单细胞基因组测序的超高通量微流控平台

1. 微流控器件制造 使用计算机辅助设计 (CAD) 软件准备微流控掩模设计 (如下所规定)。DWG;请参阅辅助文件)。在电路板胶片上有10µm 分辨率的供应商打印这些设计。注: 对于多层微流控设备, 相应的掩码包含对齐标记。 对于每个设备, 按如下方式制造 SU-8 主模具 (图 1A)。 将约1毫升的 SU-8 3025 光刻胶倒入晶片中心, 制备3英寸直径的硅片。使用吸力, 在旋转涂布机卡盘上保护晶片。 有关每个设备的层厚度和旋转速度的列表, 请参见表 1 。为所有设备, 开始自旋涂层与三十年代在 500 rpm, 跟随三十年代在被表明的速度。 将 SU-8-silicon 晶片从自旋涂布机上取出, 并将其软烘烤到135°c 30 分钟. 允许晶片在烘烤后冷却到室温。 在准直190兆瓦, 365 nm 紫外线 LED 下, 用适当的微流控膜暴露 SU-8-silicon 晶片3分钟。 曝光后, 硬烘烤硅片上的热板设置为135°c 1 分钟。在这个烘烤步骤之后, 让晶片冷却到室温。 对于单层微流控设备, 跳到步骤1.2.7。对于多层微流控设备, 对光刻胶的第二层重复步骤 1.2.1 1.2.5 (图 1B)。 继第一次硬烘烤的单一层设备 (或第二个硬烘烤的多层设备), 通过浸泡到丙烯乙二醇单甲醚醋酸酯 (PGMEA) 浴30分钟, 开发该晶片。 晶片开发后, 使用含有 PGMEA 的喷瓶冲洗晶片。然后用含有异丙醇的喷瓶冲洗晶片, 然后将其放在135摄氏度的热板上, 使其干燥1分钟。 将晶片 (从今以后称为主) 放入一个培养皿中, 用于烷。 在步骤1.2 中编写的主控形状中, 继续使用由一个。 通过将硅基与固化剂结合在一起, 以质量11:1 的比例, 制备出其。用搅拌棒混合硅胶底座和固化剂。 将其放入脱气室并应用真空。允许在气泡不再可见 (通常为30分钟) 的情况下, 将其加在一起。 仔细地将脱气在母版上倒入, 到最后一层的5毫米厚. 再加一次, 以确保清除任何气泡。 脱气后, 在80°c 烘烤, 并在80分钟的主。 用剃刀刀片小心地从烤师傅身上切下固化后的板坯。确保所有的切割都在硅片的顶端。注: 硅晶片上的任何切口都可能导致唇部防止均匀粘合。 使用0.75 毫米活检拳打进入口和插座。使用设备的功能端上的包装胶带去除任何灰尘和杂散光。 在等离子处理设备之前, 用异丙醇清洗50毫米 x 75 毫米的玻璃滑块, 并烘干。 对于等离子处理, 将该板和玻璃滑入等离子焊机中, 其特点是面朝上。使用1毫巴 O2等离子进行等离子处理1分钟. 将该设备与玻璃滑块结合, 将暴露的或正面的一面放在一起。 在等离子处理后, 将设备烘烤80摄氏度, 40 分钟。 最后, 将玻璃表面处理液注入其中一个入口, 使微流控通道疏水性。确保所有通道完全被溶液淹没, 并对每个 dropmaker 重复注入。烘烤处理后的设备在80°c 10 分钟, 以蒸发过剩的溶剂。 2. 琼脂糖微中细胞的封装 注意: 请参阅图 2A。 在1x 三 EDTA (TE) 缓冲器中制备1毫升的3% 瓦特/v 低熔点温度琼脂糖。将琼脂糖溶液保持在90摄氏度的热量块上, 直到注射器加载前立即。 准备细胞悬浮。注: 该协议及其相关的微流控装置已被证实与细菌细胞, 无论是从冷冻库存或新鲜的准备工作。哺乳动物细胞, 根据细胞类型, 可能需要调整微流控通道尺寸, 以适应较大的细胞大小。 并用重悬1毫升磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS) 中的细胞。 计算 hemocytometer 中的单元格或按流排序。对于25µm 微, 目标细胞封装率为 1, 10, 在最终浓度为 2.4 x 107细胞/毫升时, 准备1毫升的细胞悬浮。 旋转细胞向下 3000 x g 3 分钟, 吸入上清和并用重悬的细胞颗粒在1毫升17% 伏/v 密度梯度介质 (参见材料表) 在 PBS。把它放在冰上直到注射器装上。 载入含氟油 (HFE) 的3毫升注射器, 含有2% 瓦特/w perfluoropolyether 聚乙二醇 (PFPE PEG) 表面活性剂, 适合它与27克针, 并将其放入注射器泵。注: 适合所有注射器与27克针的微流控步骤在本议定书。为了减少意外刺伤的风险, 请将所有针头上的瓶盖保持在泵操作开始之前。 将细胞悬浮液和熔融琼脂糖装入1毫升注射器中, 同时配合27口径针头, 并将其放入注射器泵中。 保持琼脂糖注射器和泵温暖的小空间加热器, 以防止琼脂糖凝胶在注射器和进口油管。将空间加热器设置为高, 并将其放置, 使加热表面离注射器大约10厘米。确保在注射器上测量的温度约为80摄氏度。注: 建议使用者在建议的距离内保持加热器, 以减少设备损坏的风险, 包括油管的熔化。 使用共流 dropmaking 设备生成25µm 微凝胶体滴。注: 有关指示试剂入口和出口位置的设备示意图, 请参见图 3A 。 使用聚乙烯 (PE) 油管将注射器针与微流控装置入口连接。在将管子插入设备之前, 先将泵从线上取出。 连接一条油管到出口, 并将自由端放在15毫升收集管。 使用以下 (推荐) 流速为 dropmaking: 800 µL/小时为 HFE 2% w/w PFPE PEG;200µL/小时的细胞悬浮在 PBS;和200µL/小时为3% 瓦特/v 琼脂糖。 dropmaking 后, 将收集管放置在4°c 30 分钟, 以确保琼脂糖的完全凝胶。 3. 打破和洗涤琼脂糖微 使用装有20克针的3毫升注射器从收集管中取出较低的油层, 注意不要扰乱琼脂糖滴的顶层。 用 perfluorooctanol (PFO) 打破乳液。 添加1毫升的10% 伏/五 PFO 在 HFE 的琼脂糖滴。吸管这个解决方案上下1分钟, 彻底涂上乳液。注意: 对于所有的微凝胶体洗涤步骤, 吸管的解决方案与1000µL 提示。微凝胶体悬浮液在吹打后应出现均匀且无团簇。 旋转圆锥管在 2000 x g 1 分钟收集琼脂糖微。PFO/HFE 上清液;微现在没有其表面活性剂层, 将会显得清晰。 用正己烷的表面活性剂洗涤微。注意: 己烷是一种挥发性有机溶剂, 在步骤3.3 中的洗涤应在通风罩中进行。 加入2毫升的1% 伏/五山梨油酸酯非离子表面活性剂 (见材料表) 在己烷到琼脂糖微。吸管上下10x 混合, 确保微凝胶体颗粒完全破碎。 旋转管在 1000 x g 1 分钟收集微。吸入上清液去除表面活性剂/己烷溶液。 重复表面活性剂/己烷洗涤。 清洗水中的微, 去除任何残留的有机溶剂。 添加5毫升的春节缓冲 [0.1% 辛基醚非离子洗涤剂 (见材料表), 在 1x TE] 到锥形管。吸管上下10x 混合。 旋转圆锥管在 2000 x g 2 分钟收集微。吸入上清液以除去春节缓冲。 重复春节洗涤2x。 将5毫升 1x TE 缓冲器添加到锥形管中。吸管上下10x 混合。 旋转圆锥管在 2000 x g 2 分钟收集微。吸入上清, 取出 TE 缓冲器。 重复一下特勤洗。 通过将10µL 整除凝胶与1x 核酸染色 (见材料表) 进行染色, 以400X 放大率验证微下的细胞封装。注: 微将在透明通道下清晰显示, 而细胞 DNA 将在 GFP 通道下荧光 (497/520 纳米激发/发射波长)。透明和荧光通道的叠加将显示微中的单元格, 如图 4A所示。 4. 通过裂解酶裂解琼脂糖中的细胞 用800µL 的 TE 缓冲器 (1x) 制备1毫升的裂解酶鸡尾酒, 2 µL 酵母裂解酶 (5 u/µL 库存, 10 u/毫升最终), 30 µL dithiothreitol (1 米股票, 30 毫米最后), 60 毫克溶菌酶 (冻干粉), 15 µL EDTA (0.5 米库存, 7.5 毫米决赛), 2 µL mutanolysin (100 u/µL 股票, 200 U/毫升最后), 2 µL 溶葡萄球菌酶 (10 u/µL 股票, 20 u/毫升最后) 和30µL 氯化钠 (1 M 股票, 30 毫米决赛)。 添加额外的 TE, 使体积为1毫升。用涡流混合解决方案。 将溶解酶溶液的整个1毫升加入不超过1毫升的洗涤微。混合吹打10x。在一个振动筛中孵育37摄氏度 > 2 小时的混合物 (最大为隔夜孵化)。 5. 基于洗涤剂的微凝胶体处理 通过溶解酶的溶解 (步骤 4), 洗涤微。 将微在 2000 x g 处旋转2分钟, 然后吸入上清。由于颗粒中分散的细胞碎片, 水滴会出现不透明的白色。 并用重悬微在5毫升10毫米的三盐酸缓冲器和吸管上下10x 混合。 将混合物向下旋转 2000 x 克, 2 分钟, 然后取出上清。 对微进行洗涤剂处理。 并用重悬的凝胶在一锂硫酸酯 (盖子) 裂解缓冲 (0.5% 瓦特/v 盖子在20毫米三 HCl) 和60µL 0.5 米 EDTA 到最后容量3毫升。 添加5µL 蛋白酶 K 酶 (800 U/毫升的股票)。吸管向上和向下的10x 混合, 然后孵化的混合物在42°c 在一个热块1小时溶解细胞膜和消化蛋白质。 经过洗涤剂处理后, 清洗微。 旋转圆锥管与微下来在 2000 x g 2 分钟. 取出上清。 用10毫升2% 伏/五吐温20的水冲洗微。吸管上下10x 混合。 旋转圆锥管在 2000 x g 2 分钟, 然后取出上清的愿望。 用10毫升100% 乙醇清洗微, 使残留酶失效。吸管上下10x 混合。 旋转圆锥管在 2000 x g 2 分钟, 然后取出上清的愿望。 用10毫升0.02% 伏/五吐温20的水冲洗微。吸管上下10x 混合。 旋转圆锥管在 2000 x g 2 分钟, 然后取出上清的愿望。 重复吐温20洗3x。在最后一次清洗前, 通过100µm 细胞过滤器将溶液移除, 以除去任何大团簇。 并用重悬微5毫升的10毫米三盐酸缓冲液, 以防止 DNA 降解。在 tagmentation (步骤 7) 之前, 微可存储在摄氏4摄氏度至1周。 6. 用数字 PCR 法生成条码滴 在低绑定管中的 1x TE 缓冲器中, 准备 500 pM 的条形底漆 (表 2) 的库存。在每次使用之前, 将底漆稀释为下午1点的工作库存, 并将其加热到70摄氏度, 在散热块上1分钟。 用75µL 的高保真热启动主组合制备 150-µL PCR 反应组合 (请参阅材料表) (2x), 42 µL PCR 级水, 3 µL DNA_BAR 底漆 (10 µM 库存, 0.2 µM 最后), µL 底漆 3 P7_BAR (10 µM 库存, 0.2 µM 决赛), 6 µL 条码稀释 (下午1点股票, 40 fM 决赛), 6 µL 吐温 20 (50% v/v 股票, 2% 决赛) 和15µL 的 PEG 6k (50% 瓦特/v 股票, 5% 决赛)。混合吹打上下10x。 将200µL 的 HFE 油放入注射器中, 用针将其 HFE。将 PE 油管的一部分连接到针上, 并将该线固定在手上。将 pe 油管的末端插入目标溶液中, 并小心地将 PCR 组合的所有150µL 到 PE 油管和注射器中。把注射器装进注射器泵里。 载入含氟油 (HFE) 的1毫升注射器, 含有 2% w/w perfluoropolyether 聚乙二醇 (PFPE PEG) 表面活性剂, 将其与针配合使用, 并将其放入注射器泵中。 使用共流 dropmaking 设备生成25µm 条码滴。注: 有关指示试剂入口和出口位置的设备示意图, 请参见图 3A 。 将 co 流 dropmaker 设备的单元格入口插入一小块铅焊料。 使用 PE 油管的熔融琼脂糖入口将装有 HFE 和 PCR 混合的注射器连接到微流控装置入口。在将管子插入设备之前, 先将泵从线上取出。 连接一条油管到出口, 并将自由端放在0.2 毫升 PCR 管。使用以下 (推荐) 流速为 dropmaking: 600 µL/小时为 HFE 2% w/w PFPE PEG 和200µL/小时为 PCR 组合。将滴入 PCR 管中, 每管大约有50µL 滴。 dropmaking 后, 小心地从乳液中取出 HFE 油的下部, 使用凝胶加载吸管小贴士, 并用含有 5% w/w PFPE PEG 表面活性剂的 FC-40 含氟油代替。热循环以以下协议:98 °c 为3分钟, 40x (98 °c 为十年代, 62 °c 为二十年代, 72 °c 为二十年代), 72 °c 为5分钟, 然后举行在12°c。注: 热循环液滴可以储存在4摄氏度, 可达1天。 验证条码放大和封装速率。 用2% 瓦特/w PFPE-PEG 表面活性剂, 在 HFE 上制备1x 核酸染色 (参见材料表);这种污渍在 HFE 中略有混溶, 将与水滴中的 DNA 结合。 将1µL 热循环条码乳液添加到10µL 的染色油中。在室温下孵化5分钟。 图像滴通过荧光显微镜 (GFP 通道, 497/520 nm 激发/发射波长) 在200X 放大和计数条码封装率。请注意, 信号将是离散的: 包含放大的条形码的水滴将荧光明亮, 而空的下落将显示黑暗 (图 4B)。 7. Tagmentation 基因组 DNA 在液滴中的提取 注意: 请参阅图 2B。 使用来自下一代测序库准备工具包的试剂准备500µL tagmentation 溶液 (请参见材料表)。使用7µL tagmentation 酶, 250 µL tagmentation 缓冲器, 243 µL 的 PCR 级水。混合涡流和旋转的混合物下来收集。将这个溶液装入一个 HFE 油支持的1毫升注射器中, 然后用针装入它。 准备回灌的微。 在 2000 x g 处旋转微凝胶体管2分钟, 并吸入上清。将200µL 的凝胶转移到 HFE 支持的注射器的顶端, 用凝胶加载吸管尖端, 用一小片胶带封住喷嘴。 使用 3 d 打印的离心机适配器 (请参阅补充文件 1和2), 在 3000 x g 处旋转微凝胶体注射器3分钟。 使用凝胶加载吸管尖端从注射器中取出液上清。把微凝胶体层推到注射器喷嘴的底座上。用针装注射器。 载入含氟油 (HFE) 的3毫升注射器, 含有 2% w/w perfluoropolyether 聚乙二醇 (PFPE PEG) 表面活性剂, 将其与针配合使用, 并将其放入注射器泵中。 将微重新封装成含有 tagmentation 试剂的水滴。注: 有关指示试剂入口和出口位置的设备示意图, 请参见图 3B 。 使用 PE 油管将含有 HFE、tagmentation 混合器和微的注射器连接到微流控装置入口。在将管子插入设备之前, 先将泵从线上取出。 连接一条油管到出口, 并将自由端放在一个空的1毫升注射器与活塞绘制到1毫升线。 使用以下 (推荐) 流速为 dropmaking: 2000 µL/小时为 HFE 2% w/w PFPE PEG, 200 µL/小时为微和500µL/小时为 tagmentation 组合。 用400X 放大倍数验证光镜下的微凝胶体封装速率。大约 80-90% 的水滴应该包含一个微凝胶体,如图4C 所示。 将含有 tagmentation 乳液的注射器装入针头, 并将其直立在热块或烤箱中1小时, 在55摄氏度处将基因组 DNA 碎片分解。 8. 单细胞条形码微流控双合并 注意: 请参阅图 2C。 为合并准备条码滴, 用 HFE 2% w/w PFPE PEG 代替 FC-40 油馏分。把这些水滴小心地转移到1毫升的注射器里, 用针把它装上, 放进注射器泵里。 将孵化和 tagmented 微凝胶体滴注射器装入注射器泵中。 准备500µL 的 PCR 组合。按照以下顺序添加试剂以防止沉淀形成: 140 µL PCR 级水, 10 µL P5_DNA 底漆 (10 µM 库存, 0.2 µM 最后), 10 µL P7_BAR 底漆 (10 µM 股票, 0.2 µM 最后), 50 µL 的 PEG 6k (50% 瓦特/v 库存, 5% 决赛), 50 µL 20 (50% v/v 股票, 5% 决赛), 250 µL Taq 大师组合 (2x) (参见材料表), 10 µL 等温聚合酶 (参见材料表) 和10µL 的中和缓冲器 (见材料表)。吹打上下10x 混合, 然后将混合物向下旋转以收集。将这个溶液装入一个 HFE 支持的1毫升注射器中, 将它与针头配合, 放入注射器泵中。 装载三3毫升含氟油 (HFE) 的注射器, 含有2% 瓦特/w perfluoropolyether 聚乙二醇 (PFPE PEG) 表面活性剂, 适合每个针头, 并将它们放入注射器泵中。 装载三1毫升注射器与2米氯化钠, 适合每个与针并且放在一边。 使用双合并装置将条码滴、tagmented 基因组液滴和 PCR 组合合并。注意: 请参阅图 5中的设备示意图, 指示试剂和电极入口和插座的位置。 将3氯化钠注射器连接到2电极入口和单护城河 inletusing PE 油管。对于电极, 手动对注射器施加压力, 直到电极完全充满盐溶液。填充电极后, 将手动压力应用到护城河注射器, 直到护城河填满。用一小块铅焊料堵住护城河的自由端。 将安装在泵上的 3 HFE 注射器连接到2个间隔油口和 dropmaking 油 inletusing 件 PE 油管。在将管子插入设备之前, 先将泵从线上取出。 连接 PCR 混合注射器, 微凝胶体滴注射器, 条形码滴注射器到他们各自的入口使用 PE 油管。在将所有液滴回注油管与抗静电枪连接到注射器针之前, 将其射出;抗静电处理降低了 PE 油管静电荷引起的液滴聚结风险。 将 PE 油管连接到出口, 并将游离端放在0.2 毫升的 PCR 管中。 使用鳄鱼夹子将电极注射器的针头连接到冷阴极荧光逆变器。将逆变器的直流电源设置为 2 v。 运行双合并设备的建议流量: 300 µL/小时的 tagmented 微凝胶体下降, 100 µL/小时的条码下降, 1500 µL/小时为 HFE 2% 瓦特/w PFPE PEG (dropmaking 油), 600 µL/小时的放大混合, 200 µL/小时 HFE 2% w/w PFPE-PEG (条形码间隔油), 和700µL/小时为 HFE 2% 瓦特/w PFPE-PEG (微凝胶体间隔油)。在每管中用大约50µL 的乳液将水滴收集到 PCR 管中。 在热循环之前, 小心地从乳液中取出较低层的 HFE 油, 使用凝胶加载吸管小贴士, 并用含有 5% w/w PFPE PEG 表面活性剂的 FC-40 氟化油代替。热循环以以下协议:65 °c 为5分钟, 95 °c 为2分钟, 30x (95 °c 为十五年代, 60 °c 为1分钟, 72 °c 为1分钟), 72 °c 为5分钟, 然后举行在12°c。 从热循环的水滴中恢复条形码 DNA。 将水滴放入离心管中, 用20µL 的 PFO 打破乳液。漩涡他们十年代混合。 旋转管在 1万 x g 1 分钟, 以分级混合物成水 (顶部) 和油 (底部) 阶段。用吸管小心地从管子上取下上层水层, 将其转移到新的离心管上。丢弃油相。 根据制造商的协议, 在自旋列中纯化条形码 PCR 产品, 并洗脱20µL 1x TE 缓冲器。 按照步骤9和10进行执行的排序和分析。 9. 图书馆的准备和排序 按照制造商的协议为碎片大小选择和量化, 准备单单元库进行排序。 将配对端库序列化为读1和读2的默认化学。使用自定义索引1底漆 I7_READ (表 2) 为 15 bp 索引读取, 对应于单单元条码。 10. 单细胞数据分析 注意: 定制 Python 脚本的质量控制和初步分析的 SiC 序列数据可以从 https://www.github.com/AbateLab/SiC-seq 下载。 运行脚本 “barcodeCleanup” 以执行条形码读取和导出单单元数据到 SQLite 数据库的质量控制。对于控件实验, 请将此脚本与 “-对齐” 标志集一起使用, 使读取与已知引用基因组对齐。 使用脚本 “纯度” 来分析条形码组 (用于控制实验) 的纯度, 并确认与图 6B一致的高纯度值。