBD può essere un aumento della permeabilità intestinale che può portare all’ingresso di microbi e di prodotti derivati dal microbica nell’ospite.

Negli animali, l’applicazione di Destrano solfato di sodio (DSS) induce una violazione epiteliale intestinale che conduce a un aumento della permeabilità della barriera epiteliale⁸. Portale LPS le concentrazioni sono elevate in animali con DSS colite⁹. Interessante, gli animali carenti C tipo lectina recettore adesione intracellulare specifica molecola-3 afferrando nonintegrin 1 omologo-correlate (segno-R1) sono protetti da colite DSS e LPS indotta endotossiemia¹⁰. Per diffondere ulteriormente nell’ospite, batteri o batteri derivati prodotti devono superare la barriera vascolare¹¹, cavità peritoneale, in cui si trova il piccolo e grande intestino, linfonodi mesenterici e/o il fegato¹². Per ridurre la complessità di questo sistema, è stato usato un composto derivato batterico definito. LPS, che provoca endotossiemia dopo intraperitoneale (i.p.) o endovenosa (i.v.) iniezione¹³ è stato iniettato in topi, per studiare l’espressione delle interleuchine Il6 e Ilb e la citochina Tnfa in risposta ai LPS.

LPS è un pattern molecolare associati (PAMP) espresso come un componente della parete cellulare dei batteri gram-negativi, che consiste del lipide A (i PAMP principale nella struttura di LPS), un oligosaccaride di core e un O lato catena¹⁴. Recettore Toll-like 4 (TLR4) espresse da cellule dendritiche, macrofagi e cellule epiteliali riconosce LPS¹⁵, che richiede Co-recettori per associazione appropriata. La fase acuta LPS-proteina (LBP) si lega LPS per formare un complesso che trasferisce LPS al cluster di differenziazione 14 (CD14), una proteina di membrana ancorate glicosilfosfatidilinositolo. CD14 ulteriormente navette LPS per l’antigene del linfocita 96 o anche conosciuto come MD-2, che è associato con il dominio extracellulare di TLR4. L’associazione del LPS a MD-2 facilita la dimerizzazione di TLR4/MD-2 per indurre cambiamenti conformazionali di reclutare molecole intracellulari adattatore per attivare l’a valle segnalazione sentiero¹⁴, che comprende il primario di differenziazione mieloide gene di risposta 88 (MyD88) – via del dipendente e il TIR dominio contenenti adattatore-induzione dell’interferone-β (TRIF) – via dipendente¹⁶. Il riconoscimento dei LPS di TLR4 quindi attiva il pathway di NF-κB e induce l’espressione di citochine proinfiammatorie, come TNFα, IL-6 e IL-1 β¹⁷.

In particolare, quando LPS è iniettato in animali, la concentrazione di LPS dato agli animali, il background genetico dell’animale e la dieta deve essere considerato. Alte concentrazioni di LPS conduce ad uno shock settico, caratterizzato da ipotensione e guasti multipli dell’organo e infine a morte¹⁸. I topi sono meno sensibili ai LPS rispetto agli esseri umani, dove le concentrazioni di LPS tra 2-4 ng/kg di peso corporeo (BW) sono in grado di indurre una tempesta di citochina¹⁹. Per topi, la dose letale (LD50), che induce la morte in metà dei campi di topi da 10-25 mg/kg BW²⁰ a seconda del ceppo del mouse utilizzato. Per i ceppi comunemente usati del mouse, C57Bl/6 e BALB/c, la dose letale 50% (LD50) è di 10 mg/kg di peso corporeo. Al contrario, i ceppi C3H/HeJ e C57BL/10ScCr sono protetti da LPS indotto endotossiemia, che è dovuta a mutazioni di Tlr4²¹. Di conseguenza, topi carenti di Tlr4 sono iporeattivo per iniezioni con LPS²². Altre linee di topi geneticamente modificati per, ad esempio topi PARP1-/-²³ sono resistenti a scossa tossica indotta da LPS.

Il modello del mouse descritto qui utilizza una dose subletale di LPS somministrato per via sistemica per simulare le conseguenze della diffusione di LPS dopo la violazione della barriera delle superfici del corpo. La concentrazione di LPS selezionata (2 mg/kg BW) non ha indotto mortalità in topi C56Bl/6, ma il rilascio indotto delle citochine pro-infiammatorie.